諶賽男，王河山，曾靖舒，周也蒞，雷仙武，吳水生

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

鉤吻的指紋圖譜

諶賽男，王河山，曾靖舒，周也蒞，雷仙武，吳水生

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

鉤吻；指紋圖譜；高效液相色譜法

鉤吻Gelsemium elegans Benth.是馬錢科胡蔓藤屬植物，其主要化學(xué)成分為吲哚類生物堿［1］，目前多采用鉤吻素子和鉤吻素甲作為藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)［2-3］，不能完全反映藥材中其它成分的情況。指紋圖譜是評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的有效方法，我們對(duì)16批不同產(chǎn)地的鉤吻藥材進(jìn)行考察，以建立鉤吻的HPLC指紋圖譜，為鉤吻的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器Agilent Technologies 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Agilent Chem Station工作站、CPA225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；KQ-500E型臺(tái)式超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DFY－500型中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；Milli－Q超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2試藥鉤吻素子、胡蔓藤堿乙對(duì)照品（北京市賽百草科技有限公司）；甲醇、乙腈（德國Merck公司，色譜純）；甲酸（阿拉丁試劑上海有限公司，色譜純）；其它試劑為分析純。

1.3藥材16批鉤吻樣品產(chǎn)地信息見表1。經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為馬錢科胡蔓藤植物鉤吻Gelsemium elegans Benth.的干燥根莖。不同產(chǎn)地鉤吻曬干，粉碎，過40目篩，備用。

表1　鉤吻樣品產(chǎn)地

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP Analytical柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），按表2進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

表2　梯度洗脫條件%

2.2對(duì)照品溶液制備稱取鉤吻素子對(duì)照品11.60 mg、胡蔓藤堿乙10.10 mg，分別置于50 mL瓶中，用50%甲醇稀釋到刻度，搖勻，得到232、202μg／mL的混合對(duì)照品貯備液。吸取混合對(duì)照品貯備液200 μL至5 mL瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為9.28、8.08μg／mL的鉤吻素子、胡蔓藤堿乙的混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液制備稱取鉤吻粉末0.2 g，過40目篩，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇水（含0.1%甲酸）25 mL，密塞，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇水（含0.1%甲酸）補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗(yàn)取同一批次鉤吻樣品（S16），按2.1項(xiàng)色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次檢測(cè)，以胡蔓藤堿乙（11號(hào)峰）為基準(zhǔn)峰計(jì)算各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.18%，相對(duì)峰面積RSD＜2.54%，表明儀器精密度良好。

2.4.2重復(fù)性試驗(yàn)取產(chǎn)地S16鉤吻樣品6份，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，以11號(hào)峰為基準(zhǔn)峰計(jì)算各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.13%，相對(duì)峰面積RSD＜3.11%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液（S16）于0、2、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以11號(hào)峰為基準(zhǔn)峰計(jì)算共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.21%，相對(duì)峰面積RSD＜3.15%，表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.5指紋圖譜的建立根據(jù)2.1項(xiàng)色譜條件，對(duì)16批鉤吻樣品進(jìn)行檢測(cè)，將測(cè)定數(shù)據(jù)導(dǎo)入中國藥典委員會(huì)推薦使用的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2004A），設(shè)定S16色譜圖為參照?qǐng)D譜，利用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度設(shè)置0.2，多點(diǎn)校正后進(jìn)行峰自動(dòng)匹配，計(jì)算生成對(duì)照譜圖，生成的對(duì)照?qǐng)D譜和峰自動(dòng)匹配后的HPLC指紋圖譜見圖1。

比較各樣品色譜圖，標(biāo)定了17個(gè)共有峰，以11號(hào)峰為基準(zhǔn)峰，計(jì)算各樣品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表2、表3。共有峰面積占所有峰面積的百分比為75.43%～89.77%。16批樣品相似度計(jì)算結(jié)果見表4。

表2　16批鉤吻藥材的HPLC指紋圖譜中共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3　16批鉤吻藥材的HPLC指紋圖譜中共有峰相對(duì)峰面積

表4　16批鉤吻藥材相似度比較

3　討論

3.1對(duì)照品胡蔓藤堿乙較鉤吻素子的保留時(shí)間和峰面積均適中，樣品分離良好，故選擇胡蔓藤堿乙作為基準(zhǔn)峰。

3.2確定了鉤吻的17個(gè)共有色譜峰，共有色譜峰面積大于總面積的75.43%。16批藥材的指紋圖譜相似度除S8、S11外，均在0.9～1，說明不同產(chǎn)地的鉤吻其內(nèi)在化學(xué)成分有一定的差異性。

3.3本研究首次標(biāo)定17個(gè)共有峰鉤吻的HPLC指紋圖譜，操作簡(jiǎn)單，分析時(shí)間較短，方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性較好，可用于鉤吻的質(zhì)量控制。

［1］趙慶春，華威，付艷輝.胡蔓藤中非生物堿類成分的分離與鑒定：III［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27（7）：551-554.

［2］栗建明，馮時(shí)茵，何華紅，等.單一內(nèi)標(biāo)多控法同步測(cè)定鉤吻中鉤吻堿甲和鉤吻素子的含量［J］.中藥材，2013，36（10）：1626-1631.

［3］陳衛(wèi)琳，楊櫻，吳水生.閩產(chǎn)鉤吻根莖葉中鉤吻堿甲和鉤吻素子及葫蔓藤堿甲的含量測(cè)定［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，21（5）：48-50.

R285.5

B

1000-338X（2016）05-0028-03

2016-07-07

福建省自然科學(xué)基金資助課題（2017J0106），高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助課題（20133519／110005），福建省教育廳資助課題（JA16154），福建中醫(yī)藥大學(xué)校管課題（2014146-學(xué)科）

諶賽男（1991—），女，2014級(jí)中藥學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

吳水生（1965—），男，教授。E-mail：wsstcm@yahoo.cn