陳達(dá)鑫，林珊，趙錦燕，孫志偉，洪振豐

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122）

·實(shí)驗(yàn)研究·

復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)酒精性肝病的抗炎作用

陳達(dá)鑫1，2，林珊1，2，趙錦燕1，2，孫志偉1，2，洪振豐1，2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122）

目的觀察復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)酒精性肝病模型大鼠的抗炎作用。方法60只SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽性藥對(duì)照組、肝寶低、中、高劑量組，每組10只，制作酒精性肝病大鼠模型，檢測(cè)血清TG、ALT、AST、TBiL、ALP、LDH、LDL-c，HDL-c的含量變化；Elisa檢測(cè)IL-1β、IL-4、IL-8、IL-10的表達(dá)，觀察肝臟組織的病理變化。結(jié)果模型組TG、ALT、AST、TBIL、ALP、LDH、LDL-c、IL-1β、IL-4、IL-8、IL-10活性較陽性對(duì)照組明顯上升（P＜0.05），HDL-c水平明顯下降（P＜0.01）。與模型組比較，肝寶3組的TG、ALT、AST、TBiL、ALP、LDH、IL-1β、IL-8活性明顯降低，HDL-c水平明顯上升（P＜0.05），IL-4含量下降，并存在量效關(guān)系，肝臟病理學(xué)觀察，復(fù)方片仔癀肝寶各劑量組和陽性對(duì)照組能有效改善大鼠肝臟的顏色及質(zhì)地。結(jié)論復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)酒精性肝病有一定的治療作用，其機(jī)制是降低炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。

酒精性肝??；復(fù)方片仔癀肝寶；抗炎作用。

酒精性肝病（alcoholie liver disease，ALD）是長(zhǎng)期大量飲酒引起的嚴(yán)重危害身體健康甚至威脅生命的消化系統(tǒng)疾病，包括酒精性脂肪肝、肝炎、肝硬化、肝癌等［1］。隨著我國(guó)酒精消費(fèi)量的增加，ALD在肝臟病的發(fā)病率和死亡率提高［2］，已成為繼病毒性肝病后的肝臟第2大致殘、致死疾?。?］。乙醇及其代謝產(chǎn)物直接或間接誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)和代謝紊亂是ALD發(fā)生的主要原因。復(fù)方片仔癀肝寶是一種中成藥制劑，由牛黃、三七、蛇膽、茵陳、龍膽草、梔子、白芍組成。前期研究［4-5］發(fā)現(xiàn)復(fù)方片仔癀肝寶有較好的保肝護(hù)肝作用，本實(shí)驗(yàn)以乙醇和高脂喂養(yǎng)制作慢性肝損傷大鼠模型，用復(fù)方片仔癀肝寶進(jìn)行干預(yù)治療，研究復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)慢性肝損傷的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物飼養(yǎng)條件SD大鼠60只，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g，許可證號(hào)：SCXK（滬）2008-0016，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境，溫度：20℃～24℃，濕度：40%～70%，風(fēng)速：0.1～0.2 fm／s，氣流：≥28次／min。

1.2藥物及試劑復(fù)方片仔癀肝寶（福建省片仔癀藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1409009）；IL-1β、IL-4、IL-8、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（上海拜沃生物科技有限公司）；無水乙醇，分析純（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）。

1.3儀器FA1104N電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16G低溫離心機(jī)（上海安亭科學(xué)器材公司）；Bayer ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀（德國(guó)西門子公司）；64R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Backman公司）；ELX808酶標(biāo)儀（德國(guó)寶特公司）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組、模型制備及給藥SPF級(jí)雄性大鼠60只，體質(zhì)量（180±10）g，10只作為正常對(duì)照組（空白組）飼養(yǎng)，為防止空白組在長(zhǎng)時(shí)間飼養(yǎng)后出現(xiàn)脂肪肝，依經(jīng)驗(yàn)每周給予2 d全粗糧飼料喂養(yǎng)。其余動(dòng)物進(jìn)行造模，以乙醇合高脂飼料干預(yù)，每日1次。造模前3天用15%乙醇0.7 mL／100 g進(jìn)行適應(yīng)性灌胃，第4天開始每日定時(shí)以30%乙醇0.7 mL／100 g灌胃。2周后，造模大鼠隨機(jī)分為5組：模型組、600 mg／kg水飛薊賓葡甲胺片陽性對(duì)照組（陽性對(duì)照組）、150 mg／kg肝寶組（肝寶低劑量組）、300mg／kg肝寶組（肝寶中劑量組）、600mg／kg肝寶組（肝寶高劑量組），每組10只，定時(shí)給藥，灌藥時(shí)間與灌乙醇時(shí)間間隔2 h，連續(xù)4周，空白組、陰性對(duì)照組灌胃等量的生理鹽水。第4周末次給藥24 h后，用3%戊巴比妥鈉60 mg／kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，分離血清，-20℃保存，用于血液生化指標(biāo)的測(cè)定，取肝臟右中央葉作病理學(xué)分析。

2.2生化分析取大鼠腹主動(dòng)脈血，2 000 r／min離心10 min，分離得到血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中TG、ALT、AST、TBiL、ALP、LDH、LDL-c、HDL-c活性。

2.3炎癥因子檢測(cè)按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒操作說明，檢測(cè)血清中IL-1β、IL-4、IL-8、IL-10含量。

2.4肝組織形態(tài)學(xué)觀察取全肝，拍照記錄，觀察肝組織形態(tài)改變。多聚甲醛固定肝右中央葉組織，制備石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理改變。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS 18.0軟件分析，多組均數(shù)間比較用單因素方差分析檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1一般行為狀態(tài)實(shí)驗(yàn)期間正常組大鼠精力充沛，靈活，飲食正常，毛色有光澤，尿液淺黃色。造模后，除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠的活動(dòng)明顯下降，飲水進(jìn)食明顯減少，毛色缺乏光澤，尿液深黃色。復(fù)方片仔癀肝寶組及陽性組較模型組稍好，尿色較模型組略淡。

3.2指標(biāo)測(cè)定見表1、表2。

表1　復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)血清TG、ALT、AST、TBiL、ALP、LDH、LDLD和HDLD的影響U／L

表2　復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)血清中炎癥因子含量的影響pg／mL

3.3病理組織學(xué)結(jié)果肉眼觀察正常對(duì)照組大鼠肝臟呈紅褐色，表面光滑，質(zhì)軟。模型組大鼠的肝臟腫大，呈白褐色，邊緣鈍，質(zhì)硬，表面有大量纖維滲出物，同時(shí)出現(xiàn)細(xì)小顆粒，淤血明顯。復(fù)方片仔癀肝寶各劑量組和陽性對(duì)照組有效改善大鼠肝臟的顏色及質(zhì)地，其中高劑量組變化明顯。光鏡下觀察6組大鼠肝臟病理組織學(xué)改變，正常對(duì)照組可見肝小葉輪廓清晰，小葉中央靜脈向四周呈放射狀排列，肝細(xì)胞排列尚整齊，細(xì)胞分界清，核圓，位于細(xì)胞中央，無脂肪變性。模型組可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝板排列紊亂，呈點(diǎn)、片狀壞死，肝細(xì)胞腫脹明顯，胞質(zhì)疏松，可見大小不等脂肪空泡，伴有脂滴融合將細(xì)胞核擠壓在細(xì)胞一側(cè)。肝寶治療組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡明顯減少，以中、小空泡為主，肝細(xì)胞體積減小，部分肝細(xì)胞形態(tài)趨于正常，見圖1。

4　討論

4.1長(zhǎng)期飲酒引起的酒精性脂肪肝，屬TG堆積的脂肪肝類型，會(huì)引起血液中TG升高。當(dāng)肝組織處于正常狀態(tài)時(shí)，肝細(xì)胞中的ALT、AST無明顯外漏，故血清中的ALT、AST屬于正常較低的水平。當(dāng)肝臟受到損害時(shí)，胞漿內(nèi)的ALT和AST向肝血竇溢出，并進(jìn)入周圍血流，血清ALT、AST活性增加，提示肝細(xì)胞破壞，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)及線粒體受到損傷［6－7］。模型組大鼠血清中TG、ALT、AST、TBiL、ALP、LDH、LDL-c水平明顯升高，HDL-c水平降低，表明模型大鼠肝損傷明顯。給予不同劑量復(fù)方片仔癀肝寶和陽性藥物干預(yù)后大鼠血清中TG、ALT、AST、TBiL、ALP、LDH和LDL-c活性不同程度地降低，HDLD升高，說明復(fù)方片仔癀肝寶片對(duì)酒精誘導(dǎo)所致大鼠慢性肝損傷起到了明顯的保肝降酶作用。

4.2乙醇進(jìn)入人體后可損傷小腸黏膜，使腸黏膜的通透性增大，腸源性的內(nèi)毒素入血增多。血液中的內(nèi)毒素可激活肝臟中的固有免疫細(xì)胞-Kupffer細(xì)胞，產(chǎn)生大量的炎癥因子，如IL-1β、IL-4和TNF-α，大量的炎癥因子可導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和凋亡［8］。受損的肝細(xì)胞釋放的IL-8會(huì)導(dǎo)致炎癥的持續(xù)發(fā)生，并刺激Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生更多的TNF-α，進(jìn)一步增加肝細(xì)胞凋亡［9］。IL-10是一種具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、免疫及非免疫活性的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，ALD時(shí)，IL-10通過抑制Kupffer細(xì)胞的活化，減少炎癥因子的產(chǎn)生，負(fù)向調(diào)控炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示復(fù)方片仔癀肝寶在不影響IL-10的前提下，能有效降低炎癥因子IL-1β、IL-4和IL-8，說明其在ALD的發(fā)生、發(fā)展全過程中，都起到了對(duì)抗、治療肝損傷的作用。

復(fù)方片仔癀肝寶能夠顯著改善ALD模型大鼠肝臟損傷程度，降低血清TG、ALT、AST、TBiL、ALP、LDH、LDL-c水平提高HDL-c水平，提示復(fù)方片仔癀肝寶對(duì)ALD有一定的抗炎作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控IL-1β、IL-4和IL-8等炎癥因子，推測(cè)其抗炎作用與通過抑制巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生和釋放炎癥因子，降低炎癥反應(yīng)強(qiáng)度有一定關(guān)系。

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R285.5

B

1000-338X（2016）05-0006-03

2016-07-06

福建省科技廳資助課題（2010YZ0001-1）

陳達(dá)鑫（1987—），男，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

洪振豐（1953—），男，教授。E-mail：zfhong1953@163.com