張海濤，殷麗華，柯希望，臺(tái)蓮梅，左豫虎

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江大慶163319）

綠豆葉斑病菌分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)條件研究

張海濤，殷麗華，柯希望，臺(tái)蓮梅，左豫虎

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江大慶163319）

為了明確綠豆葉斑病病原菌變灰尾孢菌（Cercospora canescens）分生孢子形成及萌發(fā)的最適條件，研究了變灰尾孢菌在9種供試培養(yǎng)基上，在不同培養(yǎng)條件下分生孢子的產(chǎn)生及分生孢子的萌發(fā)情況。結(jié)果表明，在高粱粒培養(yǎng)基上25℃，光暗交替條件下培養(yǎng)10天后即可產(chǎn)孢，培養(yǎng)14天后產(chǎn)孢量可達(dá)9×105個(gè)/mL，玉米粉培養(yǎng)基和小麥粒培養(yǎng)基產(chǎn)孢較少，其他培養(yǎng)基不產(chǎn)孢。分生孢子在25℃、pH 6～7、連續(xù)黑暗條件下無菌水中培養(yǎng)20 h后萌發(fā)率可達(dá)76.0%，不同溫度、不同光照處理間萌發(fā)率差異顯著。在蔗糖溶液和蛋白胨溶液中培養(yǎng)20 h后萌發(fā)率分別達(dá)87.0%和86.3%。變灰尾孢菌的最適產(chǎn)孢條件為高粱粒培養(yǎng)基上25℃光暗交替培養(yǎng)；分生孢子最適萌發(fā)條件為25℃、pH 6～7、連續(xù)黑暗培養(yǎng)，蔗糖和蛋白胨可適當(dāng)提高分生孢子的萌發(fā)率。

綠豆葉斑??；變灰尾孢菌；產(chǎn)孢量；產(chǎn)孢條件；萌發(fā)條件

0　引言

綠豆作為中國(guó)主要的雜豆作物，近年來在黑龍江省的種植面積逐年增加，但因相對(duì)落后的生產(chǎn)技術(shù)及較為粗放的管理方式，近年來綠豆病害問題呈逐年加重的趨勢(shì)。由變灰尾孢菌（Cercospora canescens）引起的綠豆葉斑病，又稱紅斑病，是中國(guó)及亞洲綠豆生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的病害之一［1］。在中國(guó)安徽、河南、河北、陜西等省發(fā)病較重［2］。綠豆葉斑病以開花結(jié)莢期危害最重，病情嚴(yán)重時(shí)，病斑融合成片，造成葉片干枯，嚴(yán)重影響綠豆的產(chǎn)量，輕者減產(chǎn)20%～50%，嚴(yán)重的可減產(chǎn)90%以上。

尾孢菌屬的絕大多數(shù)種在正常培養(yǎng)時(shí)不產(chǎn)生分生孢子，例如，要獲得引起大豆紫斑病的菊池尾孢（Cercospora kikuchii Mats.&Tomoy）的大量分生孢子，需用高粱米做培養(yǎng)基，在溫箱內(nèi)黑白燈照射處理才能獲得［3］。薛其勤等［4］發(fā)現(xiàn)花生褐斑病菌也較難產(chǎn)孢，病菌被黑光燈照射培養(yǎng)20天后的產(chǎn)孢量?jī)H能達(dá)到1.80× 103個(gè)/mL。楊建清等［5］測(cè)定煙草疫霉4天就可產(chǎn)生大量游動(dòng)孢子，庒義慶等［6］研究發(fā)現(xiàn)蕉斑鐮刀菌3天后就有大量的分生孢子產(chǎn)生。但尾孢菌與其他真菌不同，其產(chǎn)孢時(shí)間較長(zhǎng)，而長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)容易造成污染，影響后續(xù)試驗(yàn)的順利進(jìn)行。因此，對(duì)綠豆葉斑病菌的最適產(chǎn)孢培養(yǎng)基、產(chǎn)孢條件及分生孢子萌發(fā)條件的研究，是快速獲得大量病菌分生孢子的重要前期基礎(chǔ)，對(duì)深入開展綠豆-變灰尾孢菌互作的相關(guān)研究有非常重要的科學(xué)意義。

國(guó)內(nèi)外對(duì)該病的研究報(bào)道較少，多數(shù)報(bào)道與該病害的田間防治有關(guān)，1989年郭繼紅等［7］的研究表明，滅病威對(duì)綠豆葉斑病的防治效果顯著。2012年邢寶龍［8］認(rèn)為藥劑防治應(yīng)選用25%嘧菌酯懸浮劑500倍液浸種2 h+25%嘧菌酯懸浮劑600倍液噴霧進(jìn)行防治。在病原菌分離與鑒定方面也有相關(guān)的研究報(bào)道，1987年李怡琳等［2］對(duì)綠豆葉斑病的病原菌進(jìn)行了分離和鑒定，從形態(tài)學(xué)上確定了其病原菌為變灰尾孢菌（Cercospora canescens）。2015年劉昌艷等［9］對(duì)綠豆葉斑病菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子特征鑒定，從分子角度確定綠豆葉斑病的病原為變灰尾孢菌。2014年金玉曉等［10］對(duì)采集的綠豆葉斑病病葉進(jìn)行了病原菌分離、鑒定及其菌絲生長(zhǎng)特性的研究，發(fā)現(xiàn)變灰尾孢菌在PDA、PSA上生長(zhǎng)較快，但未就分生孢子的形成開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。李怡琳等［2］對(duì)病原菌的產(chǎn)孢方法進(jìn)行了研究，認(rèn)為變灰尾孢菌接種在高粱粒培養(yǎng)基上后，放入搪瓷盤中其上覆蓋雙層消毒紗布防止污染，光暗交替培養(yǎng)2周，然后自然干燥，裝入雙層塑料袋中用硅膠除濕的方法可以使其大量產(chǎn)孢。但其操作方法步驟較多，過程中容易造成污染，不利于孢子的獲得。且對(duì)于該病菌分生孢子萌發(fā)條件研究至今仍未見報(bào)道。孢子的獲得是研究病菌侵染特性、致病機(jī)制乃至發(fā)生流行規(guī)律的重要前提，而在常規(guī)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上培養(yǎng)變灰尾孢菌并不能很好的誘導(dǎo)其產(chǎn)孢，因此，為深入研究綠豆-變灰尾孢菌的互作機(jī)制，本研究對(duì)變灰尾孢菌的最適產(chǎn)孢培養(yǎng)基、最適產(chǎn)孢條件以及最適的孢子萌發(fā)條件進(jìn)行了系統(tǒng)探討，為綠豆資源的抗病性鑒定，明確病菌侵染過程等奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1供試菌株

供試菌株為金玉曉等［3］從采自大慶市林甸縣的綠豆葉斑病標(biāo)樣上分離得到的純培養(yǎng)LD 14-08，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物免疫研究室提供。

1.2供試培養(yǎng)基

①馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；②馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）［11］；③燕麥片培養(yǎng)基（OMA）［12］；④玉米粉培養(yǎng)基（CMA）［12］；⑤察氏培養(yǎng)基（Czapek）［12］；⑥花生葉斑病尾孢菌培養(yǎng)基（Landers）［13］；⑦馬鈴薯葡萄糖酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基（PDAY）［14］；⑧高粱粒培養(yǎng)基（SG）［15］；⑨小麥粒培養(yǎng)基（WG）［15］。

1.3產(chǎn)孢培養(yǎng)基的篩選

取在PDA上培養(yǎng)的變灰尾孢菌的菌餅（d=5 mm）分別接種到PDA，PSA，OMA，CMA，Czapek，Landers，PDAY平板上，置于25℃，12 h光暗交替培養(yǎng)，每處理重復(fù)4次。培養(yǎng)10天后開始檢查不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢情況，觀察到產(chǎn)孢后，用血球計(jì)數(shù)板每3天統(tǒng)計(jì)一次產(chǎn)孢量。

平板培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量測(cè)量方法：在每皿中間打5個(gè)直徑5 mm的菌餅，置于0.5 mL無菌水中，充分振蕩5 min后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并計(jì)算產(chǎn)孢量［16］。

高粱粒培養(yǎng)基和小麥粒培養(yǎng)基接菌后，置于恒溫25℃培養(yǎng)箱12 h光暗交替培養(yǎng)，待菌絲擴(kuò)展到四周的高粱或麥粒上后，充分振動(dòng)使高粱或麥粒散開，繼續(xù)培養(yǎng)7天后，菌絲體充滿整個(gè)三角瓶，每瓶加無菌水10 mL，洗脫孢子鏡檢［15］。

1.4產(chǎn)孢條件的篩選

1.4.1溫度對(duì)分生孢子形成的影響將菌餅接在1.3中最適于病菌產(chǎn)孢的培養(yǎng)基上，分別置于20、25、30℃的培養(yǎng)箱中12 h光暗交替培養(yǎng)。每處理重復(fù)4次。培養(yǎng)16天后測(cè)量產(chǎn)孢量。

1.4.2光照對(duì)分生孢子形成的影響將菌餅接在1.3中最適于病菌產(chǎn)孢的培養(yǎng)基上，置于30℃的培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行連續(xù)光照、12 h光暗交替、連續(xù)黑暗培養(yǎng)。每處理重復(fù)4次。培養(yǎng)16天后測(cè)量產(chǎn)孢量。

1.5分生孢子的萌發(fā)條件

1.5.1溫度對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的影響用無菌水配置濃度為10×10倍視野下20個(gè)分生孢子的孢子懸浮液，吸取孢子懸浮液滴于載玻片上，每個(gè)載玻片上分開滴2滴，每滴20μL。將載玻片放在鋪好已潤(rùn)濕濾紙的培養(yǎng)皿里，置于20、25、30℃溫度下培養(yǎng)。分別于4、8、12、16、20、24 h在顯微鏡下鏡檢400個(gè)分生孢子，每處理觀察6個(gè)載玻片，記載孢子開始萌發(fā)時(shí)間，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.5.2光照對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的影響孢子懸浮液配制和處理同1.5.1，置于連續(xù)光照，10 h光暗交替，連續(xù)黑暗3種光照條件下培養(yǎng)20 h后，每處理鏡檢400個(gè)分生孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.5.3pH對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的影響用pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0共10個(gè)梯度的磷酸緩沖液配置濃度為10×10倍視野下20個(gè)分生孢子的孢子懸浮液，其他處理同1.5.1，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)黑暗培養(yǎng)20 h后，每處理鏡檢400個(gè)分生孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.5.4碳源對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的影響用含有淀粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、半乳糖和甘露醇濃度分別為10 g/L水溶液配置濃度為10×10倍視野下20個(gè)分生孢子的孢子懸浮液，以用無菌水配置的相同濃度的孢子懸浮液為對(duì)照。其他處理同1.5.1，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)黑暗培養(yǎng)20 h后，每處理鏡檢400個(gè)分生孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.5.5氮源對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的影響用含有硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素的濃度分別為10 g/L的水溶液配置濃度為10×10倍視野下20個(gè)分生孢子的孢子懸浮液，吸取20μL滴于載玻片上培養(yǎng)，以用無菌水配置的相同濃度的孢子懸浮液為對(duì)照。其他處理同1.5.1，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)黑暗培養(yǎng)20 h后，每處理鏡檢400個(gè)分生孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)孢培養(yǎng)基的篩選

變灰尾孢菌在9種供試培養(yǎng)基上25℃、光暗交替條件下培養(yǎng)的產(chǎn)孢時(shí)間和產(chǎn)孢量明顯不同（見表1）。在高粱粒培養(yǎng)基上培養(yǎng)第10天開始產(chǎn)孢，在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基和小麥粒培養(yǎng)基上培養(yǎng)12天開始產(chǎn)孢，在玉米粉培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天開始產(chǎn)孢。其余4種培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢。變灰尾孢菌在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量存在顯著差異，其中在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基，玉米粉培養(yǎng)基和小麥粒培養(yǎng)基上雖然能產(chǎn)生分生孢子，但產(chǎn)孢量較少，且開始產(chǎn)孢時(shí)間較長(zhǎng)。在高粱粒培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量較大，且產(chǎn)孢較早，宜用于分生孢子培養(yǎng)。

2.2培養(yǎng)溫度和光照條件對(duì)分生孢子形成的影響

從表2中可以看出，在高粱粒培養(yǎng)基上光暗交替條件下培養(yǎng)，各溫度處理的產(chǎn)孢量存在顯著差異，25℃的產(chǎn)孢量最大。在25℃幾種光照條件變灰尾孢菌產(chǎn)孢量差異不顯著。各培養(yǎng)光照條件下變灰尾孢菌在高粱粒培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量的差異不顯著。

2.3溫度和光照對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

表1　變灰尾孢菌在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢情況

從表3中可以看出變灰尾孢菌分生孢子的最適萌發(fā)溫度為25℃，培養(yǎng)24 h后分生孢子萌發(fā)率達(dá)到88.5%。連續(xù)黑暗有利于變灰尾孢菌分生孢子的萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)到76%。

表2　溫度、光照對(duì)變灰尾孢菌產(chǎn)孢量的影響

表3　溫度、光照對(duì)孢子萌發(fā)的影響

2.4pH對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

變灰尾孢菌分生孢子在pH 4～11的范圍內(nèi)均可萌發(fā)（見表4），pH為6～7時(shí)萌發(fā)率最高，達(dá)到85.42%。

2.5碳源對(duì)變灰尾孢菌分生孢子萌發(fā)的影響

不同碳源對(duì)變灰尾孢菌分生孢子萌發(fā)的影響見表4。分生孢子在無菌水中就可以較好的萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)到72.33%，說明其萌發(fā)對(duì)碳源沒有特殊要求。在蔗糖溶液中萌發(fā)率可達(dá)到87%，說明蔗糖能促進(jìn)分生孢子萌發(fā)，是分生孢子萌發(fā)的最適碳源。果糖對(duì)分生孢子萌發(fā)也有一定的促進(jìn)作用。分生孢子在淀粉、葡萄糖、麥芽糖和甘露醇中萌發(fā)均較差。

2.6氮源對(duì)變灰尾孢菌分生孢子萌發(fā)的影響

氮源對(duì)變灰尾孢菌分生孢子萌發(fā)的影響試驗(yàn)結(jié)果見表4。分生孢子在無菌水中的萌發(fā)率可以達(dá)到74.42%，說明其萌發(fā)對(duì)氮源沒有特殊要求。在供試氮源培養(yǎng)液中，變灰尾孢菌分生孢子均可萌發(fā)，在蛋白胨溶液中萌發(fā)率最高，萌發(fā)率可以達(dá)到86.33%，在尿素溶液中分生孢子的萌發(fā)率最低，但也達(dá)到59.67%。說明蛋白胨是分生孢子萌發(fā)的最適氮源。

3　討論與結(jié)論

2003年徐秀德等［17］的研究表明，最適宜玉米灰斑病菌產(chǎn)生分生孢子的為玉米碳粉碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基和玉米葉粉瓊脂培養(yǎng)基。但金玉曉等的研究發(fā)現(xiàn)，變灰尾孢菌在玉米葉粉瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況并不理想。James［18］認(rèn)為大豆灰斑病菌在利馬豆（Lima bean）瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)孢豐富。本研究發(fā)現(xiàn)，高粱粒培養(yǎng)基為變灰尾孢菌產(chǎn)孢的最適培養(yǎng)基。變灰尾孢菌在高粱粒培養(yǎng)基上，10天就可產(chǎn)生分生孢子，12天產(chǎn)孢量達(dá)到1×105個(gè)/mL，可以滿足接種，侵染過程等方面的研究需要，而操作方法較1987年李怡琳等［2］的方法更簡(jiǎn)便。

表4　pH、碳源和氮源對(duì)孢子萌發(fā)的影響

2014年金玉曉等［10］對(duì)該病菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，但對(duì)其產(chǎn)孢條件沒有進(jìn)行系統(tǒng)的研究。本文對(duì)該病菌的產(chǎn)孢條件進(jìn)行了研究，得出了25℃是變灰尾孢菌產(chǎn)孢的最適溫度，光照條件對(duì)變灰尾孢菌產(chǎn)孢影響不大的結(jié)論。這與鐘兆西等［19］報(bào)道的黑暗有利于大豆灰斑病菌（Cercospora sojina）產(chǎn)孢的觀點(diǎn)不同。

綠豆尾孢菌葉斑病的發(fā)生發(fā)展和危害程度與變灰尾孢菌分生孢子的萌發(fā)特性密切相關(guān)。但中國(guó)尚缺乏對(duì)該病害的深入系統(tǒng)研究。張益先等和王桂清［20-21］報(bào)道玉米灰斑病菌（Cercospora zeae-maydis Tehon and Doniels）分生孢子的最適萌發(fā)溫度為25℃。筆者對(duì)同屬的變灰尾孢菌的分生孢子進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)分生孢子在水滴中，3 h即可萌發(fā)，最適萌發(fā)溫度為25℃，此結(jié)果也與陳敏等［16］對(duì)趕黃草褐斑病菌（Cercospora sedoides Ell.et.Evht）的研究結(jié)果一致。黑暗有利于分生孢子的萌發(fā)，這與王偉等［22］對(duì)大豆紫斑病菌（Cercospora kikuchii Matsumoto and Toloysau）的研究結(jié)果相同。變灰尾孢菌與其他尾孢菌屬真菌一樣，其分生孢子可在較寬的pH范圍內(nèi)萌發(fā)［21-23］，其萌發(fā)的最適pH為6～7。分生孢子在無菌水中就可以較好地萌發(fā)，其萌發(fā)對(duì)碳源、氮源沒有特殊要求，蔗糖、果糖、蛋白胨有助于孢子萌發(fā)，這與王偉等［22］報(bào)道的大豆紫斑病菌的研究結(jié)果相似。但變灰尾孢菌分生孢子在無菌水中培養(yǎng)20 h后，其萌發(fā)率可達(dá)到72.33%，因此，可以看出變灰尾孢菌分生孢子萌發(fā)對(duì)碳源、氮源無特殊要求。

通過篩選變灰尾孢菌產(chǎn)孢的最適培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)高粱粒培養(yǎng)基與供試的其他培養(yǎng)基比較具有產(chǎn)孢早，產(chǎn)孢量大的優(yōu)點(diǎn)。明確了變灰尾孢菌分生孢子在25℃下高粱粒培養(yǎng)基中培養(yǎng)的較李怡琳等［2］更簡(jiǎn)便的培養(yǎng)方法。并且確定了25℃、pH 6～7，連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)的最適孢子萌發(fā)條件，為深入研究綠豆與變灰尾孢菌的互作奠定基礎(chǔ)。

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Conidia Production and Germination Conditions of Mung Bean Leaf Spot Pathogen

Zhang Haitao，Yin Lihua，Ke Xiwang，Tai Lianmei，Zuo Yuhu

（College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China）

To understand the optimal condition for the development and germination of conidium in mung bean leaf spot caused by the Cercospora canescens，nine culture media and different culture conditions were studied. The results showed that Cercospora canescens could be sporulated in sorghum grain culture medium at 25℃with 10 days post incubation（dpi）.The amount of conidium sporulated could reach 9×105conidium/mL at 14 dpi.There was less production of conidia with corn meal and wheat grain media，whereas no sporulation with other media.Additionally，a suitable condition for conidia germination was 25℃，pH 6-7 under dark condition，where germination rate could reach 76.0%after 20 h incubation，and there were significant differences in germination rates among different light and temperature conditions.In sucrose and peptone media，the conidia germination ratio was 87.0%and 86.3%，respectively.The optimal condition for sporulation of Cercospora canescens was at 25℃on sorghum grain culture medium，and the optimal condition for spore germination was 25℃，pH 6-7 in darkness.Conidia germination radio could be mildly improved with the addition of sucrose and peptone.

Mung Bean Leaf Spot；Crcospora canescens；Sporulation Quantity；Conidia Production Conditions；Germination Conditions

S432.4+4，S435.22

A論文編號(hào)：cjas16030016

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目子課題（2014BAD07B05-06/H08）；中國(guó)博士后科學(xué)基金第56批面上資助項(xiàng)目（2014M561378）；國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心組建項(xiàng)目（2011FU125X07）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)成、引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金（2030010000）。

張海濤，男，1990年出生，黑龍江五常人，碩士研究生，研究方向?yàn)檎婢c作物真菌病害。通信地址：163319黑龍江省大慶市高新區(qū)黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理與應(yīng)用微生物研究所，Tel：0459-6819133，E-mail：18245079648@163.com。

左豫虎，男，1965年出生，河南新鄭人，教授，博士研究生導(dǎo)師，博士，主要從事植物病理學(xué)研究與教學(xué)。通信地址：163319黑龍江省大慶市高新區(qū)黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理與應(yīng)用微生物研究所，Tel：0459-6819133，E-mail：zuoyuhu@hlau.edu.cn

2016-03-17，

2016-07-28。