鄧汝淇，胡何節(jié)，方征東，王曉天，孫小杰，葛新寶

低溫對小鼠骨髓源樹突狀細胞生物特性的影響

鄧汝淇，胡何節(jié)，方征東，王曉天，孫小杰，葛新寶

取C57BL/6小鼠骨髓細胞，在不同時期進行低溫凍存的條件下對其進行誘導(dǎo)和培養(yǎng)，獲得樹突狀細胞（DCs）。經(jīng)過凍存的DCs復(fù)蘇后存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義；各組DCs均高表達CD11c，低表達CD80、CD86及主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ（MHC-Ⅱ）分子；混合淋巴細胞反應(yīng)及培養(yǎng)上清液中白介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明在不同時期進行低溫凍存的DCs仍能保持穩(wěn)定的生物特性。

低溫保存；樹突狀細胞；細胞培養(yǎng)

自1973年首次報道樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）以來，對其進行了深入研究，是目前已知的體內(nèi)功能最強大的專職抗原提呈細胞（antigenpresenting cell，APC），是免疫系統(tǒng)的重要組成部分［1］。DCs經(jīng)常被選擇用于研究疾病的進展機制、癌癥以及自身免疫性疾病等。目前認為下肢動脈硬化性閉塞癥（atherosclerosis occlusion，ASO）是一種慢性炎癥的病理過程［2］。研究［3］表明，血管樹突狀細胞（vascular dendritic cell，VDC）可能參與了ASO的炎癥性免疫反應(yīng)。外周血中DCs較少，而利用DCs進行免疫治療的研究中需要大量DCs，為獲得生物特性良好的DCs，對小鼠骨髓源DCs低溫保存的研究具有重要意義，為進一步研究ASO的細胞免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級健康雄性C57BL/ 6小鼠和BALB/c小鼠，約20 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑 RPMI 1640全培養(yǎng)液、南美胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Hyclone公司；重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（recombinant murine granulocyte macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF）、重組小鼠白介素-4（rmIL-4）購自美國 Peprotech公司；流式熒光抗體 FITC antimouse CD11c、PerCP-CyTM5.5 anti-mouse CD80、APC anti-mouse CD86、PE anti-mouse MHC-Ⅱ及其同型對照抗體購自美國BD公司；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所；小鼠白介素-10 （interleukin-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.3 主要儀器 恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國SHEL LAB公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；-80℃超低溫冰箱購自美國Advantage公司；流式細胞儀購自美國BD公司；酶標儀購自美國BioTek公司。1.4 小鼠骨髓源DCs的培養(yǎng)與分組 頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，75%酒精浸泡至少10 min，再無菌剝除小鼠股骨、脛骨上肌肉組織，PBS反復(fù)洗滌后，剪去骨干兩端，RPMI 1640全培養(yǎng)液沖洗骨髓腔直至沖洗液變白，過濾去除組織碎片，收集濾出液獲得小鼠骨髓細胞，分成正常培養(yǎng)組和早期凍存后培養(yǎng)組，早期凍存后培養(yǎng)組用于凍存，正常培養(yǎng)組經(jīng)離心機1 200 r/min離心5 min后，棄上清液，用含12% FBS的RPMI 1640全培養(yǎng)液制成單細胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為0.5×106/ml，加入rmGM-CSF和rmIL-4（其終濃度均為20 ng/ml），置37℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后以1 200 r/min離心5 min去除上清液，并補充全培養(yǎng)液和細胞因子繼續(xù)培養(yǎng)，隔日半量換液，第5天繼續(xù)半量換液后從正常培養(yǎng)組中分出培養(yǎng)后凍存組，培養(yǎng)后凍存組經(jīng)自然沉降后收集懸浮細胞用于凍存，隔日后收集細胞懸液。

1.5 細胞的凍存與復(fù)蘇后培養(yǎng) 用于凍存的細胞離心后重懸于自制凍存液（70%RPMI 1640全培養(yǎng)液，20%FBS，10%DMSO），調(diào)整細胞濃度為5×109個/L，在-20℃下保存1 h后轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱，24 h后轉(zhuǎn)移到液氮罐中。4周后復(fù)蘇。早期凍存后培養(yǎng)組復(fù)蘇后按正常培養(yǎng)組步驟繼續(xù)培養(yǎng)出DCs。培養(yǎng)后凍存組則用全培養(yǎng)液制成細胞懸液，并加入rmGM-CSF和rmIL-4，培養(yǎng)1 d，換液并補充細胞因子，隔日收集細胞。

1.6 觀察細胞存活率 取復(fù)蘇后的DCs懸液0.1 ml，加入0.8 ml PBS，再加入0.1 ml 0.4%臺盼藍染色液混勻（終濃度0.04%），染色3 min后，倒置顯微鏡下觀察分別計數(shù)未被染色的成活細胞和染成藍色的死細胞，計算DCs存活率。細胞存活率（%）=活細胞總數(shù)/（活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)）×100%。

1.7 流式細胞儀檢測小鼠骨髓源DCs分子表型分別收集各組DCs懸液，調(diào)整樣品細胞濃度為1× 106/ml，按照流式抗體說明書進行抗體及其同型對照標記，在4℃下避光孵育30 min，離心、洗滌并重懸于500 μl PBS液中，流式細胞儀檢測各組細胞表面CD11c、CD80、CD86及主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ（major histocompatibility complex classⅡ，MHC-Ⅱ）分子的表達。

1.8 CCK-8法檢測混合淋巴細胞反應(yīng)（mixed lymphocyte reaction，MLR） 無菌取BALB/c小鼠脾臟并剪碎，經(jīng)研磨、過濾后獲得細胞懸液，尼龍毛柱法獲得同種異體T細胞（調(diào)整濃度為2×106/ml）。在1.4和1.5步驟中獲得的各組DCs中，加入絲裂霉素C（終濃度為25 μg/ml），37℃下孵育45 min， PBS洗滌2遍，按1∶5、1∶10、1∶20、1∶40的比例分別將DCs和T細胞加入96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)DCs細胞和T細胞作陰性對照，培養(yǎng)液作為空白對照，兩者共培養(yǎng)68 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用酶標儀測定450 nm處各孔光密度（optical density，OD）值。

1.9 ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中IL-10、TGF-β1水平 收集上述各組DCs細胞上清液，按ELISA試劑盒說明書步驟測定培養(yǎng)上清液IL-10、TGF-β1水平。1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 每組均檢測5個樣本，各組間比較采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素分析，定量資料采用表示，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)蘇后存活率 凍存4周后，早期凍存后培養(yǎng)組細胞復(fù)蘇后存活率為（85±3.9）%，培養(yǎng)后凍存組細胞復(fù)蘇后成活率為（83±6.1）%。兩組凍存方法所得存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.617，P＞0.05）。

2.2 DCs表型 分別收集各組誘導(dǎo)出的DCs，用流式細胞術(shù)測定其細胞表型。結(jié)果顯示3組細胞均高表達CD11c，低表達CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子，均表現(xiàn)為未成熟狀態(tài)（圖1），其表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.754、0.873、1.113、1.149，P＞0.05）。

2.3 DCs刺激增殖能力 刺激指數(shù)（stimulation index，SI）=（待測孔OD值-培養(yǎng)液對照組OD值）/（陰性對照組OD值-培養(yǎng)液對照組OD值）。結(jié)果顯示同比例下早期凍存后培養(yǎng)組、培養(yǎng)后凍存組DCs刺激同種異基因T細胞增殖的能力有所下降，但與正常培養(yǎng)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各組內(nèi)不同比例間隨著DCs濃度的下降，其增殖能力逐步下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.4 DCs培養(yǎng)上清液中細胞因子水平 用ELISA法分別測定3組DCs培養(yǎng)上清液中IL-10、TGF-β1細胞因子水平，3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F= 1.890、1.583，P＞0.05）。見圖3。

3 討論

DCs是一種特殊的白細胞，能夠時刻向免疫系統(tǒng)傳達抗原、感染和炎癥介質(zhì)的出現(xiàn)，在先天性和獲得性免疫中起著核心作用。成熟的樹突狀細胞（mature dendritic cells，mDCs）在效應(yīng)T細胞導(dǎo)致的動脈粥樣硬化性損傷炎癥過程中扮演著關(guān)鍵角色，可導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，嚴重病變處的DCs數(shù)量明顯多于早期病變［4］。研究［5］顯示動脈粥樣硬化血管病變的加重與DCs的成熟有關(guān)，斑塊內(nèi)轉(zhuǎn)移的mDCs數(shù)量與吸收的耐受性樹突狀細胞（tolerogenic dendritic cells，tolDCs）數(shù)量成負相關(guān)。mDCs與tolDCs的產(chǎn)生直接與病變的進程有關(guān)，因此抑制DCs的成熟和增加tolDCs的數(shù)量可能成為治療動脈粥樣硬化的一個有效手段。

圖1 流式細胞術(shù)分析DCs表面分子

圖2 DCs分別與同種異基因T細胞的MLR

圖3 DCs培養(yǎng)上清液中細胞因子水平

分析未成熟樹突狀細胞（immature dendritic cells，imDCs）表型中CD80、CD86和MHC-Ⅱ低表達，具有tolDCs表型，通過分泌IL-10、TGF-β1，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）的生成，Tregs則能對DCs的功能及成熟、活化進行調(diào)節(jié)［6］。筆者推測對tolDCs進行研究及使用tolDCs進行細胞免疫治療動脈粥樣硬化具有可行性。進行細胞免疫治療研究過程相對較長，需要大量生物特性相對穩(wěn)定的tolDCs。低溫保存是長期保存細胞重要的手段，本實驗采用C57BL/6小鼠骨髓培養(yǎng)方法可獲得大量較高純度DCs［7］，通過兩種不同的凍存方式刺激分化成DCs，并分析其生物特性。CD11c是DCs的特征性標記分子，3組DCs均表現(xiàn)為高表達，流式細胞術(shù)進一步檢測發(fā)現(xiàn)3組均低表達CD80、CD86 和MHC-Ⅱ，表現(xiàn)為耐受性，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MLR實驗顯示兩組凍存DCs對同種異基因T細胞的刺激指數(shù)較正常組降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可認為經(jīng)過凍存后獲得的imDCs對T細胞的刺激增殖能力無明顯變化。用ELISA法測定3組DCs培養(yǎng)上清液中細胞因子水平表明凍存后DCs對IL-10、TGF-β1的分泌功能無明顯變化。MLR和ELISA實驗表明經(jīng)過低溫保存的DCs和小鼠骨髓經(jīng)低溫保存后分化成的DCs能夠誘導(dǎo)Tregs的生成，可以用于小鼠動脈粥樣硬化的細胞免疫治療。

綜上所述，經(jīng)過低溫保存的DCs和小鼠骨髓經(jīng)低溫保存后分化成的DCs其生物特性與未經(jīng)過低溫保存的DCs之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進行DCs的凍存后，可大量儲存生物特性穩(wěn)定的DCs，避免了因不同培養(yǎng)批次間DCs生物特性之間的差異，節(jié)約了實驗資源，為后續(xù)實驗提供了基礎(chǔ)。

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Influence of cryopreservation on biological characteristics of mouse bone marrow-derived dendritic cells

Deng Ruqi，Hu Hejie，F(xiàn)ang Zhengdong，et al
（Dept of General Surgery，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

The C57BL/6 mice bone marrow cells were induced and cultivated and cryostoraged at different stages to obtain dendritic cells（DCs）for two groups respectively.The DCs without cryopreservation was control group.We found that no statistical significance of survival rate in anabiotic DCs was between the two groups.There were a higher expression of CD11c and lower expression of CD80，CD86 and major histocompatibility complex class-Ⅱ（MHC-Ⅱ）in three group cells.The mixed lymphocyte reaction and the levels of interleukin-10（IL-10）and transforming growth factor-β1（TGF-β1）were not statistically significant.We concluded that biological characteristics can be conserved stability in DCs with cryopreservation at different stages.

cryopreservation；dendritic cells；cell culture

R 654.3

A

1000-1492（2016）09-1368-04

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.062.html

2016-04-19接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號：1408085MH177）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普通外科，合肥 230001

鄧汝淇，男，碩士研究生；胡何節(jié)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：huhejie@hotmail.com