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(1.河北省邢臺市人民醫(yī)院產(chǎn)科，河北 邢臺 054000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050000)

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銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林對順鉑抑制卵巢惡性畸胎瘤細胞作用的影響

常征1，王惠蘭2*，喬宗旭1，李娜1，馬華姝1

(1.河北省邢臺市人民醫(yī)院產(chǎn)科，河北 邢臺 054000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050000)

目的以惡性畸胎瘤PA-1細胞作為惡性生殖細胞腫瘤的代表，探討銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林對順鉑抗腫瘤作用的影響。方法用細胞計數(shù)工具8(cell counting Kit-8，CCK-8)中方法檢測PA-1細胞增殖抑制率，免疫印跡法檢測胞漿細胞色素C(cytochrome c，Cyt-C)及凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease activating-1,Apaf-1)含量，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)法檢測Cyt-C及Apaf-1信使核糖核酸 (message ribonucleic acid，mRNA)表達水平。結(jié)果各組PA-1細胞抑制率，Cyt-C、Apaf-1蛋白水平及mRNA水平比較，B、C、D、E均高于A組，C、D、E組高于B組，E組低于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；E、D組PA-1細胞增殖抑制率、Cyt-C蛋白及Cyt-C mRNA、Apaf-1 mRNA高于C組，E組Apaf-1蛋白低于C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論在體外培養(yǎng)實驗中，順鉑對PA-1細胞存在明顯抑制效應(yīng)，以其半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)所對應(yīng)的銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林劑量與其聯(lián)合應(yīng)用，可增強順鉑對PA-1細胞的抑制作用，上調(diào)Cyt-C和Apaf-1 mRNA的表達水平，提高胞漿內(nèi)Cyt-C和Apaf-1蛋白含量。三者比較以氨磷汀作用最強。

畸胎瘤；順鉑；氨磷?。涣帘鹆謉oi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.10.024

銀杏黃酮作用于惡性畸胎瘤PA-1細胞，與順鉑的抑瘤作用有協(xié)同作用[1]。氨磷汀在腫瘤組織及正常組織中的作用有差別[2-3]。亮丙瑞林在化療過程中對生殖細胞腫瘤有抑制作用。前期研究顯示，銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林對順鉑所致卵巢損傷有一定的保護作用[4]，擬作為有生育要求的惡性畸胎瘤患者化療的輔助用藥，但3種藥物對順鉑抑制腫瘤細胞作用的影響無相關(guān)報道。本研究以PA-1細胞為研究對象，測定其細胞抑制率、胞漿細胞色素C(cytochrome c，Cyt-C)和凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease activating-1,Apaf-1)蛋白含量以及Cyt-C和Apaf-1mRNA含量，旨在探討銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林在順鉑對PA-1抑制過程中的影響[5]。

1　資料與方法

1.1細胞來源PA-1細胞(編號ATCCCRL-1572，購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細胞中心)。細胞培養(yǎng)條件：使用1640培養(yǎng)基，置于含5%CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d傳代1次。

1.2細胞增殖抑制率的測定順鉑半抑制濃度 (half maximal inhibitory concentration，IC50)的確定：以不同濃度的順鉑作用于PA-1細胞，使用細胞計數(shù)工具8(cell counting Kit-8，CCK-8)法檢測細胞增殖抑制率，確定順鉑的作用時間和濃度。使用下列公式計算細胞增殖率及細胞增殖抑制率：細胞增殖率=[受試孔光密度(optical density，OD)值-本底對照孔OD值]/(對照細胞OD-本底對照OD值)×100%；細胞增殖抑制率=(1-細胞增殖率)×100%。

1.3細胞分組及用藥按照實驗要求，選取對數(shù)生長期細胞，按照每孔1×105個細胞的濃度鋪96孔板，加入培養(yǎng)液至每孔體積100 μL，培養(yǎng)24 h后分成5組，每組測10組數(shù)據(jù)，A組為生理鹽水組，B組為順鉑組，C組為銀杏黃酮+順鉑組，D組為氨磷汀+順鉑組，E組為亮丙瑞林+順鉑組，每組數(shù)據(jù)設(shè)3個復(fù)孔及本底對照孔(僅加培養(yǎng)基，無細胞)。根據(jù)表1測定結(jié)果，順鉑作用于PA-1細胞24 h ，其IC50為35.02 mg/L。根據(jù)人體臨床用藥劑量比例，確定銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林的相應(yīng)給藥濃度，分別為銀杏黃酮26.25 g/L、氨磷汀5.25 g/L及亮丙瑞林17.5 mg/L。

1.4檢測指標(biāo)檢測各組細胞生長抑制率，評價藥物對順鉑作用的影響；免疫印跡法檢測胞漿Cyt-C及Apaf-1蛋白含量；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測Cyt-C及Apaf-1 mRNA表達水平[6]。

順鉑濃度12h24h48h72h00.576±0.0100.615±0.0070.669±0.0200.756±0.0211mg/L0.554±0.0080.585±0.0080.605±0.0070.672±0.0062.5mg/L0.516±0.0060.534±0.0110.539±0.0160.572±0.0155mg/L0.495±0.0100.500±0.0120.472±0.0170.456±0.02610mg/L0.473±0.0100.467±0.0200.382±0.0190.414±0.01115mg/L0.459±0.0120.414±0.0110.331±0.0190.335±0.007

1.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

各組PA-1細胞增殖抑制率，Cyt-C、Apaf-1蛋白水平及mRNA水平比較：B、C、D、E均高于A組，C、D、E組高于B組， E組低于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；E、D組PA-1細胞增殖抑制率、Cyt-C蛋白及Cyt-C mRNA、Apaf-1 mRNA高于C組，E組Apaf-1蛋白低于C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組別細胞增殖抑制率(%)Cyt-C蛋白Apaf-1蛋白Cyt-CmRNAApaf-1mRNAA組01111B組44.70±0.41*1.56±0.09*1.72±0.09*2.23±0.45*1.91±0.23*C組56.30±1.60*#1.57±0.03*2.66±0.10*#3.64±0.35*#2.72±0.45*#D組64.00±2.02*#△2.91±0.07*#△4.35±0.30*#△7.56±0.66*#△5.77±0.45*#△E組61.50±0.89*#△☆2.33±0.05*#△☆2.46±0.17*#△☆4.22±0.42*#△☆3.07±0.34*#△☆F388.147894.527362.324219.877193.809P0.0000.0000.0000.0000.000

*P<0.05與A組比較#P<0.05與B組比較△P<0.05與C組比較☆P<0.05與D組比較(q檢驗)

3　討　　論

臨床多種抗腫瘤藥物，均通過各種方式誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤作用，而一些腫瘤產(chǎn)生耐藥也與細胞凋亡過程密切相關(guān)[7]。人類卵巢惡性畸胎瘤細胞株P(guān)A-1由轉(zhuǎn)移性卵巢癌患者的腹水細胞中獲得，是生殖細胞腫瘤的一種，順鉑是一種臨床常用的抗腫瘤藥物，對多種腫瘤具有良好的抑制作用，對生殖細胞腫瘤也有良好的抑制效果。其主要機制就是通過氧化損傷誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)過程中，給予順鉑后，PA-1細胞胞漿Cyt-C及Apaf-1 mRNA的表達水平上調(diào)，胞漿Cyt-C及Apaf-1蛋白含量增加，細胞凋亡增加，細胞增殖受到抑制，24 h抑制率為44.70%。

本研究結(jié)果顯示，銀杏黃酮+順鉑組的抑制率高于順鉑組，提示銀杏黃酮與順鉑聯(lián)合應(yīng)用，不僅可以發(fā)揮對卵巢功能的保護作用，同時可以加強順鉑的抗腫瘤作用。目前研究者對于黃酮類化合物的抗腫瘤作用的認識逐漸加深，臨床研究顯示黃酮類化合物通過抑制腫瘤細胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡2個方面而發(fā)揮抗腫瘤作用。在人類神經(jīng)母細胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌及子宮內(nèi)膜癌等腫瘤的研究中，黃酮類化合物都發(fā)揮了這一作用[8-9]。有研究顯示，銀杏黃酮對于小鼠淋巴瘤YAC-1細胞的增殖在體外及體內(nèi)實驗中均有抑制作用，對于宮頸癌Hela細胞，可降低Bcl-2 mRNA的表達，誘導(dǎo)Hela細胞凋亡，對于肝癌HepG細胞可發(fā)揮抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。銀杏黃酮的抗腫瘤作用機制復(fù)雜而廣泛，其可通過調(diào)節(jié)多種凋亡相關(guān)蛋白的表達而起作用。本研究結(jié)果中，銀杏黃酮+順鉑組與順鉑組比較，Cyt-C及Apaf-1 mRNA表達水平均增高，胞漿中Apaf-1蛋白含量也增高，但Cyt-C蛋白含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示Cyt-C在合成及釋放過程中受到了調(diào)節(jié)，與mRNA的表達水平不協(xié)調(diào)，其具體機制尚需進一步研究。

本研究將氨磷汀與順鉑聯(lián)用，可加強順鉑對PA-1的抑制作用，其細胞增殖抑制率可高達64.00%，高于單純順鉑組及銀杏黃酮+順鉑組，同時上調(diào)了Cyt-C及Apaf-1 mRNA的表達水平，提高了胞漿內(nèi)Cyt-C及Apaf-1蛋白含量，加強了順鉑的誘導(dǎo)凋亡作用。氨磷汀在以往的多項研究中顯示了廣泛細胞保護作用，在多種惡性腫瘤的治療中，用于減輕放療及化療所致的骨髓抑制、腎功能損害、神經(jīng)系統(tǒng)功能損害等。氨磷汀需經(jīng)過體內(nèi)代謝后發(fā)揮作用，氨磷汀經(jīng)堿性磷酸酶水解后形成帶有自由巰基的代謝產(chǎn)物，正常組織對其攝取能力較腫瘤組織高達100倍，同時堿性磷酸酶的活性與pH有關(guān)，腫瘤組織pH值較低，該酶活性較低。由于在正常組織及腫瘤組織中的不同分布，氨磷汀可發(fā)揮對正常組織的保護作用而不影響腫瘤組織對放化療的敏感性[10-11]。在離體實驗中，氨磷汀可以誘導(dǎo)DNA損傷的細胞發(fā)生凋亡，而且其誘導(dǎo)凋亡的作用在正常細胞與腫瘤細胞中存在差別。這一作用在體內(nèi)實驗中是否能夠出現(xiàn)，有待進一步研究。

本研究將亮丙瑞林與順鉑聯(lián)合應(yīng)用，對于PA-1細胞顯示了一定的抑制作用，在給予順鉑前給予亮丙瑞林作用24 h，使PA-1細胞的增殖抑制率提高至61.50%，較單用順鉑組抑制效果更明顯，同時可以上調(diào)Cyt-C和Apaf-1 mRNA的表達水平及提高胞漿內(nèi)Cyt-C和Apaf-1蛋白含量。表明在保護卵巢功能的同時，亮丙瑞林還發(fā)揮了對腫瘤細胞的抑制作用，并未影響順鉑的化療效果，且這一效果與線粒體途徑相關(guān)。亮丙瑞林是一種促性腺激素釋放激素 (gonadotropin-releasing hormone，GnRH)激動劑，臨床應(yīng)用廣泛，主要應(yīng)用于性激素依賴性疾病如乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜異位癥及性早熟等[12-13]。其作用是抑制垂體及卵巢功能，減少促性腺激素及雌孕激素的分泌，對化療所致卵巢功能損傷有確切的保護作用，其主要機制是抑制卵泡發(fā)育，使卵泡停滯于對化療損傷敏感性較低的原始卵泡階段[14]，以減輕化療損傷。而GnRH激動劑通過抑制垂體功能，下調(diào)促性腺激素的分泌，對于卵巢腫瘤也有一定的治療作用。

銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林均顯示了對PA-1細胞的抑制作用，且均顯示與線粒體途徑相關(guān)，比較三者的作用效果，氨磷汀對PA-1的抑制作用最強，但由于線粒體途徑包含的步驟很多，且存在眾多調(diào)節(jié)因子，因此3種藥物對PA-1細胞的抑制作用機制仍需進一步探討，本實驗觀察到的現(xiàn)象為今后的研究指出了一個方向。

總之，在體外培養(yǎng)實驗中，順鉑對PA-1細胞存在明顯抑制效應(yīng)，以其IC50所對應(yīng)的銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林劑量與其聯(lián)合應(yīng)用，可增強順鉑對PA-1細胞的抑制作用，上調(diào)Cyt-C和Apaf-1 mRNA的表達水平及提高胞漿內(nèi)Cyt-C和Apaf-1蛋白含量。三者比較以氨磷汀作用最強。

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(本文編輯：劉斯靜)

·論著·

R730.269

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1007-3205(2016)10-1208-04

2015-08-07；

2016-01-08

王亞軍(1974-)，女，滿族，河北豐寧人，河北省豐寧縣醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事婦產(chǎn)科疾病診治研究。