霍宏昌，王　切，王素玲，王　磊*

(1.河北省石家莊市婦幼保健院外科，河北 石家莊 050081；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；3.河北省血液中心檢驗科；河北 石家莊 050071)

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大鼠腎缺血再灌注損傷模型心肌內(nèi)過氧化酶Ⅲ的表達(dá)變化

霍宏昌1，王切2，王素玲3，王磊2*

(1.河北省石家莊市婦幼保健院外科，河北 石家莊 050081；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；3.河北省血液中心檢驗科；河北 石家莊 050071)

目的觀察過氧化酶Ⅲ(peroxiredoxin Ⅲ，PrxⅢ)在大鼠腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)模型心肌內(nèi)的表達(dá)變化，探討PrxⅢ在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用。方法大鼠切除右腎后，無損傷動脈夾夾閉左腎動脈，建立腎缺血再灌注損傷模型。再灌注24 h后取材(血、腎、心)。采用酶偶聯(lián)速率法和苦味酸法檢測血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(seaum creatinine,SCr)濃度；HE染色法觀察大鼠腎組織形態(tài)；硫代巴比妥酸比色法(thiobarbituric acid,TBA)檢測心肌丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法和免疫印跡法測定大鼠心肌組織內(nèi)抗氧化酶PrxⅢ的mRNA與蛋白表達(dá)水平。結(jié)果RIRI組大鼠血清中BUN和SCr濃度明顯高于對照組，RIRI組大鼠心肌組織中MDA含量、PrxⅢ mRNA水平相對表達(dá)量、PrxⅢ蛋白水平相對表達(dá)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論RIRI后，心肌組織出現(xiàn)過氧化損傷；PrxⅢ在腎缺血再灌注損傷大鼠的心組織內(nèi)發(fā)揮了抗氧化應(yīng)激的作用。

再灌注損傷；腎;過氧化酶Ⅲ；大鼠doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.10.013

腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是泌尿外科臨床治療過程中經(jīng)常發(fā)生的病理生理過程，也是導(dǎo)致患者術(shù)后發(fā)生急性腎衰竭和腎功能恢復(fù)延遲的重要因素[1-4]。當(dāng)腎臟發(fā)生急性缺血再灌注時，會產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)，導(dǎo)致其處于高度的氧化應(yīng)激狀態(tài)，這也是缺血后再灌注時發(fā)生損傷的重要機(jī)制之一[5-7]。羥自由基(OH-)、超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)都是ROS的重要成員，它們可以破壞細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂類和DNA等生物大分子，從而影響細(xì)胞的功能，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷甚至死亡[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腎功能受損時，其遠(yuǎn)端或鄰近器官如肝、肺、心、腦和腸等的功能也會同時受損[11]。過氧化酶Ⅲ(peroxiredoxin Ⅲ, PrxⅢ)屬能清除ROS的過氧化物酶系[12]，也是整個家族中唯一特異性定位于線粒體內(nèi)的成員。線粒體是內(nèi)源性ROS的主要產(chǎn)生來源，同時它自身也遭受ROS的攻擊。已有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞線粒體內(nèi)H2O2的清除與PrxⅢ具有密切關(guān)系[13-14]。心是機(jī)體內(nèi)需氧量大、容易受到ROS攻擊、遭受過氧化損傷的器官。在RIRI時，腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)；心臟是否也會發(fā)生過氧化損傷，心肌組織PrxⅢ的表達(dá)如何變化，尚未見相關(guān)報道。本研究觀察大鼠RIRI模型心肌內(nèi)的PrxⅢ表達(dá)變化，旨在探討PrxⅢ在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1RIRI模型建立及樣品處理選用健康成年雄性Wistar大鼠12只，體質(zhì)量190～210 g，隨機(jī)分為RIRI組和對照組各6只。6%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉下，將大鼠固定于手術(shù)臺上，常規(guī)備皮、消毒、鋪單。自劍突向下做腹部正中切口4 cm，結(jié)扎右側(cè)腎蒂后切除右腎。RIRI組大鼠分離左腎動脈,用無創(chuàng)動脈夾將其夾閉, 觀察左腎顏色，由鮮紅漸變?yōu)榘导t，顯示夾閉成功。45 min后松開動脈夾,恢復(fù)血供,可見左腎動脈充盈, 顏色迅速轉(zhuǎn)為鮮紅色,顯示再灌注成功。對照組大鼠只分離左腎動脈并不夾閉。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

術(shù)后24 h再次麻醉大鼠，自頸總動脈取血約5 mL，3 000 r/min離心10 min，分離血清去除紅細(xì)胞，用于血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(seaum creatinine, SCr)濃度測定；取腎并用4%多聚甲醛浸泡固定，組織切片HE染色光鏡觀察其形態(tài)學(xué)變化；取心肌組織置于液氮中，用于丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和PrxⅢ mRNA及蛋白水平測定。

1.2主要試劑Trizol、Taq DNA聚合酶等均為Invitrogen公司產(chǎn)品；溴化乙啶、瓊脂糖、RT試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；PrxⅢ一抗(兔抗鼠)Abcam公司，二抗(羊抗兔)Zymed公司。血清SCr和BUN測定試劑盒，均為中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品；MDA測定試劑盒為南京建成科技有限公司產(chǎn)品。

1.3血清SCr和BUN濃度測定根據(jù)試劑盒說明書，采用苦味酸法測定血清樣本SCr濃度，酶偶聯(lián)速率法測定BUN濃度。將R1和 R2按照1∶1的比例混合成工作液，校準(zhǔn)品開瓶即可使用，用于測定SCr濃度；用R2溶解R1，溶解后即為工作液，校準(zhǔn)品為廠家提供，用于測定BUN濃度。各取3只直徑為1 cm的比色管，分別作為空白管、校準(zhǔn)管和樣本管。在空白管內(nèi)加入1 mL工作液和0.1 mL生理鹽水，在校準(zhǔn)管內(nèi)加入1 mL工作液和0.1 mL校準(zhǔn)品，在樣本管內(nèi)加入1 mL工作液和0.1 mL血清樣本，分別混勻待檢測。測定其在波長505 nm(SCr)和340 nm(BUN)、溫度37 ℃條件下的吸光度值?；靹蚝?0 s所測吸光度值為A1，再過20～60 s所測吸光度值為A2，用2次吸光度的差值，以空白管調(diào)零，計算吸光度變化值，即△A樣本和△A校準(zhǔn)。根據(jù)公式C樣本=△A樣本×C校準(zhǔn)/△A校準(zhǔn)，計算每個血清樣本的SCr和BUN濃度。

1.4腎組織形態(tài)學(xué)觀察采用HE染色法觀察大鼠腎組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。取腎組織，按常規(guī)組織切片制作步驟進(jìn)行操作：脫水、透明、浸蠟、包埋，切片厚約5 μm，HE染色后封片，用奧林巴斯光學(xué)顯微鏡，觀察腎組織的形態(tài)變化并拍攝照片。

1.5心肌組織中MDA含量的測定將心肌組織按照20 mg/100 μL的標(biāo)準(zhǔn)加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(1 mmol/L鹽酸苯甲脒，pH 7.4，0.1%吐溫-20，50 mmol/L磷酸鉀緩沖液，5 mmol/L β-巰基乙醇,1 mmol/L苯甲基磺酰氟，1 mmol/L 乙二胺四乙酸三鈉鹽，0.5 mol/L NaCl)，在冰浴中勻漿，條件為：4 ℃、4 000 r/min(約3 500 g)，離心20 min，取上清制成含10%心肌組織的勻漿液，按照試劑盒操作說明，采用硫代巴比妥酸比色法(thiobarbituric acid,TBA)測定心肌MDA含量。

1.6心肌組織PrxⅢ mRNA水平相對表達(dá)量的測定采用Trizol(Invitrogen公司)法提取心組織總RNA。用3 μg RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，GAPDH作為內(nèi)參照，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。用PrxⅢ與內(nèi)參的擴(kuò)增產(chǎn)物灰度值之比，表示PrxⅢ mRNA相對表達(dá)量。所用PrxⅢ、GAPDH引物序列見表1。

表1　PrxⅢ和GAPDH引物序列Table 1　The primers of PrxⅢ and GAPDH

1.7心肌組織PrxⅢ 蛋白水平相對表達(dá)量的測定采用免疫印跡分析法，測定大鼠心肌組織內(nèi)PrxⅢ蛋白的相對表達(dá)量。將心肌組織制成勻漿后，離心取上清。采用改良Lowry法測定心肌組織蛋白總量。電泳時上樣量為62 μg。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，在聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上滴加一抗，室溫(18～24 ℃)過夜，漂洗后加HRP標(biāo)記的二抗。按照發(fā)光試劑的操作說明進(jìn)行顯影、定影、晾干。影像掃描后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(以條帶吸光度值與內(nèi)參之比表示相對表達(dá)量)。

2　結(jié)　　果

2.1大鼠腎組織形態(tài)學(xué)改變光鏡觀察結(jié)果顯示：對照組大鼠腎小囊、腎血管球、集合管、遠(yuǎn)曲小管及近曲小管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整；RIRI組大鼠腎小管管腔擴(kuò)張明顯，腎小囊囊腔擴(kuò)張，部分腎小球萎縮、體積變小，腎小管間隙擴(kuò)大，腎間質(zhì)水腫，集合管管腔擴(kuò)張等改變(圖1)。

圖1大鼠腎小球、腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE×400)

A.對照組;B.RIRI組

Figure1Morphologyofglomeruliandtubules(HE×400)

2.22組觀察指標(biāo)比較RIRI組大鼠血清BUN和SCr濃度明顯高于對照組，RIRI組大鼠心肌組織中MDA含量、PrxⅢmRNA水平相對表達(dá)量、PrxⅢ蛋白水平相對表達(dá)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2和圖 2，3。

表22組觀察指標(biāo)比較

組別尿素氮(mmol/L)肌酐(μmol/L)MDA(mmol/g)PrxⅢmRNAPrxⅢ蛋白對照組4.462±0.541103.444±8.46510.18±1.770.95±0.170.58±0.09RIRI組13.685±4.397131.153±17.81414.01±2.291.34±0.181.01±0.17t5.0933.4593.2403.8985.367P0.0000.0060.0090.0030.000

圖2心肌組織PrxⅢ mRNA相對表達(dá)量

Figure 1The mRNA expression of PrxⅢ in heart

圖3心肌組織PrxⅢ蛋白相對表達(dá)量

Figure 2The protein expression of PrxⅢ in heart

3　討　　論

腎是機(jī)體內(nèi)重要的排泄和分泌器官，對于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定具有重要意義。當(dāng)腎功能受損時，機(jī)體其他主要臟器肝、肺、心、腦、腸等的功能也會同時受損，但機(jī)制尚不十分清楚。RIRI是臨床治療過程中一種常見的病理生理反應(yīng)，多見于腎擠壓傷、腎移植、部分腎切除及失血性休克等的臨床治療過程中。RIRI也是導(dǎo)致患者出現(xiàn)術(shù)后并發(fā)癥如急性腎衰竭、腎移植失敗的重要原因之一[1-5]。已有研究證實，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致RIRI的重要機(jī)制之一[5-7]。本研究的目的是觀察RIRI后心肌組織內(nèi)MDA含量和PrxⅢ表達(dá)水平的改變。探討RIRI后心肌組織損傷的可能原因以及抗氧化酶PrxⅢ在此過程中的抗氧化作用，為防治RIRI所誘發(fā)的心肌組織損傷提供數(shù)據(jù)參考和理論依據(jù)。本研究首先建立大鼠RIRI的模型：第一步切除大鼠右腎，第二步分離大鼠左腎動脈，然后用無損傷動脈夾夾閉，第三步夾閉45 min后去掉動脈夾，恢復(fù)大鼠左腎的血液供應(yīng)，制造大鼠RIRI模型；左腎恢復(fù)血液供應(yīng)24 h后取材，左腎組織光鏡觀察顯示RIRI組大鼠的腎小球以及腎小管均已發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變。臨床上常用的檢測腎功能的指標(biāo)是SCr和BUN。當(dāng)腎功能受損時腎小球濾過率會降低，血清內(nèi)BUN和SCr的濃度也會隨之升高。本研究結(jié)果顯示RIRI組大鼠血清BUN和SCr濃度明顯高于對照組。表明RIRI組大鼠的腎功能已經(jīng)受損，大鼠RIRI模型是成功的。

大鼠RIRI后，心肌組織是否發(fā)生過氧化損傷？通過檢測心肌組織內(nèi)MDA的含量，用MDA的含量反映心肌組織是否遭受過氧化損傷。MDA 是ROS與組織脂類物質(zhì)(細(xì)胞膜等)發(fā)生過氧化反應(yīng)所形成的，是最重要的脂類物質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其含量反映了組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度和速度，常被作為評價細(xì)胞或組織發(fā)生過氧化損傷后損傷程度的客觀指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果顯示RIRI組心肌組織內(nèi)MDA含量明顯高于對照組。推測在RIRI發(fā)生后，大鼠心肌組織遭受ROS的攻擊，并與心肌組織的脂類物質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致脂類過氧化產(chǎn)物的大量堆積。表明當(dāng)RIRI發(fā)生后心肌組織也遭受過氧化損傷。

PrxⅢ在心肌細(xì)胞的線粒體內(nèi)大量表達(dá)。已有研究證實，PrxⅢ能清除心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)產(chǎn)生的大量ROS，保護(hù)心肌組織免受過氧化損傷[13-14]。本研究結(jié)果顯示RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)PrxⅢ的mRNA水平和蛋白水平明顯高于對照組?？紤]心肌組織內(nèi)MDA的含量升高，再結(jié)合PrxⅢ的mRNA和蛋白水平的升高，推測當(dāng)RIRI發(fā)生后，不僅腎臟內(nèi)有大量ROS，而且心肌組織內(nèi)的ROS含量也隨之增多。過多的ROS與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致MDA等過氧化產(chǎn)物的大量堆積。為了清除過多的ROS，機(jī)體通過上調(diào)PrxⅢ的含量清除過多的ROS，以保護(hù)心肌組織免遭過氧化損傷。

綜上所述，在RIRI時，心肌組織也發(fā)生過氧化損傷，抗氧化酶PrxⅢ可能在清除ROS、減輕心肌組織的氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。這為防治RIRI所誘發(fā)的心肌損傷提供了一條新思路。

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(本文編輯：趙麗潔)

Expression changes of peroxiredoxin Ⅲ in the myocardium of renal ischemia reperfusion injury model in rats

HUO Hong-chang1, WANG Qie2, WANG Su-ling3, WANG Lei2*

(1.Department of Surgery，Maternal and Child Health Care Hospital of Shijiazhuang City，Hebei Prvoince，Shijiazhuang 050081，China; 2.Department of Anatomy, School of Basic Medical Sciences,Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China；3.Department of Laboratory,the Blood Center of Hebei Province, Shijiazhuang 050071, China)

ObjectiveTo observe the expression of peroxiredoxin Ⅲ(PrxⅢ) in renal ischemia reperfusion injury model rats and study the role in oxidative stress response. MethodsAfter removal of the right kidney, the left renal artery without injury was removed, and the model of renal ischemia and reperfusion injury was established. After 24 hours of reperfusion, the blood and kidney were taken. The serum blood urea nitrogen(BUN) and serum creatinine(SCr) were detected with picric acid method and enzyme coupling rate method, the malondialdehyde(MDA) content in myocardial tissue was determined by thiobarbituric acid colorimetric method. The renal morphology change was observed by HE staining. The PrxⅢ mRNA and protein expression in myocardium were evaluated by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and western blot. ResultsCompared with the control group, the BUN and SCr in serum of renal ischemia reperfusion injury group were significantly increased. The MDA content, the PrxⅢ mRNA relative expression level and protein relative expression level in myocardium of renal ischemia reperfusion injury group were higher than that of control group, there were statistically significant difference (P<0.05). ConclusionAfter renal ischemia reperfusion injury, myocardial tissue appeared oxidative damage. PrxⅢ plays a role of anti oxidative stress in the heart tissue of rats with renal ischemia reperfusion injury.

reperfusion injury; kidney; peroxiredoxin Ⅲ; rats

R619.9

A

1007-3205(2016)10-1165-05