張嚴(yán)高，余　磊，王建莉，尹戴佳佳，朱閩湘

(1.中國人民解放軍南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院療養(yǎng)一科，浙江 杭州 310007;2.浙江大學(xué)免疫研究所，浙江 杭州 310058;3.中國人民解放軍第117醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江 杭州 310013)

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·論著·

地塞米松預(yù)處理及治療對ISO致小鼠急性心肌損傷影響的比較研究

張嚴(yán)高1，余磊2，王建莉2，尹戴佳佳1，朱閩湘3*

(1.中國人民解放軍南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院療養(yǎng)一科，浙江 杭州 310007;2.浙江大學(xué)免疫研究所，浙江 杭州 310058;3.中國人民解放軍第117醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江 杭州 310013)

目的觀察地塞米松(dexamethasone,DEX)對異丙腎上腺素(isoprotereno，ISO)致小鼠急性心肌缺血損傷的影響并探討其作用機(jī)制。方法將16只昆明種小鼠隨機(jī)分成正常對照(control,CON)組4只、ISO組4只、地塞米松預(yù)處理(dexamethasone pretreatment,DEX-pre)組4只、DEX組4只。CON組、ISO組首次處理前30 min給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射預(yù)處理。CON組給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射處理。ISO組給予5 mg/kg ISO，每日腹腔注射1次，連續(xù)3 d。DEX-pre組在首次ISO注射前30 min給予DEX 1.25 mg/kg腹腔注射，余同ISO組。DEX組在第2天、第3天ISO注射30 min后給予DEX 1.25 mg/kg腹腔注射，余同ISO組。在HE染色光鏡下觀察心肌組織的病理學(xué)改變；酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的變化；流式細(xì)胞分析檢測脾臟T細(xì)胞亞群(殺傷性T細(xì)胞即CD4+T細(xì)胞、 抑制性T細(xì)胞即CD8+T細(xì)胞、激活的殺傷性T細(xì)胞即CD4+CD69+T細(xì)胞、激活的抑制性T細(xì)胞即CD8+CD69+T細(xì)胞)變化。結(jié)果①與ISO組比較，DEX-pre組心肌損傷得到明顯改善(P<0.05)，DEX組無明顯變化(P>0.05)。②DEX組TNF-α含量明顯高于CON組、ISO組和DEX-pre組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。③DEX-pre組CD4+T細(xì)胞、CD4+CD69+T細(xì)胞、CD8+CD69+T細(xì)胞與其他3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其他3組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；DEX-pre組CD8+T細(xì)胞低于其他3組，DEX組低于CON組與ISO組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論DEX預(yù)處理對ISO致小鼠急性心肌缺血損傷的心肌具有明顯保護(hù)作用，而損傷后給予DEX治療則無保護(hù)作用。可能機(jī)制與DEX預(yù)處理導(dǎo)致免疫功能改變及炎性細(xì)胞因子改變相關(guān)，確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

心肌缺血；地塞米松；異丙腎上腺素doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.10.011

目前認(rèn)為地塞米松(dexamethasone,DEX)可以通過炎癥信號通路削弱實質(zhì)性臟器缺血-再灌注損傷，這為臨床預(yù)防急性損傷提供了新的選擇和理論支持。進(jìn)一步研究提示削弱炎癥反應(yīng)可減輕急性心肌缺血損傷，且證實DEX等藥物預(yù)處理對心臟缺血-再灌注損傷、腎臟缺血-再灌注損傷等有誘導(dǎo)早期保護(hù)和延遲保護(hù)作用[1-2]。本研究觀察地塞米松預(yù)處理或治療對異丙腎上腺素(isoprotereno，ISO)致小鼠急性心肌缺血損傷影響，旨在探討臨床應(yīng)用的可行性。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器昆明種小鼠：雄性，體質(zhì)量20～22 g，浙江大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號2007000580817，許可證號SCXK(滬)2012-0002。鹽酸異丙腎上腺素注射液：上海禾豐制藥有限公司，產(chǎn)品批號131003。地塞米松磷酸鈉注射液：湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)品批號1408231。流式細(xì)胞儀：美國Becton Dickinso公司。Anti-CD4 FITC antibody：美國Ebioscience公司，克隆號RM4-4，貨號11-0043-85，批號E00087-1632。Anti-CD8a APC antibody：美國Ebioscience公司，克隆號53-6.7，貨號100711，批號B177121。Anti-CD69 PE antibody：美國Ebioscience公司，克隆號H1.2F3，貨號12-0691-83，批號B177121。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)ELISA試劑盒：美國Ebioscience公司，貨號BMS607HS。

1.2動物模型制備與分組采用腹腔注射ISO建立小鼠急性心肌缺血模型。將16只小鼠隨機(jī)分為正常對照(control,CON)組、ISO組、地塞米松預(yù)處理(dexamethasone pretreatment,DEX-pre)組、地塞米松治療(dexamethasone treatment,DEX)組各4只。CON組、ISO組首次處理前30 min給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射預(yù)處理。CON組給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射處理。ISO組給予5 mg/kg ISO，腹腔注射1次/d，連續(xù)3 d。DEX-pre組在首次ISO注射前30 min給予DEX 1.25 mg/kg腹腔注射，余同ISO組。DEX組在第2天、第3天ISO注射30 min后給予DEX 1.25 mg/kg腹腔注射，余同ISO組。第4天各組小鼠用10 g/L戊巴比妥鈉(50 g/kg)麻醉，在超凈臺中進(jìn)行心臟取血后取全心室，并取脾臟。全血以3 500 r/min離心15 min，分離取血清，轉(zhuǎn)置于-20 ℃低溫冰箱保存待測。

1.3心臟組織HE染色取心臟后以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋整個心臟，間斷連續(xù)切片，切片厚約5 μm，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組心肌病理改變。形態(tài)學(xué)計分標(biāo)準(zhǔn)[3]：0級，心肌細(xì)胞排列緊密，橫紋清晰，心肌纖維染色均勻，核居中，間質(zhì)未見血管擴(kuò)張及炎細(xì)胞浸潤，組織間隙無水腫，無出血壞死，心外膜、心內(nèi)膜無異常計0分；Ⅰ級，心肌細(xì)胞排列稀疏，間質(zhì)血管擴(kuò)張及少量炎細(xì)胞浸潤，肌漿分布不勻，心肌間質(zhì)水腫，無出血，可見心肌散在的點(diǎn)狀壞死，主要為凝固性壞死灶，局限在心內(nèi)膜下，計2分；Ⅱ級，部分心肌壞死灶呈片狀分布，灶間無連接，病變累及心壁全層，間質(zhì)可見血管擴(kuò)張及炎細(xì)胞浸潤，有灶性出血，心肌間質(zhì)有炎性出血及心肌間質(zhì)水腫，計4分；Ⅲ級，心肌廣泛性大片壞死，灶間相互連接累及心壁全層，有明顯的間質(zhì)血管擴(kuò)張、水腫、出血及炎細(xì)胞浸潤，計6分。

1.4ELISA檢測TNF-α取低溫冰箱保存血清雙抗體夾心ELISA法檢測血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α的含量變化。

1.5流式細(xì)胞分析剝除小鼠脾臟表面結(jié)締組織被膜后在200目不銹鋼網(wǎng)中輕輕研磨，PBS液洗滌2次后加Tris-NH4Cl液裂解紅細(xì)胞，再洗滌并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/100 μL。取上述各組織單個核細(xì)胞懸液100 μL 加入CD4、CD8、CD69熒光抗體，常規(guī)設(shè)置平行空白對照，4 ℃避光孵育30 min,PBS洗3遍后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，檢測小鼠脾臟單個核細(xì)胞的T細(xì)胞亞群(殺傷性T細(xì)胞即CD4+T細(xì)胞、 抑制性T細(xì)胞即CD8+T細(xì)胞、激活的殺傷性T細(xì)胞即CD4+CD69+T細(xì)胞、激活的抑制性T細(xì)胞即CD8+CD69+T細(xì)胞)在ISO致心肌缺血損傷及使用DEX后的變化情況。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗；等級資料比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1各組心肌組織病理學(xué)改變HE染色顯示：CON組心肌細(xì)胞排列整齊、致密，胞質(zhì)著色均勻，胞核清晰，間質(zhì)細(xì)胞無增生，未見炎性滲出，無水腫(圖1A、E)；ISO組心肌細(xì)胞體積增大呈圓形或類圓形，排列紊亂，細(xì)胞核固縮深染，血管和心肌細(xì)胞之間可見纖維增多、炎性細(xì)胞浸潤、少許淋巴細(xì)胞浸潤，少量紅細(xì)胞外滲，多處見局灶性壞死(肌溶解、核消失或不著色)(圖1B、F)。DEX-pre組心肌損害較ISO組明顯減輕，可見殘存正常肌纖維明顯增多(核圓形、有核仁，胞漿深紅色)，局灶性壞死明顯減少散在的點(diǎn)狀，肌纖維排列紊亂改善，血管和心肌細(xì)胞之間未見纖維增多、炎性細(xì)胞浸潤、淋巴細(xì)胞浸潤(圖1C、G)；DEX組肌纖維間充血水腫明顯，可見殘存少許正常肌纖維，多處見肌溶解、核消失或不著色的局灶性壞死，炎性細(xì)胞浸潤不明顯(圖1D、H)。

各組損傷程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較結(jié)果顯示 ISO組、DEX組與CON組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1光鏡下心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)

A.CON組(HE ×200);B.ISO組(HE ×200);C.DEX-pre組(HE ×200);D.DEX組(HE ×200);E.CON組(HE ×400);F.ISO組(HE ×400);G.DEX-pre組(HE ×400);H.DEX組(HE ×400)

Figure 1The structure of myocardial tissue

表1　各組心肌病理損傷程度比較Table 1　The degree of myocardial injury　，例數(shù))

*P<0.05與CON組比較(秩和檢驗)

2.2各組血清TNF-α含量比較DEX組TNF-α含量明顯高于CON組、ISO組和DEX-pre組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3各組脾臟T細(xì)胞亞群變化DEX-pre組CD4+T細(xì)胞、CD4+CD69+T細(xì)胞、CD8+CD69+T細(xì)胞與其他3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其他3組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。DEX-pre組CD8+T細(xì)胞低于其他3組，DEX組低于CON組和ISO組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2各組血清TNF-α含量比較

組別 TNF-α含量CON組1.58±0.21*ISO組2.35±0.42*DEX-pre組0.42±0.09*DEX組18.73±2.80 F148.993 P0.000

*P<0.05與DEX組比較(SNK-q檢驗)

表3各組脾臟CD4+、CD8+、CD69+T細(xì)胞表達(dá)比較

組別 CD4+T細(xì)胞CD8+T細(xì)胞CD4+CD69+T細(xì)胞CD8+CD69+T細(xì)胞CON組18.50±0.70*#9.66±0.37*#12.10±0.65*6.44±0.32*ISO組15.50±0.90*13.20±0.50*#18.00±0.68*5.89±0.31*DEX-pre組3.90±0.213.55±0.1438.80±1.967.79±0.56DEX組16.00±1.20*9.01±0.36*15.80±1.43*5.37±0.30* F320.215811.337406.10112.016 P0.0000.0000.0000.000

*P<0.05與DEX-pre組比較#P<0.05與DEX組比較(SNK-q檢驗)

3　討　　論

采用腹腔注射ISO是建立小鼠急性心肌缺血的常用模型。連續(xù)注射ISO使心肌中氧化應(yīng)激劇增，導(dǎo)致氧自由基聚集，可使生物膜磷脂在結(jié)構(gòu)與功能方面發(fā)生異常變化，細(xì)胞膜通透性增高，肌漿內(nèi)的可溶性酶大量釋放進(jìn)入血液中，使血清心肌酶水平顯著升高，導(dǎo)致心肌缺血損害[3-4]。糖皮質(zhì)激素通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育、自身穩(wěn)定和細(xì)胞凋亡來維持機(jī)體組織細(xì)胞的平衡及其功能， 而且糖皮質(zhì)激素具有抗炎等作用。以往研究表明DEX預(yù)處理可使缺血-再灌注后心肌損傷程度明顯減輕，減少炎癥因子單核細(xì)胞趨化因子1、TNF-α的表達(dá)，使炎癥控制在一定的水平[5]。本研究探索DEX預(yù)處理及治療對急性心肌缺氧損傷效應(yīng)，并研究細(xì)胞因子TNF-α及T細(xì)胞亞群變化(CD4+、CD8+、CD69+)發(fā)揮的作用，旨在為DEX在不穩(wěn)定性冠心病，尤其是急性心肌梗死超早期臨床應(yīng)用提供依據(jù)。本研究ISO損傷后心肌局灶性壞死明顯，給予DEX預(yù)處理心肌損害明顯減輕，給予DEX治療心肌損害無明顯改變，證實DEX預(yù)處理對ISO致小鼠急性心肌缺血損傷的心肌具有明顯保護(hù)作用，而損傷后給予DEX治療則無保護(hù)作用。

TNF-α不僅是有效的腫瘤殺傷因子，還是重要的前炎性細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中有很重要的作用。在心肌受損和超負(fù)荷時，心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中TNF-α等炎癥調(diào)節(jié)因子表達(dá)上調(diào)[6]；臨床觀察研究提示冠心病患者血清TNF-α水平明顯高于正常人，而且隨病情的加重而升高，且TNF-α在急性心肌梗死發(fā)病早期即可明顯升高，檢測TNF-α對急性心肌梗死早期診斷具有重要意義[7-9];另外， TNF-α水平的升高與心肌功能抑制有明顯的相關(guān)性[10]，而在阿托伐他汀治療急性腦梗死中升高的TNF-α下降更為明顯[11]。本研究顯示ISO損傷后TNF-α明顯升高與上述一致，說明血清TNF-α與急性心肌缺氧損傷有一定相關(guān)性。進(jìn)一步血清TNF-α含量檢測顯示經(jīng)DEX預(yù)處理，ISO導(dǎo)致TNF-α有下降，與以往DEX對小鼠心肌缺血-再灌注損傷、腎缺血-再灌注損傷、腦出血大鼠腦水腫引起TNF-α水平改變的報道相符[12]；且經(jīng)DEX預(yù)處理TNF-α低于CON,可能DEX預(yù)處理在ISO導(dǎo)致心肌損傷中抑制TNF-α等炎性細(xì)胞因子作用比心肌缺血-再灌注損傷更明顯，其更有實用性。在ISO導(dǎo)致?lián)p傷后給予DEX治療TNF-α反之明顯升高，說明DEX治療無明顯得益。因此，認(rèn)為DEX預(yù)處理對ISO所致小鼠心肌缺血明顯的保護(hù)作用中TNF-α水平的改變發(fā)揮重要的作用。可能的機(jī)制：TNF-α是強(qiáng)有力的促炎癥細(xì)胞因子，降低炎癥暴發(fā)，使炎癥控制在一定的水平，可減輕心肌缺血損傷；DEX預(yù)處理還可有抗凋亡等作用，減輕心肌缺血損傷。 在急性心肌缺血缺氧損傷中，DEX預(yù)處理可誘導(dǎo)早期保護(hù)和延遲保護(hù)作用， 尤其后者保護(hù)時間長而更具潛在的實用價值，較長時間處于一種預(yù)處理的保護(hù)狀態(tài)，為其臨床應(yīng)用的意義。

CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞都是炎性T細(xì)胞，通過分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，起到誘導(dǎo)和輔助細(xì)胞及體液免疫的作用。CD69是T淋巴細(xì)胞激活后最早表達(dá)的表面抗原，已有大量研究表明，CD69的表達(dá)可以抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡的功能。CD69可作為細(xì)胞的活化標(biāo)記物,當(dāng)其表達(dá)后，可作為共刺激信號促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)一步活化和增殖，且CD69的表達(dá)與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[13]。研究表明，CD69分子在急性腦梗死發(fā)生的早期(72 h之內(nèi))表達(dá)顯著增高，且在發(fā)病的第7天仍然高表達(dá)，活化的T細(xì)胞以多種形式損傷血腦屏障，參與疾病的發(fā)展過程[14]；通過應(yīng)用外源性生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8的表達(dá)水平可以輔助免疫治療[15]；心肌組織中存在肌源性干細(xì)胞，且功能受損的心肌應(yīng)用成肌細(xì)胞等肌源性細(xì)胞移植到心臟可生成大量心肌細(xì)胞，并促進(jìn)周圍血管、神經(jīng)再生，幾乎不觸發(fā)受植區(qū)的免疫反應(yīng)[16]。均提示免疫調(diào)節(jié)在心肌損傷中發(fā)揮一定作用。本研究結(jié)果顯示DEX-pre組CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞明顯下降，并CD4+CD69+T細(xì)胞、CD8+CD69+T細(xì)胞明顯增高，病理示炎性細(xì)胞浸潤減少，說明經(jīng)DEX預(yù)處理后，免疫功能明顯被雙重抑制，可能對損傷心肌細(xì)胞起到重要保護(hù)作用。DEX組CD8+T細(xì)胞有所下降， 而CD4+T細(xì)胞、CD8+CD69+T細(xì)胞、CD8+CD69+T細(xì)胞無明顯改變，沒有出現(xiàn)相似保護(hù)作用。證實CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和早期激活的T細(xì)胞(CD4+CD69+T細(xì)胞、CD8+CD69+T細(xì)胞)可能共同參ISO對心肌細(xì)胞損傷過程，CD4+T細(xì)胞、CD4+CD69+T細(xì)胞作用更為重要。DEX預(yù)處理對ISO損傷心肌保護(hù)作用可能與 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞雙重抑制，以及TNF-α等炎性細(xì)胞因子明顯抑制協(xié)同作用密切有關(guān)；而DEX治療不產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞雙重均衡抑制， TNF-α等炎性細(xì)胞因子反而明顯增高，所以也就不產(chǎn)生這種保護(hù)作用。因此，推斷DEX預(yù)處理對免疫功能與炎性細(xì)胞因子的改變是其對心肌缺血缺氧保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

綜上所述，在ISO所致急性心肌細(xì)胞缺血損傷中，DEX預(yù)處理可以明顯改善心肌損傷,而給予DEX治療則沒有這種保護(hù)作用，其相關(guān)機(jī)制可能與DEX預(yù)處理導(dǎo)致T細(xì)胞亞群介導(dǎo)免疫應(yīng)答功能改變和TNF-α等細(xì)胞因子的變化有關(guān)，這為DEX預(yù)處理治療方法在不穩(wěn)定性冠心病，尤其是急性心肌梗死超早期中的應(yīng)用提供了依據(jù)。其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：劉斯靜)

A comparative study on the effects of dexamethasone pretreatment and treatment on acute myocardial injury induced by isoproterenol in mice

ZHANG Yan-gao1， YU Lei2, WANG Jian-li2, YIN Dai-jia-jia1, ZHU Min-xiang3*

(1.The First Department of Sanatorium, Hangzhou Sanatorium of Nangjing Military Area Command,Zhejiang Province, Hangzhou 310007, China; 2.Institute of Immunology, Medicine School of Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 3.Department of Neurosurgery,117 Hospital of PLA, Zhejiang Province, Hangzhou 310013, China)

ObjectiveTo investigate the potential protective effect of glucocorticoid receptor agonist dexamethasone on isoproterenol(ISO)-induced myocardial injury and the possible mechanism. MethodsThe sixteen mice were randomly divided into control(CON) group(n=4)， ISO group(n=4), dexamethasone pretreatment(DEX-pre) group(n=4) and dexamethasone treatment(DEX) group(n=4). The mice in CON group and ISO group were given the same amount of 0.9% sodium chloride and DEX-pre group given dexamethasone(1.25 mg/kg) injection by intraperitoneal injection as a pretreatment at 30 minutes before treatment. CON group was given the same amount of 0.9% sodium chloride injection by intraperitoneal injection; ISO group, DEX-pre group and DEX group received 5 mg/kg isoproterenol hydrochloride, daily intraperitoneal injection of 1time, for 3 consecutive days. At the second and third day, dexamethasone(1.25 mg/kg) was given after ISO injected for 30 minutes in DEX group. Myocardial tissue injury was assessed by HE staining. Flow cytometry was adopted to detect the expression of CD4+T， CD8+T， CD4+CD69+T， CD8+CD69+T cells in spleen. Results①Compared with ISO group， the degree of myocardial injury were greatly improved(P<0.05); the degree of myocardial injury wasn't significantly difference in DEX group(P>0.05). ②The expression of TNF-α in serum in DEX group was significantly difference to the other group(P<0.05). ③The expression 0f CD4+T， CD4+CD69+T， CD8+CD69+T cells in DEX-pre group was significantly difference to the other group(P<0.05). The expression of CD8+T cells in DEX-pre group was significantly reduced to the other group(P<0.05). The expression of CD8+T cells in DEX group was significantly reduced to the control group and ISO group(P<0.05). ConclusionDEX pretreatment has protective effect against ISO-induced myocardial injury. But dexamethasone treatment don't have protective effect after injury. The mechanism might be the related with the changes of immune function and changes of inflammatory cytokines. The exact mechanism remains to be further studied.

myocardial ischemia; dexamethasone; isoproterenol

2015-08-07；

2015-12-01

張嚴(yán)高(1964-)，男，浙江東陽人，中國人民解放軍

。E-mail:hzlyylkzyg@163.com

R452.2

A

1007-3205(2016)10-1157-05

南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院主任醫(yī)師，從事老年心血管疾病診治及療養(yǎng)保

健研究。