米爾扎提·麥麥提，爾西丁·買買提，喀日耶姆·艾海提，艾爾肯·依不拉音

(新疆醫(yī)科大學(xué)1公共衛(wèi)生學(xué)院；2藥學(xué)院；3中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊　830011)

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·藥學(xué)研究·

正交試驗(yàn)優(yōu)化逆三相膜萃取煙堿的工藝研究

米爾扎提·麥麥提1，爾西丁·買買提1，喀日耶姆·艾海提2，艾爾肯·依不拉音3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1公共衛(wèi)生學(xué)院；2藥學(xué)院；3中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830011)

目的優(yōu)化逆三相膜萃取煙葉中煙堿的提取工藝。方法采用聚四氟乙烯膜(PTFE)作為萃取膜,硫酸溶液作為酸相、氫氧化鈉溶液作為堿相、氯仿作為有機(jī)相的逆三相膜萃取循環(huán)系統(tǒng)萃取煙堿葉中煙堿。依據(jù)煙堿在261 nm處有特征吸收，采用紫外分光光度計(jì)檢測煙堿葉中游離煙堿的含量。以煙堿萃取率為指標(biāo),考察酸濃度、堿濃度、循環(huán)時間、酸堿水相及有機(jī)相體積比和流速5個因素,選定最佳工藝。結(jié)果提取煙葉中煙堿的最佳提取工藝條件為：酸濃度0.01%，堿濃度5%，循環(huán)時間25 min，體積比(酸堿相∶有機(jī)相)2.5∶1，流速6 mL/min，煙堿的提取率達(dá)到99.07%。對正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。按最佳工藝進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示煙堿提取率均值達(dá)到99.01%。結(jié)論該工藝操作簡單，萃取時間快，有機(jī)溶劑的消耗量少，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，環(huán)境污染少，適用于煙葉中煙堿的提取。

逆三相膜萃??；分光光度法；煙堿；正交設(shè)計(jì)

煙堿(俗稱尼古丁)的化學(xué)名稱為1-甲基-2(2-吡啶基)吡啶烷，屬天然煙葉中含有的一種特殊生物堿。因煙堿化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，通常在工業(yè)生產(chǎn)上用稀硫酸吸收制成硫酸煙堿[1-2]。近年來,隨著農(nóng)業(yè)、化工、醫(yī)藥和煙草業(yè)等領(lǐng)域的迅速發(fā)展,市場上對天然煙堿的需求量與日俱增,因此從廢棄煙草中提取煙堿具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。從煙葉中提取煙堿的研究已受到學(xué)者的關(guān)注[3]。目前從煙葉中提取煙堿的常用方法有溶劑萃取法[4]、超臨界萃取法[5]、水蒸氣蒸餾法[6]、離子交換法[7]、超聲輔助酶法[8]等。蒸餾萃取法是較早應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的提取方法。采用二次萃取蒸餾法可從廢次煙葉中得到了純度較高的煙堿，但該方法操作步驟復(fù)雜,萃取時間較長。離子交換法是將原料用稀酸浸提,加熱回流后,使濾液流經(jīng)離子交換樹脂,然后用堿交換得到游離煙堿的水溶液。該方法雖耗能較低,但仍存在離子交換樹脂的預(yù)處理及再生較為繁瑣的缺點(diǎn)。采用超臨界CO2萃取法萃取煙葉中的煙堿,可獲得較好的提取效率,但是該方法的設(shè)備成本較高,不利于普及和推廣。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了逆三相膜萃取煙葉中煙堿的提取工藝，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試劑

1.1儀器紫外分光光度計(jì)(日本島津，UV-2550)，JJ-1增力電動攪拌器(金壇市醫(yī)療機(jī)械廠)，水泵(日本島津PRR-2A)，聚四氟乙烯膜(鎮(zhèn)江瑞思高分子材料有限公司),125 mL分液漏斗，250 mL三頸瓶。

1.2試劑氫氧化鈉(天津永晟精細(xì)化工有限公司GB/T646-2011)，硫酸(西安化學(xué)試劑廠)，氯仿(天津市富鑫商貿(mào)有限公司)，尼古丁標(biāo)準(zhǔn)品(Augsburg Germany)濃度為0.005 mg/mL，其他試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

2　方法與結(jié)果

2.1煙堿的萃取方法取2個250 mL的三頸瓶分別標(biāo)記為A和B。在B瓶中加入100 mL的硫酸溶液(0.01 mol/L)和40 mL氯仿。在A瓶中加入0.005 mg/mL的煙堿溶液1 mL和5%氫氧化鈉溶液100 mL，攪拌5 min,使充分混勻，再在A瓶中加入40 mL氯仿。將分離膜裝置插入到A和B 2個三頸瓶中(250 mL)。2個瓶中溶液同時開始攪拌并啟動循環(huán)泵循環(huán)有機(jī)相(氯仿6 mL/min)，萃取一定時間后，A瓶中的煙堿會從A瓶中的堿性水相萃取到有機(jī)相，有機(jī)相通過分離膜和循環(huán)泵轉(zhuǎn)移到三頸瓶B中。在攪拌的B瓶中，有機(jī)相中的煙堿轉(zhuǎn)移至酸性水相。循環(huán)25 min后，A瓶中煙堿絕大部分會轉(zhuǎn)移至B瓶中，最終將煙堿幾乎完全萃取到酸性水相中，見圖1。

A：堿性水相；B：酸性水相；S：PTFE膜；M：攪拌器；P：循環(huán)泵

圖1逆三相膜萃取系統(tǒng)裝置圖

2.2檢測波長的選擇以氫氧化鈉溶液為空白溶劑，對尼古丁標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外-可見光譜掃描，煙堿在261 nm處有最大吸收，因此將261 nm作為測定煙堿含量的檢測波長。

2.3煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別稱取煙堿標(biāo)準(zhǔn)品0.625、1.250、1.875、2.500、3.125、3.750、4.375 mL于25 mL棕色容量瓶中，加入0.01 mol/L硫酸溶液定容至25 mL，超聲3 min，配置成0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，在261 nm處測定吸光度。以煙堿濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程:Y=17.923X+ 0.010 7，線性范圍:5～35 μg/mL，r=0.999 1。

2.4單因素試驗(yàn)以煙堿葉中煙堿萃取率為衡量指標(biāo)，分別考察堿濃度、循環(huán)時間、酸濃度、體積比(酸堿相∶有機(jī)相)和流速5個因素。初步確定煙堿萃取的適宜水平范圍：酸濃度0.01%，循環(huán)時間25 min，體積比(酸堿相∶有機(jī)相)2.5∶1，流速6 mL/min時，堿濃度5%。

2.5正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5.1影響因素與水平[9-11]根據(jù)單因素(A酸濃度、B堿濃度、C循環(huán)時間、D體積比、E流速)試驗(yàn)結(jié)果，確定正交實(shí)驗(yàn)需考察各影響因素的水平。采用L16(45)正交試驗(yàn),對逆三相膜提取工藝初步進(jìn)行優(yōu)選，見表1。

表1　L16(45) 正交試驗(yàn)因素水平表(n=3)

2.6單因素試驗(yàn)

2.6.1堿濃度對煙堿萃取率的影響考慮堿濃度對萃取煙堿效果的影響時，在酸濃度至0.01%、循環(huán)時間25 min、體積比(酸堿相∶有機(jī)相)2.5∶1、流速為 6 mL/min時，在堿濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%及9%進(jìn)行試驗(yàn)。相應(yīng)的煙堿提取率為13.10%、16.70%、 28.01%、40.87%、61.03%、54.82%、48.70%、18.01 %?？梢钥闯鰤A濃度在5 %時效果最好。

2.6.2循環(huán)時間對煙堿萃取率的影響當(dāng)堿濃度5%、酸濃度0.01%、體積比(酸堿相：有機(jī)相)2.5∶1、流速為6 mL/min時，在本試驗(yàn)條件下分別以不同時間(5、10、15、20、25、30、35、40 min)的萃取時間進(jìn)行試驗(yàn)。相應(yīng)的煙堿提取率為13.01%、24.03%、51.76%、83.34%、94.47%、95.56%、96.01%、97.34%。隨著處理時間的延長，煙堿萃取率逐漸增大，25 min后，萃取率變化不明顯，故選取25 min為合適的萃取時間。

2.6.3酸濃度對煙堿萃取率的影響以不同酸濃度(0.0025、0.005、0.01、0.015、0.02、0.025%) 進(jìn)行試驗(yàn)，在堿濃度5%、循環(huán)時間25 min、體積比(酸堿相∶有機(jī)相)2.5∶1、流速為6 mL/min時，相應(yīng)的煙堿提取率為47.53%、63.00%、81.76%、72.00%、64.21%、51.00%。當(dāng)酸濃度0.01%時,煙堿的萃取率達(dá)到最高．所以選取0.01%酸濃度為最佳的萃取濃度。

2.6.4體積比(酸堿相∶有機(jī)相)對煙堿萃取率的影響以不同體積比(0.5∶1、1∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1) 進(jìn)行試驗(yàn)，在堿濃度5%、酸濃度0.01%、循環(huán)時間25 min、流速為6 mL/min時，相應(yīng)的煙堿提取率為30.34%、35.50%、41.43%、47.75%、37.00%、26.49%。體積比在0.5∶1～2.5∶1范圍內(nèi)，煙堿煙葉的萃取率隨萃取劑用量的增大而增加，當(dāng)體積比為2.5∶1時煙堿的萃取率達(dá)最高值，之后再增大萃取劑用量，萃取率有下降。這是由于體積比為2.5∶1時，煙堿的溶解已基本達(dá)飽和，故體積比控制在2.5∶1為最宜。

2.6.5流速對煙堿萃取率的影響當(dāng)堿濃度5%、酸濃度0.01%、體積比(酸堿相:有機(jī)相)2.5∶1，循環(huán)時間25 min時，在本試驗(yàn)條件下分別以不同流速(1.5、3、4.5、6、7.5 mL/min)進(jìn)行試驗(yàn)，隨著煙堿萃取流速的提高，煙堿的萃取率先明顯增大。相應(yīng)的煙堿提取率為26.70%、51.09%、82.90%、99.27%、83.00%。在6 mL/min時萃取率達(dá)最佳值，之后煙堿萃取率開始下降。這可能是因?yàn)檫m度升速有利于煙堿的擴(kuò)散和浸出，萃取率增加，但流速過高煙堿結(jié)構(gòu)可能會被破壞，萃取率下降。因此，選擇煙堿萃取流速6 mL/min適宜。

2.7正交試驗(yàn)各因素對提取率的影響順序?yàn)?A>E>B>C>D,即酸濃度>流速>堿濃度>循環(huán)時間>體積比,其中最佳提取工藝條件為A3B4C2D1E3,即酸濃度0.01%、堿濃度5 %、循環(huán)時間25 min、體積比2.5∶1、流速6 mL/min。結(jié)果顯示,在最佳工藝條件下提取物中煙堿提取率均高于其他各試驗(yàn)組合,煙堿平均提取率為99.07%,見表2。

表2　L16(45) 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析表

F值的顯著性概率(Sig.)為0.000,<0.05為達(dá)到顯著性水平,說明煙堿提取量和各因素之間存在極顯著的關(guān)系。由方差分析可知，對煙堿提取率影響最顯著者為因素A，其次為因素E，再次為因素B、因素C、因素D。綜合直觀分析和方差分析,煙堿最佳提取工藝組合為A3B4C2D1E3,即酸濃度0.01%、堿濃度5%、循環(huán)時間25 min、體積比(酸堿相和有機(jī)相)2.5∶1、流速6 mL/min，見表3。

表3　方差分析表

2.8重復(fù)性試驗(yàn)按最優(yōu)組合條件重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn),煙堿的提取率分別為99.27%、99.07%、98.69%，平均提取率為99.01%,表明該方法具有良好的提取效果和重現(xiàn)性。

3　討論

逆三相液膜萃取處理法進(jìn)行提取,得到的提取液直接進(jìn)行紫外-可見分光光度法測定含量,計(jì)算萃取率。這種提取方法有提高萃取率、減少萃取時間、有機(jī)溶劑可以重復(fù)使用、環(huán)境污染極少等優(yōu)點(diǎn)。煙堿屬于吡啶類生物堿[12-13]，易與無機(jī)酸和多種有機(jī)酸結(jié)合，分離出游離態(tài)的煙堿，根據(jù)游離態(tài)煙堿在不同溶劑中溶解狀態(tài)和性質(zhì)存在差異對煙堿進(jìn)行萃取。本研究運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，采用L16(45)正交表進(jìn)行煙堿萃取試驗(yàn)條件優(yōu)化，確定煙堿萃取的最佳工藝。逆三相液膜萃取法提取煙堿，方法簡便，操作簡單，對煙堿的提取開發(fā)利用具有重要的意義。

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(本文編輯施洋)

Research on optimization reverse phase membrane extraction of nicotine with orthogonal method

Mirzat Maimaiti1，Erxiding Maimaiti1，Kariyemu Aihaiti2，Arkin Iburaim3

(1College of Pubilic Health；2College of Pharmacy；3Central Laboratory，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011,China)

ObjectiveTo optimize extraction process of nicotine from tobacco leaves by reverse phase membrane.MethodsUsing PTFE membrane as extraction membrane,sulfuric acid solution as acid,sodium hydroxide solution as the alkali phase,chloroform as organic phase,the extraction of nicotine from nicotine leaves was carried out by reverse phase membrane extraction and circulation system.According to the characteristics of nicotine on 261 nm UV absorption,UV spectrophotometer was used to determine free nicotine content in nicotine leaves.The orthogonal design optimization of 5 factors and 4 levels L16(45) was investigated,nicotine extraction rate as the index,inspection concentration of acid,alkali concentration,cycle time,acid and alkali phase and organic phase volume ratio and flow rate on the influence of the nicotine extraction.ResultsThe best extraction conditions of extracting nicotine in tobacco leaf are acid concentration 0.01%,alkali concentration 5%,cycle time 25 min,volume ratio (acid-base phase:organic phase) 2.5∶1,the velocity 6 mL/min.The nicotine extraction rate reached 99.07%.Orthogonal test data statistical analysis expressed (P<0.05),which has significant differences.Repeated experiments were carried out three times under the best extraction conditions.The optimal combination of repetitive experimental results showed that the average nicotine extraction rate reached 99.01%.ConclusionThe process is simple,and extraction time is short,and consumption of organic solvent is low.It is easy to realize industrialization with less pollution and suitable for the extraction of nicotine from tobacco.

Reverse phase membrane extraction; Spectrophotometric method; nicotine; orthogonal design; extract

國家自然科學(xué)基金(21162030)

米爾扎提·麥麥提(1989-)，男(維吾爾族)，在讀碩士，研究方向：統(tǒng)計(jì)學(xué)。

爾西丁·買買提，男(維吾爾族)，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)，E-mail:624799002@qq.com。

通信作者：艾爾肯·依不拉音，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥物分析，E-mail:arkinxyd@sina.com。

R94

A

1009-5551(2016)11-1436-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.11.022

2016-06-12]