邵向陽(yáng) 徐偉文

·述評(píng)·

下一代測(cè)序（NGS）技術(shù)的發(fā)展及在腫瘤研究的應(yīng)用

邵向陽(yáng) 徐偉文★

下一代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）由于高靈敏度、高通量、高度自動(dòng)化等特性，近年來(lái)在疾病的研究和診斷治療中越來(lái)越多地被應(yīng)用。下一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為腫瘤分子生物學(xué)的研究提供了新的手段。本文就下一代測(cè)序技術(shù)的種類、特點(diǎn)、發(fā)展趨勢(shì)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用作簡(jiǎn)要的綜述。

下一代測(cè)序（NGS）；腫瘤；精準(zhǔn)醫(yī)療

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人類對(duì)生命現(xiàn)象和疾病的研究已經(jīng)不再局限在單個(gè)基因位點(diǎn)，而是將目光集中于全基因組方面。Sanger測(cè)序法是科學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)室里首選的測(cè)序金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)［1］，人類基因組計(jì)劃就是依靠Sanger測(cè)序法才得以完成的［2］。隨著技術(shù)革新，DNA測(cè)序技術(shù)得到了不斷的創(chuàng)新，在保證測(cè)序準(zhǔn)確度的前提下，逐步優(yōu)化操作程序，使得測(cè)序速度逐漸提高，測(cè)序成本也呈下降趨勢(shì)，下一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）就應(yīng)運(yùn)而生，并在隨后得到突破性進(jìn)展?！禢ature Methods》在2007年評(píng)選的生物領(lǐng)域影響力最大的技術(shù)中，NGS技術(shù)以高票當(dāng)選［3］。與Sanger測(cè)序技術(shù)不同，NGS技術(shù)通過(guò)反復(fù)測(cè)序同一區(qū)域的DNA片段，達(dá)到更高的靈敏度和準(zhǔn)確度，同時(shí)通量高、自動(dòng)化程度高，可在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)上百億堿基的測(cè)序［4］，使得在幾天內(nèi)完成人類全基因組測(cè)序成為可能［5-7］。也正因?yàn)镹GS技術(shù)的高準(zhǔn)確度、高速度以及低成本，對(duì)推動(dòng)分子生物學(xué)的發(fā)展起到了重要作用，為腫瘤分子生物學(xué)的研究提供了新的手段，尤其在腫瘤分子診斷領(lǐng)域更是占有更重要的地位。

1 二代測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介及特點(diǎn)

2005年世界上首臺(tái)新一代測(cè)序儀問(wèn)世，并且很快就被應(yīng)用到了如火如荼的分子生物學(xué)領(lǐng)域當(dāng)中。NGS技術(shù)，并不是某種單一的技術(shù)，而是一個(gè)技術(shù)群。不同的NGS平臺(tái)，在其原理上有所不同?；镜脑矶际窃贒NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，借助一些化學(xué)標(biāo)志物在堿基插入DNA鏈時(shí)發(fā)出的信號(hào)來(lái)讀取序列信息，信號(hào)可以是光信號(hào)，也可以是H+流信號(hào)（H ion fluxes）。

1.1 Roche/454［5］

454公司開(kāi)創(chuàng)了邊合成邊測(cè)序的先河，后期又推出了GSFLX系統(tǒng)，主要采用焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）原理（圖1［8］）。

GS FLX系統(tǒng)的流程概括起來(lái)，就是“一個(gè)片段=一個(gè)磁珠=一條讀長(zhǎng)（one fragment=one bead= one read）”。“一個(gè)片段=一個(gè)磁珠”是指長(zhǎng)度為300～800 bp的DNA片段與接頭（3’和5’端具有特異性）連接，帶有接頭的單鏈DNA片段構(gòu)成樣本文庫(kù)，特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠固定單鏈DNA文庫(kù)，每一個(gè)磁珠只能與一種獨(dú)特的單鏈DNA片段結(jié)合。隨后把結(jié)合DNA片段的磁珠和PCR擴(kuò)增試劑的水溶液注入到礦物油中，形成油包水混合物，這樣就形成只包含一個(gè)結(jié)合DNA片段的磁珠和PCR擴(kuò)增試劑的微反應(yīng)器。乳液PCR在各自的微反應(yīng)器里獨(dú)立擴(kuò)增，排除其他污染性和競(jìng)爭(zhēng)性的影響。每一個(gè)片段經(jīng)擴(kuò)增后產(chǎn)生幾百萬(wàn)個(gè)相同的拷貝，乳液混合物被打破后，擴(kuò)增片段仍結(jié)合在磁珠上。“一個(gè)磁珠=一條讀長(zhǎng)”是指將捕獲DNA的磁珠放入PTP板中進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，PTP板只能容納一個(gè)磁珠。將PTP板放在GS FLX中4種堿基依次按照T、A、C、G的順序循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì)就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸，這個(gè)焦磷酸在ATP硫酸化酶（adenosine triphosphate-sulfurylase）和熒光素酶的作用下，經(jīng)反應(yīng)，最終把熒光素氧化形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生光信號(hào)，被電荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）光學(xué)系統(tǒng)捕捉一個(gè)特異的檢測(cè)峰值，依據(jù)峰值即可讀出準(zhǔn)確的DNA序列信息［9］。每個(gè)磁珠都產(chǎn)生一條讀長(zhǎng)，通過(guò)GSFLX系統(tǒng)分析，最后得出樣本的DNA序列信息。

焦磷酸測(cè)序法的準(zhǔn)確率在99％以上。主要錯(cuò)誤類型是插入-缺失，而不是替換，是因?yàn)橄嗤瑝A基的連續(xù)插入，沒(méi)有終止原件阻止單個(gè)循環(huán)的連續(xù)插入，相同堿基的長(zhǎng)度需從信號(hào)強(qiáng)度中推斷出來(lái)，在這過(guò)程就可能產(chǎn)生誤差。

1.2 Illumina/Solexa［10］

Illumina公司的二代測(cè)序儀Genome Analyzer最早是由Solexa公司研發(fā)的，其核心專利技術(shù)是“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)（reversible terminator）”。其原理（圖2［8］）是：將基因組DNA經(jīng)超聲波打斷成幾百bp甚至更小的片段；然后進(jìn)行末端修復(fù)補(bǔ)平加堿基A；再加上接頭（adapter）制備成文庫(kù)。將樣本文庫(kù)加入到專利的芯片（flowcell）上，芯片表面種植了通過(guò)共價(jià)鍵鏈接2種與接頭互補(bǔ)的寡核苷酸引物。文庫(kù)經(jīng)變性變成單鏈，其一端與芯片一種引物結(jié)合固定，另一端隨機(jī)與附近的另一個(gè)寡核苷酸引物互補(bǔ)固定，形成單鏈橋狀結(jié)構(gòu)；并且以周圍的寡核苷酸引物為擴(kuò)增引物，在芯片上進(jìn)行擴(kuò)增，形成2條鏈。雙鏈再次變性成單鏈，繼續(xù)上述PCR過(guò)程擴(kuò)增，這就是所謂的橋式PCR擴(kuò)增。連續(xù)重復(fù)上述過(guò)程，待測(cè)DNA數(shù)量就會(huì)以指數(shù)方式增長(zhǎng)，形成DNA簇?！翱赡嫘阅┒私K結(jié)”是指在測(cè)序過(guò)程中，使用“可逆終止子”進(jìn)行邊合成邊測(cè)序?！翱赡娼K止子”是帶有熒光標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP），但在3′-羥基端帶有可被化學(xué)切割的基團(tuán)，這些基團(tuán)能夠封閉dNTP的3′端黏性，阻止另一個(gè)dNTP與之相結(jié)合。使得每一步反應(yīng)只能延伸一個(gè)堿基，采集完熒光信號(hào)，熒光基團(tuán)去除，封閉基團(tuán)被去掉，進(jìn)行下一步反應(yīng)，每步收集的熒光信號(hào)，對(duì)應(yīng)所檢測(cè)的序列。如此反復(fù)，得出片段的精確序列。

Genome Analyzer測(cè)序原理采用穩(wěn)定的可逆終止法邊合成邊測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)使用4種含有末端阻斷基團(tuán)和不同熒光信號(hào)的堿基進(jìn)行模板互補(bǔ)鏈的合成，不僅確保了測(cè)序的高精確性和高順序性，而且排除了由重復(fù)序列和同聚物導(dǎo)致的測(cè)序錯(cuò)誤。

1.3 Life/SOLiD［11］

SOLiD應(yīng)用連接法測(cè)序，同時(shí)利用了獨(dú)特的雙堿基編碼原理。以連接反應(yīng)代替了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。SOLiD測(cè)序在文庫(kù)構(gòu)建和PCR擴(kuò)增方面，與GS FLX系統(tǒng)很類似，都是通過(guò)磁珠接頭捕獲待測(cè)DNA片段，然后進(jìn)行乳液PCR。SOLiD的磁珠只有1μm，比GS FLX系統(tǒng)的磁珠小的多。SOLiD連接反應(yīng)的底物是長(zhǎng)度8 bp的特殊單鏈熒光探針，其3’端第1、2位構(gòu)成的堿基對(duì)是表征探針染料類型的編碼區(qū)，5’末端被標(biāo)記4種熒光染料，因此不同的序列組合就被標(biāo)記上不同的熒光基團(tuán)。單向SOLiD測(cè)序包括5輪測(cè)序反應(yīng)，每輪反應(yīng)由多個(gè)連接反應(yīng)構(gòu)成，探針與測(cè)序引物相鄰近的序列雜交，用顏色判斷堿基序列，讀取信號(hào)。然后通過(guò)化學(xué)方法在第5和第6位之間切割，把熒光信號(hào)淬滅，以進(jìn)行下個(gè)位置的測(cè)序。第一次連接反應(yīng)實(shí)際上連接上了5個(gè)堿基，通過(guò)這種方法，每次測(cè)序的位置都相差5位，即第一次測(cè)1和2位，第2次測(cè)6和7位……在測(cè)到末尾后，依次類推，進(jìn)行第2輪連接反應(yīng)；由于第2輪測(cè)序比第一輪測(cè)序往前移動(dòng)了一個(gè)堿基，得到0～1位、5～6位……的熒光信息，5輪反應(yīng)后，測(cè)出全部位置并且每個(gè)位置都被檢測(cè)了2次。

SOLiD測(cè)序技術(shù)在測(cè)序過(guò)程利用了獨(dú)特的雙堿基編碼原理，能對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤進(jìn)行校正，減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤。以連接反應(yīng)代替了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)能明顯減少因堿基錯(cuò)配而出現(xiàn)的錯(cuò)誤，在測(cè)序過(guò)程中更換引物也能減少背景噪音和錯(cuò)誤率。目前SOLiD系統(tǒng)聲稱其原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94％，而且SOLiD 4系統(tǒng)將再度升級(jí)。SOLiD 4 HQ package將使每次運(yùn)行產(chǎn)生300GB可定位的序列數(shù)據(jù)，并帶來(lái)99.99％的準(zhǔn)確率［12］。

1.4 Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)

Ion Torrent的核心技術(shù)是使用半導(dǎo)體技術(shù)在化學(xué)和數(shù)字信息之間建立直接的聯(lián)系。Ion torrent的基本原理是：把DNA鏈固定在半導(dǎo)體芯片的微孔中，隨后依次摻入ACGT堿基。隨著每個(gè)堿基的摻入，釋放出氫離子，在它們穿過(guò)每個(gè)孔底部時(shí)能被檢測(cè)到，通過(guò)對(duì)H+的檢測(cè)，實(shí)時(shí)判讀堿基。具體過(guò)程是：將待測(cè)DNA片段2端加上Ion Torrent測(cè)序接頭制備成DNA文庫(kù)。將文庫(kù)克隆到離子微球顆粒上并進(jìn)行乳液PCR擴(kuò)增。將含有擴(kuò)增模板的離子微球顆粒加入到半導(dǎo)體芯片上，測(cè)序時(shí)一個(gè)個(gè)堿基連續(xù)流過(guò)芯片微孔。如果堿基與特定微孔中的DNA分子互補(bǔ)，則該堿基被合成到DNA分子中，DNA鏈每延伸一個(gè)堿基時(shí)，就會(huì)釋放一個(gè)質(zhì)子（H+），導(dǎo)致局部pH發(fā)生變化。離子傳感器檢測(cè)到pH變化后，即刻便從化學(xué)信息轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字電子信息。如果DNA鏈含有2個(gè)相同的堿基，則記錄電壓信號(hào)是雙倍的。如果堿基不匹配，則無(wú)H+釋放，也就沒(méi)有電壓信號(hào)的變化。

Ion Torrent測(cè)序技術(shù)直接檢測(cè)DNA的合成，因少了CCD掃描、熒光激發(fā)等環(huán)節(jié)，幾秒鐘就可檢測(cè)合成插入的堿基，大大縮短了運(yùn)行時(shí)間。通過(guò)對(duì)H+的檢測(cè)，明顯改善堿基判讀準(zhǔn)確性，測(cè)序成本低；該系統(tǒng)無(wú)需光學(xué)檢測(cè)和掃描系統(tǒng)，無(wú)需標(biāo)記熒光染料和化學(xué)發(fā)光的配套試劑，技術(shù)的讀長(zhǎng)相對(duì)較短。但若單個(gè)堿基連續(xù)重復(fù)出現(xiàn)多次，會(huì)導(dǎo)致一個(gè)循環(huán)里產(chǎn)生大量的H+，引起pH值的劇烈變化，導(dǎo)致信號(hào)不準(zhǔn)確。

1.5 華大基因CG測(cè)序平臺(tái)［13-14］

CG平臺(tái)擁有2種獨(dú)特的測(cè)序相關(guān)技術(shù)：DNA納米球芯片和組合探針錨定連接測(cè)序技術(shù)。DNA納米球芯片制備（圖3A）：由DNA片段和2個(gè)接頭組成DNA文庫(kù)。測(cè)序時(shí)接頭作為讀取起始位點(diǎn)，可從DNA與接頭連接處每次最多讀取10個(gè)連續(xù)堿基，然后單鏈環(huán)狀DNA分子通過(guò)滾環(huán)復(fù)制，形成一個(gè)包含200多個(gè)拷貝的DNA納米球。將建庫(kù)得到的DNA納米球采用高密度DNA納米芯片技術(shù)，加到芯片上的網(wǎng)狀小孔內(nèi)，每個(gè)小孔只能容納一個(gè)DNA納米球，DNA納米芯片的占用量超過(guò)90％，每一個(gè)制備好的芯片可容納1 800億個(gè)堿基用于成像。組合探針錨定連接法（圖3B）：組合探針錨定連接法利用4種不同顏色標(biāo)記的探針去讀取接頭附近的堿基，每次最多讀取10個(gè)連續(xù)堿基且每次測(cè)序是相互獨(dú)立的，在測(cè)序時(shí)，加入anchor與接頭互補(bǔ)配對(duì)，然后DNA連接酶將4種不同顏色標(biāo)記的探針結(jié)合到模板的相應(yīng)堿基上，通過(guò)對(duì)熒光基團(tuán)的成像來(lái)判斷堿基類型。

表1 各測(cè)序平臺(tái)原理和優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 The principles，advantages and disadvantages of the sequencing platform

CG平臺(tái)采用高密度DNA納米芯片技術(shù)，在芯片上嵌入DNA納米球，然后用復(fù)合探針-錨定分子連接技術(shù)來(lái)讀取堿基序列。由CG開(kāi)創(chuàng)的從頭拼接（local de novo）技術(shù)，可精確檢測(cè)等位基因雜合子突變，靈敏性高；采用組合探針錨定連接法技術(shù)來(lái)讀取堿基可明顯減少探針和酶的濃度。與邊合成邊測(cè)序不同，組合探針錨定連接法每個(gè)cycle可一次性讀取數(shù)個(gè)堿基，這樣消耗的測(cè)序試劑和成像時(shí)間都大大減少。每次測(cè)序都是相互獨(dú)立的，測(cè)序結(jié)果不受前一個(gè)堿基測(cè)序結(jié)果的影響，因此不會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤累積的現(xiàn)象。

以上5大技術(shù)產(chǎn)品平臺(tái)是目前NGS的主流。它們技術(shù)原理不盡相同，各有自己的優(yōu)缺點(diǎn)（表1），在科研和臨床應(yīng)用中發(fā)揮著重要的作用。

2 下一代測(cè)序技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用

隨著人類基因組計(jì)劃的完成和測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，NGS技術(shù)不僅保持高準(zhǔn)確度，而且大大降低了測(cè)序成本并極大地提高了測(cè)序速度，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。尤其在腫瘤分子診斷領(lǐng)域（cancer molecular diagnostics）更是當(dāng)仁不讓的主力軍。

2.1 NGS在血液腫瘤中的應(yīng)用

自Ley等［15］在2008年首次報(bào)道了利用NGS技術(shù)對(duì)1例正常核型的急性髓細(xì)胞性白血病的基因組分析后，NGS就被廣泛應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域。在2012年美國(guó)血液學(xué)會(huì)（American Society of Hematology，ASH）年會(huì)上關(guān)于測(cè)序（sequencing）的文獻(xiàn)共有643篇；其中，應(yīng)用NGS的文章有220篇，涉及到急性白血病、骨髓增殖性疾病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、再生障礙性貧血、止血與血栓疾病等各類血液學(xué)疾患。對(duì)于一些臨床表現(xiàn)非常相似的血液病如免疫缺陷病（severe combined immunodeficient disease，SCID）、血小板功能失調(diào)癥，診斷變得很困難，傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)可能出現(xiàn)漏診。鑒于NGS技術(shù)的高通量、高靈敏等優(yōu)勢(shì)，近幾年來(lái)被越來(lái)越多地用于血液病的臨床診斷治療中。Sanger測(cè)序的敏感度只有15％～20％，低于此頻率的突變檢測(cè)不到，而NGS可以檢測(cè)到低于1％的突變。由此看出，NGS相對(duì)于Sanger測(cè)序而言，能發(fā)現(xiàn)更多低頻率的突變。NGS能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，能更全面地了解腫瘤的分子遺傳學(xué)特征。對(duì)于一個(gè)腫瘤個(gè)體來(lái)講，其內(nèi)部存在不同的亞克隆，這些克隆隨著疾病的進(jìn)展及治療措施的干預(yù)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)的變化。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)突變的譜型會(huì)發(fā)生變化，有些是診斷時(shí)的主克隆群體產(chǎn)生了新的突變，而這些突變是原來(lái)的次要克隆攜帶的；有的是診斷時(shí)的次要克隆演變成主要克隆，此時(shí)次要克隆攜帶的突變變成了頻率較高的突變。因此各克隆群體在診斷、治療后和復(fù)發(fā)時(shí)的變化帶來(lái)的突變頻率的變化在檢測(cè)結(jié)果上就某一項(xiàng)突變而言，可能并無(wú)明顯差異，但這種沒(méi)有差異的表現(xiàn)并不能說(shuō)明腫瘤內(nèi)部克隆群體沒(méi)有發(fā)生變化。因此，要綜合所有的相關(guān)突變，以譜型的變化來(lái)判斷腫瘤的進(jìn)展、治療的療效及疾病的預(yù)后，NGS在這方面變出明顯的優(yōu)勢(shì)［16］。

2.2 NGS在循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)中的應(yīng)用

1948年Mandel和Metais［17］在人體血液循環(huán)中發(fā)現(xiàn)游離DNA的存在，稱之為“Cell-free DNA”（cfDNA）。隨著研究的不斷深入，目前研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的外周血中能檢測(cè)到游離核酸的存在［18］。這些游離核酸以基因組和線粒體DNA成分為主，也被稱為循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）［19］。腫瘤細(xì)胞主要通過(guò)被動(dòng)和主動(dòng)機(jī)制2種途徑來(lái)產(chǎn)生ctDNA。被動(dòng)機(jī)制是腫瘤細(xì)胞壞死或者凋亡后，細(xì)胞中的DNA釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，游離地存在于血液中［20］。主動(dòng)機(jī)制則是指腫瘤細(xì)胞能主動(dòng)釋放DNA到外周循環(huán)之中；腫瘤細(xì)胞分泌的外排體也可以產(chǎn)生ctDNA。研究發(fā)現(xiàn)，在人類很多惡性腫瘤中均能檢測(cè)到ctDNA如前列腺癌［21］、肺癌［22］、乳腺癌［23］、大腸癌［24］、肝癌［25］、膀胱癌［26］、宮頸癌［27］、胰腺癌［28］、卵巢癌［29］等。腫瘤的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間存在遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異。利用外周血中的ctDNA能更準(zhǔn)確、更高效評(píng)估腫瘤的進(jìn)展，如果腫瘤細(xì)胞發(fā)生某種突變，這些突變可以在ctDNA中反應(yīng)出來(lái)，通過(guò)NGS對(duì)ctDNA測(cè)序獲得突變信息，就獲得了腫瘤細(xì)胞的突變信息。2014年4月在《Nature Medicine》發(fā)表的一篇文章指出，將NGS技術(shù)應(yīng)用于血漿ctDNA檢測(cè)，具有驚人的高特異性和敏感性。作者將此法命名為深度測(cè)序腫瘤個(gè)體化建檔法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）［30］。研究者對(duì)不同級(jí)別的肺癌患者進(jìn)行了CAPP-Seq驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)對(duì)II～I(xiàn)V期的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）檢測(cè)敏感性達(dá)100％，I期的NSCLC中敏感性為50％；對(duì)各期肺癌的特異性均為96％。以上結(jié)果顯示CAPP-Seq并不比金標(biāo)準(zhǔn)腫瘤活檢的診斷效能差，能夠準(zhǔn)確測(cè)定肺癌的基因型。

研究發(fā)現(xiàn)，外周血中出現(xiàn)高頻的腫瘤相關(guān)基因突變?nèi)鏿53、KRAS和APC等，往往與較高的臨床分期有關(guān)，也預(yù)示著患者較差的預(yù)后；與腫瘤靶向治療、診斷及預(yù)后相關(guān)標(biāo)記如K-ras、BRAF、HER-2、p53、EGFR、APC等，通過(guò)NGS技術(shù)對(duì)ctDNA中這些的標(biāo)記物進(jìn)行測(cè)序，能夠更精確更全面地為腫瘤的靶向治療、藥效檢測(cè)和患者的預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)［31-32］。

2.3 NGS在腫瘤風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)及預(yù)防中的應(yīng)用

NGS技術(shù)可使腫瘤防治措施前移至預(yù)防階段。大量研究表明某些腫瘤的發(fā)生與個(gè)別關(guān)鍵基因突變有密切關(guān)系。乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）變異被發(fā)現(xiàn)與女性的遺傳性乳腺癌和卵巢癌相關(guān)［33-34］。BRCA1/2基因是一類腫瘤抑制基因，可以幫助修復(fù)DNA損傷并能確保細(xì)胞的遺傳物質(zhì)（DNA）的穩(wěn)定性，防止細(xì)胞生長(zhǎng)變異。但當(dāng)BRCA1/2基因發(fā)生變異后，細(xì)胞失去了這一保護(hù)作用，發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)將大大增加，并且還存在家族遺傳性。BRCA2基因變異與男性乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌發(fā)生同樣關(guān)系密切［35］。美國(guó)好萊塢女星安吉麗娜·朱莉的案例就是一個(gè)應(yīng)用實(shí)例。乳腺癌高危人群基因篩選技術(shù)以及肺癌基因檢測(cè)技術(shù)已在臨床投入使用，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心開(kāi)展的乳腺癌基因檢測(cè)技術(shù)，是利用NGS測(cè)序技術(shù)就BRCA1、BRCA2等6個(gè)國(guó)際公認(rèn)的乳腺癌易感基因，進(jìn)行全外顯子基因測(cè)序檢測(cè)，用于預(yù)測(cè)乳腺癌發(fā)生的概率；對(duì)于遺傳性乳腺癌、卵巢癌和其他癌癥，2014版美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南中明確指出可利用NGS技術(shù)檢測(cè)相關(guān)的基因突變。

2.4 NGS在單細(xì)胞測(cè)序中的應(yīng)用

2014年，單細(xì)胞測(cè)序的應(yīng)用被列為《自然-方法學(xué)》（Nature Methods）年度最重要的方法學(xué)進(jìn)展。2015基因組學(xué)前沿研討會(huì)將單細(xì)胞組學(xué)單獨(dú)列為一個(gè)單元。常規(guī)的測(cè)序樣品來(lái)源大多數(shù)是多細(xì)胞的混合DNA，這種方法得到的全基因組序列信息是一群細(xì)胞基因信息的平均值，或其中占優(yōu)勢(shì)數(shù)量的細(xì)胞信息，而單個(gè)細(xì)胞的特性和細(xì)胞與細(xì)胞之間的異質(zhì)性則被忽視。單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對(duì)全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)。其原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得高覆蓋率的完整的基因組后進(jìn)行高通量測(cè)序用于揭示細(xì)胞群體差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系。但由于PCR擴(kuò)增時(shí)存在偏倚，常導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果的基因組覆蓋度很低。2012年，哈佛大學(xué)謝曉亮院士在《Science》發(fā)表了單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增新技術(shù)（multiple annealing and looping based amplification cycles，MALBAC），即多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)［36］。不同于以往的非線性或指數(shù)型擴(kuò)增方法，MALBAC技術(shù)利用特殊引物，使得擴(kuò)增子的結(jié)尾互補(bǔ)而成環(huán)，從而很大程度上防止了DNA的指數(shù)性擴(kuò)增，從而解決了基因組擴(kuò)增對(duì)微量初始模板過(guò)大的擴(kuò)增偏倚，使得MALBAC擴(kuò)增的DNA基因組覆蓋度達(dá)到93％，并使基因組測(cè)序的模板需求量從μg級(jí)降至單細(xì)胞水平。2012年，華大基因同樣利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)單個(gè)腎癌細(xì)胞的單核苷酸突變特征進(jìn)行分析，從而在更高的分辨能力上為評(píng)價(jià)基因改變的復(fù)雜性提供了更為優(yōu)化的方法。2014年，華大基因又利用該方法在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的癌基因SLC12A5［37］。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)不僅為腫瘤分子分型和個(gè)體化治療提供指導(dǎo)，還將有助于我們理解腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性和腫瘤的演進(jìn)［38］。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)還能與循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）篩選技術(shù)相結(jié)合，檢測(cè)外周血CTCs單核苷酸變（single-nucleo-tide variations，SNV）、CNV或外顯子組插入/缺失突變，為腫瘤診斷及個(gè)體化治療提供一種非侵入性檢測(cè)手段。

3 展望

個(gè)性化醫(yī)療是基于基因序列的分子診斷技術(shù)的發(fā)展而出現(xiàn)的，目前主要應(yīng)用的技術(shù)是基因測(cè)序技術(shù)?；驕y(cè)序技術(shù)被應(yīng)用于個(gè)性化醫(yī)療，是因?yàn)閭€(gè)體化醫(yī)療是以每個(gè)患者的基因組信息為基礎(chǔ)決定治療方針，了解患者的整體遺傳信息，對(duì)預(yù)防、診斷、治療和用藥提供指導(dǎo)性意見(jiàn)。也因此出現(xiàn)了很多靶向治療藥物，這些藥物的用藥基礎(chǔ)依據(jù)患者的基因組及分子差異（變異），所以患者的基因組信息尤為重要，Sanger測(cè)序技術(shù)，可以用于個(gè)體化醫(yī)療，但是測(cè)序通量小，速度慢，靈敏度較NGS低，成本高，此時(shí)需要一種簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，同時(shí)成本又不太高的測(cè)序診斷技術(shù)就是NGS技術(shù)，憑借自身高靈敏度、高通量等特性被廣泛用于腫瘤個(gè)體化醫(yī)療和基因分子生物學(xué)的研究并帶來(lái)新的變化，在腫瘤分子生物學(xué)的研究以及臨床應(yīng)用方面，也顯示了多方面的影響并推動(dòng)了個(gè)體腫瘤學(xué)發(fā)展。NGS技術(shù)，在臨床診斷中應(yīng)用，對(duì)腫瘤患者的疾病診斷和治療都起到巨大作用。近期提出的精準(zhǔn)醫(yī)療，它是以個(gè)體化醫(yī)療為基礎(chǔ)，以環(huán)境、生活方式、既往病史及診療方式等為跟蹤對(duì)象，搜集全方位、可量化、有前瞻性和時(shí)效性的個(gè)體數(shù)據(jù)，通過(guò)數(shù)據(jù)的綜合分析、挖掘形成有價(jià)值的醫(yī)學(xué)信息，最終設(shè)計(jì)出針對(duì)個(gè)體的最優(yōu)解決方案。在精準(zhǔn)診斷方面，對(duì)人體了解需要更加深入到基因組、體細(xì)胞突變等，這些需要依靠測(cè)序技術(shù)，通過(guò)NGS技術(shù)能更精準(zhǔn)更全面地了解患者的信息。NGS為個(gè)體提供連續(xù)基因大數(shù)據(jù)，是精準(zhǔn)醫(yī)療的基礎(chǔ)和重要實(shí)現(xiàn)途徑。隨著技術(shù)的不斷革新，測(cè)序技術(shù)層出不窮。新的測(cè)序技術(shù)陸續(xù)出現(xiàn)，以單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的DNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，該測(cè)序技術(shù)不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，消除了潛在的擴(kuò)增錯(cuò)誤和不均勻，測(cè)序長(zhǎng)度更長(zhǎng)速度更快。最近出現(xiàn)的納米孔測(cè)序技術(shù)，相比于前面3類測(cè)序技術(shù)，該測(cè)序技術(shù)是真正實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)和電子傳導(dǎo)檢測(cè)相結(jié)合的測(cè)序方法，完全擺脫了洗脫和PCR擴(kuò)增過(guò)程。納米孔測(cè)序技術(shù)一旦投入市場(chǎng)，將有望在幾小時(shí)內(nèi)以幾百美元的成本完成全基因組測(cè)序。每一項(xiàng)新技術(shù)的出現(xiàn)都有超過(guò)前代技術(shù)的獨(dú)特之處，但是各代測(cè)序均有不足之處，Sanger測(cè)序的主要缺陷是低通量和高成本，NGS測(cè)序的缺陷是序列長(zhǎng)度較短，DNA測(cè)序和納米孔測(cè)序在準(zhǔn)確率方面尚存在嚴(yán)重缺陷。由于NGS技術(shù)面臨的短序列缺陷可以通過(guò)生物信息學(xué)工具在一定程度上進(jìn)行彌補(bǔ)，因此NGS技術(shù)是現(xiàn)今最穩(wěn)定，應(yīng)用范圍最廣泛的測(cè)序技術(shù)。目前科學(xué)家正在通過(guò)減緩DNA序列通過(guò)納米孔速度的方式提高新測(cè)序的準(zhǔn)確度，專家預(yù)計(jì)10年內(nèi)新測(cè)序的準(zhǔn)確度將會(huì)顯著提升，屆時(shí)將在保證測(cè)序通量的基礎(chǔ)上，憑借著超長(zhǎng)序列讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)將逐步取代NGS測(cè)序。隨著基因測(cè)序通量、準(zhǔn)確度的提高和成本的降低，相信測(cè)序技術(shù)，將在腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，提高腫瘤的診斷和治療水平方面發(fā)揮重要的作用。

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Advances in next-generation sequencing（NGS）technology and their application in cancer research

SHAO Xiangyang，XU Weiwen★
（School of Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

Next-generation sequencing（NGS）platforms have recently evolved to provide an accurate and comprehensive means for the research and diagnosis of diseases.Advancements in next generation sequencing technology have provided a new way for the study of the molecular biology of tumors.In this review，the characteristics and developmental trends of next generation sequencing technology are summarized，and applications in tumor research are discussed.

Next-generation sequencing（NGS）；Tumor；Precision medicine

十二五國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA020205）；廣州市產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)（201508020052）

南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州510515

★通訊作者：徐偉文，E-mail：xu_sandy2006@126.com