李伍高嚴(yán)提珍★唐寧李哲濤唐向榮楊艷蔡稔李靜文

·論著·

廣西玉林特殊教育學(xué)校耳聾相關(guān)基因突變分析

李伍高1，2嚴(yán)提珍1，2★唐寧1，2李哲濤1，2唐向榮1，3楊艷3蔡稔1，2李靜文1，2

目的分析廣西玉林地區(qū)耳聾患者相關(guān)致病基因突變，初步了解玉林地區(qū)耳聾患者發(fā)病的分子機(jī)制。方法對(duì)玉林地區(qū)2個(gè)特殊教育學(xué)校191例耳聾患者進(jìn)行分子病因信息采集，對(duì)6歲以上患者行純音測(cè)聽(tīng)和聲導(dǎo)抗進(jìn)行聽(tīng)力評(píng)估；小于6歲的患兒行40 Hz相關(guān)電位、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（distortion product otoacoustic emission，DPOAE）和聽(tīng)性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）進(jìn)行聽(tīng)力評(píng)估。采集外周血4m L并提取基因組DNA，用耳聾基因微陣列芯片技術(shù)對(duì)4個(gè)致聾基因的9個(gè)突變位點(diǎn)（GJB2基因：c.35delG、c.235delC、c.176del16、c.299delAT；GJB3基因：c.538C＞T；SLC26A4基因：c.919-2A＞G、c.2168A＞G；線粒體DNA 12SrRNA基因：m.1494C＞T、m.1555A＞G）進(jìn)行基因突變分析。結(jié)果在28例耳聾患者中檢出GJB2、SLC26A4和線粒體DNA 12SrRN A基因突變，總檢出率為14.66％（28/191），其中GJB2基因c.235delC純合突變3例，c.176_191del16和c.235delC復(fù)合雜合突變1例，c.235delC雜合突變2例，c.299_300delAT雜合突變合并SLC26A4基因c.919-2A＞G雜合突變1例；SLC26A4基因c.919-2A＞G純合突變4例，c.919-2A＞G雜合突變13例，c.919-2A＞G和c.2168A＞G復(fù)合雜合突變2例；線粒體DNA 12SrRNA基因m.1555A＞G均質(zhì)突變2例。結(jié)論廣西玉林地區(qū)耳聾患者熱點(diǎn)突變基因以SLC26A4基因最為常見(jiàn)。玉林地區(qū)耳聾患者的相關(guān)基因檢出陽(yáng)性率、GJB2基因、SLC26A4基因及線粒體DNA 12SrRNA基因的攜帶率均低于全國(guó)平均水平。

耳聾；基因突變；微陣列芯片技術(shù)

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和遺傳學(xué)的發(fā)展，尤其是人類基因組圖譜的成功繪制和測(cè)序技術(shù)的自動(dòng)化都為耳聾基因診斷提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。耳聾基因診斷技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展使診斷耳聾的方法由影像和物理檢測(cè)聽(tīng)力水平提升至分子檢測(cè)水平，為越來(lái)越多的耳聾患者（特別是兒童患者）揭示了分子病因，也為耳聾基因治療的基礎(chǔ)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)推動(dòng)疾病防治的范例。在我國(guó)大規(guī)模的耳聾致病基因的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，GJB2、SLC26A4和線粒體基因是導(dǎo)致非綜合征性耳聾（non-syndromic hearing loss，NSHL）的3個(gè)最常見(jiàn)的致病基因，且不同地區(qū)不同人群的基因檢出率差異較大［1-2］。

由于與耳聾相關(guān)的致病基因較多，而且相關(guān)的致病基因具有極高的遺傳異質(zhì)性，給臨床選擇何種基因診斷技術(shù)檢測(cè)耳聾基因帶來(lái)極大困難，因此如何建立一種行之有效的方法檢測(cè)耳聾致病基因成為臨床基因診斷首要解決的問(wèn)題，基因芯片檢測(cè)技術(shù)是隨著基因組計(jì)劃發(fā)展起來(lái)的新型的分子生物學(xué)技術(shù)，其誕生和高速發(fā)展為高通量基因突變檢測(cè)帶來(lái)了新的曙光［3］。中國(guó)解放軍總醫(yī)院與北京博奧生物技術(shù)有限公司共同研發(fā)了一款可同時(shí)檢測(cè)中國(guó)人常見(jiàn)的4個(gè)耳聾相關(guān)基因中的9個(gè)熱點(diǎn)突變的基因診斷芯片［4］，該技術(shù)將芯片技術(shù)和等位基因特異性引物延伸PCR相結(jié)合，可以準(zhǔn)確快速地診斷耳聾相關(guān)致病基因，而且敏感性高，從而顯示出廣闊的臨床應(yīng)用前景。本研究利用耳聾基因診斷芯片對(duì)廣西玉林地區(qū)2個(gè)特殊教育學(xué)校開(kāi)展4個(gè)致聾基因（GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體DNA 12SrRNA）進(jìn)行突變分析，為該地區(qū)耳聾家庭提供致病基因的攜帶狀況和遺傳規(guī)律等信息，為耳聾的遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷及出生缺陷預(yù)防的臨床實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)保障，促進(jìn)聾病三級(jí)預(yù)防的實(shí)現(xiàn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及樣本采集

以廣西玉林市2個(gè)特殊教育學(xué)校的耳聾人群作為研究對(duì)象，告知并簽署知情同意書(shū)后，采集該人群的相關(guān)病史，包括基本信息、出生史、耳聾發(fā)病年齡、家族史、個(gè)人史（耳聾前傳染病史、耳毒性藥物使用史、頭部外傷史等）、母親孕產(chǎn)期情況等。經(jīng)全身及耳鼻咽喉科常規(guī)檢查，對(duì)6歲及6歲以上患者行純音測(cè)聽(tīng)和聲導(dǎo)抗進(jìn)行聽(tīng)力評(píng)估；小于6歲的患兒行40 Hz相關(guān)電位、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（distortion product otoacoustic emission，DPOAE）和聽(tīng)性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）進(jìn)行聽(tīng)力評(píng)估。結(jié)合病史排除其他癥狀和體征，191例患者被診斷為NSHL。其中男性113例，女性78例，年齡4～24歲，平均年齡（8.2±4.5）歲，所有耳聾患者抽取EDTA-Na2抗凝靜脈外周血4m L。

1.2 基因組DNA提取和濃度測(cè)定

取500μL全血利用全自動(dòng)磁珠法（福建廈門(mén)致善生物技術(shù)有限公司）提取外周血基因組DNA。利用ASP2680核酸測(cè)定儀（ACTGene，美國(guó)）檢測(cè)提取的基因組DNA濃度和質(zhì)量。DNA樣本濃度需在100～200 ng/μL，A260/A280比值應(yīng)在1.6～2.0，A260/A230比值需≥2.0。提取的DNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 耳聾基因芯片檢測(cè)

應(yīng)用北京博奧生物技術(shù)有限公司的晶芯?九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒（微陣列芯片法）對(duì)4個(gè)致聾基因GJB2基因（c.35delG、c.176del16、c.235delC、c.299delAT），GJB3基因（c.538C＞T），SLC26A4基因（c.919-2A＞G、c.2168A＞G），線粒體DNA 12SrRNA基因（m.1494C＞T、m.1555A＞G）共9個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)設(shè)備為美國(guó)ABI 9700PCR儀、北京博奧生物技術(shù)有限公司耳聾基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)：芯片掃描儀LuxScanTM10K-A及配套軟件、雜交儀（BioM ixerTMII）、芯片洗干儀（SlideWasherTM8）。

2 結(jié)果

應(yīng)用微陣列芯片方法，在191例耳聾患者中共有28例檢測(cè)到GJB2、SLC26A4和線粒體DNA 12SrRNA基因突變，檢出率為14.66％（28/191），見(jiàn)表1。7例樣本檢測(cè)出GJB2基因突變，包括c.235delC、c.299delAT和c.176del16，檢出率為3.66％（7/191）。其中c.235delC突變6例，檢出率為3.14％（6/191）；c.235delC純合突變3例；c.235delC單雜合突變2例；復(fù)合雜合突變1例（基因型為c.176_191del16/c.235delC）。1例c.299delAT單雜合突變合并SLC26A4基因c.919-2A＞G單雜合突變，檢出率為0.52％（1/191）。4例患者能明確病因，占總數(shù)的2.09％（4/191），未發(fā)現(xiàn)c.35delG突變位點(diǎn)。SLC26A4基因突變有20例，檢出率為10.46％（20/191），其中14例為c.919-2A＞G單雜合突變（1例合并GJB2基因c.299_300delAT單雜合突變）；4例為c.919-2A＞G純合突變；2例為復(fù)合雜合突變（基因型均為c.919-2A＞G/c.2168A＞G）。能明確病因的有6例，占總數(shù)的3.14％（6/191）。線粒體DNA 12SrRNA m.1555A＞G均質(zhì)突變檢出2例，男女患者各1例，檢出率為1.04％（2/191）。部分陽(yáng)性病例耳聾基因芯片檢測(cè)圖譜見(jiàn)圖1。

表1 191例耳聾患者基因芯片檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection DNA microarray results of 191 deafness patients

3 討論

由耳聾相關(guān)的遺傳基因突變引起的遺傳性耳聾占先天性耳聾的半數(shù)以上，遺傳性耳聾分為2大類，綜合性耳聾和非綜合性耳聾，臨床上無(wú)其他器官損害及功能障礙只單一的表現(xiàn)為聽(tīng)力損失的稱為非綜合性耳聾，占遺傳性耳聾的60％左右［5］。大多數(shù)的遺傳性耳聾是單基因病，分為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X連鎖遺傳及線粒體遺傳，Angeli等［6］人通過(guò)建立小鼠模型發(fā)現(xiàn)至少64個(gè)基因與耳聾明確相關(guān)。

耳聾有眾多相關(guān)基因，雖然耳聾相關(guān)的致病基因較多，而且具有較強(qiáng)的遺傳異質(zhì)性，但是大多數(shù)的耳聾患者是由少數(shù)有限的幾個(gè)基因突變引起的，這為臨床開(kāi)展進(jìn)行耳聾基因診斷和產(chǎn)前診斷提供了診斷依據(jù)基因。中國(guó)解放軍總醫(yī)院戴樸教授團(tuán)隊(duì)［7-9］率先在國(guó)內(nèi)進(jìn)行了大規(guī)模耳聾分子流行病學(xué)研究調(diào)查，其研究結(jié)果顯示GJB2、SLC26A4、線粒體DNA 12SrRNA基因是中國(guó)人遺傳性耳聾最常見(jiàn)的3個(gè)致病基因，人群攜帶率分別為21％、14.5％、3.4％。王國(guó)建等［10］根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果開(kāi)發(fā)的芯片能檢測(cè)出42.41％NSHL患者。本文應(yīng)用微陣列芯片方法對(duì)廣西玉林地區(qū)的耳聾患者的檢出陽(yáng)性率為14.66％，其中GJB2基因突變3.66％，SLC26A4基因突變10.47％，線粒體DNA 12SrRNA基因m.1555A＞G突變1.04％，研究結(jié)果表明玉林地區(qū)耳聾患者的相關(guān)基因檢出陽(yáng)性率及GJB2基因、SLC26A4基因和線粒體DNA 12SrRNA基因的攜帶率均低于全國(guó)平均水平。造成這些差異的原因可能包括：（1）相對(duì)于傳統(tǒng)的酶切及Sanger測(cè)序等方法，微陣列芯片方法的檢出率稍低，未覆蓋其他位點(diǎn)突變。（2）中國(guó)人耳聾基因在地域上存在差異性。在戴樸教授團(tuán)隊(duì)的研究中，他們選擇的研究對(duì)象65％以上患者來(lái)源于北方人群，南方人群僅局限在廣西柳州、廣東佛山等幾個(gè)省市，傾向于反映北方人群耳聾分子流行病學(xué)趨勢(shì)。

導(dǎo)致NSHL常見(jiàn)的病因之一GJB2基因突變，15％～33％中國(guó)人群中耳聾患者由GJB2基因突變所致，廣西玉林地區(qū)僅有2.09％（4/191）的耳聾患者由GJB2異常引起，最常見(jiàn)的致病突變位點(diǎn)為c.235delC，與國(guó)內(nèi)報(bào)道相同［7，11］。本文GJB2突變的NSHL患者，耳蝸神經(jīng)和聽(tīng)覺(jué)中區(qū)完整，可通過(guò)人工耳蝸的植入恢復(fù)較好的聽(tīng)力。SLC26A4基因突變可導(dǎo)致Pendred綜合征及大前庭水管擴(kuò)大綜合征（enlarged vestibular aqueduct synodrome，EVAS）。我國(guó)約97％的EVAS患者能夠檢出SLC26A4基因突變，其主要突變類型為c.919-2A＞G。本文9例大前庭水管擴(kuò)大患者均攜帶SLC26A4基因突變，4例為c.919-2A＞G純合突變，2例為c.919-2A＞G/c.2168A＞G復(fù)合雜合突變，3例c.919-2A＞G雜合突變。有30％攜帶SLC26A4基因單等位基因突變的患者會(huì)表現(xiàn)為大前庭水管擴(kuò)大［8］，對(duì)于雜合突變患者應(yīng)通過(guò)Sanger測(cè)序進(jìn)一步檢測(cè)SLC26A4基因其他突變位點(diǎn)，以明確最終的基因型。大前庭水管擴(kuò)大患者內(nèi)耳環(huán)境比較脆弱，如頭部外傷、感冒發(fā)熱等任何引起顱內(nèi)壓變化的因素可導(dǎo)致EVAS患者聽(tīng)力下降。本文中3例EVAS患者出生時(shí)聽(tīng)力篩查通過(guò)，2歲后在頭部震蕩、感冒后出現(xiàn)波動(dòng)性聽(tīng)力下降，最后殘余聽(tīng)力完全喪失。若能在新生兒時(shí)期進(jìn)行SLC26A4基因篩查，不僅能明確病因，還可以提醒家長(zhǎng)注意日常防護(hù)，保護(hù)殘余聽(tīng)力，延緩患者聽(tīng)力下降的速度。線粒體DNA 12SrRNA基因m.1555A＞G突變引發(fā)的耳聾與氨基糖甙類藥物使用不當(dāng)有關(guān)。突變攜帶者對(duì)氨基糖甙類藥物比較敏感。廣西玉林地區(qū)NSHL患者中線粒體DNA 12SrRNA基因m.1555A＞G突變檢出率為1.04％，低于全國(guó)平均水平（3.4％）。本文2例患者均在應(yīng)用氨基糖甙類藥物后致聾，這提示在使用耳毒性藥物治療兒童疾病前，要注意了解患兒耳聾的家族史，若有條件時(shí)應(yīng)進(jìn)行線粒體DNA 12SrRNA基因m.1555A＞G和m.1494C＞T位點(diǎn)篩D查，避免藥物性耳聾的發(fā)生。

本研究通過(guò)對(duì)廣西玉林兩個(gè)特殊學(xué)校耳聾人群進(jìn)行耳聾基因突變分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLC26A4、GJB2和線粒體DNA 12SrRNA基因是該地區(qū)耳聾患者最主要的致病基因，檢出率分別為10.46％、 3.66％和1.04％。部分患兒僅僅檢出單等位基因雜合突變，還有將近85.34％耳聾患者未檢出任何突變，原因包括：（1）部分患者可能由于環(huán)境因素（如病毒感染、噪聲等）誘發(fā)耳聾；（2）這與遺傳性耳聾基因微陣列芯片覆蓋的基因類型和突變位點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)，由于芯片僅檢測(cè)4個(gè)致聾基因9個(gè)突變位點(diǎn)，其他突變位點(diǎn)沒(méi)有涵蓋，故存在部分患者漏診的可能；（3）部分患者可能是由于其他罕見(jiàn)基因發(fā)生突變而引發(fā)耳聾。因此，下一階段我們將利用其他分子檢測(cè)手段對(duì)這些耳聾患者進(jìn)行進(jìn)一步的基因分析。隨著Illumina、SOLiD等新型測(cè)序平臺(tái)的出現(xiàn)，短時(shí)間內(nèi)完成幾百萬(wàn)甚至更多片段的靶向序列捕獲、大規(guī)模平行測(cè)序?qū)⒊蔀楝F(xiàn)實(shí)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)所有已知耳聾基因的同步檢測(cè)［12-14］。這一技術(shù)性探索將以較低的成本在大規(guī)模人群中檢測(cè)所有的耳聾基因，并有望在耳聾的基因診斷中開(kāi)展更廣泛、有效的臨床應(yīng)用［15-18］。隨著高通量測(cè)序的普及和檢測(cè)成本的下降，高通量測(cè)序是未來(lái)檢測(cè)耳聾基因的必然趨勢(shì)。

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Analysis of deafness-related gene mutations in hearing loss patients in Yulin special education school of Guangxi

LIWugao1，2，YAN Tizhen1，2★，TANG Ning1，2，LIZhetao1，2，TANG Xiangrong1，3，YANG Yan3，CAIRen1，2，LI Jingwen1，2
（1.Liuzhou Key Laboratory of Birth Defects Prevention and Control，Liuzhou Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，Guangxi，China，545001；2.Department of Medical Genetics，Liuzhou Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，Guangxi，China，545001；3.Hearing Diagnosis Center，Liuzhou Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，Guangxi，China，545001）

Objective To identify the deafness-related gene mutations in patients with hearing loss in Yulin，and to explore the molecular pathogenic mechanism.Methods Patients’information was collected and blood samples were obtained from 191 patients with hearing loss from a special education school.Patients 6 years of age or older were evaluated by pure tone audiometry and acoustic immittance.Patients less than 6 years old were evaluated by 40 Hz auditory event related potential，distortion product otoacoustic emission（DPOAE）and auditory brainstem response（ABR）.Genomic DNA samples of 191 deafness patients were extracted from peripheral blood.9 mutations of 4 genes（including c.35delG，c.235delC，c.176del16，c.299delAT in GJB2 gene；c.538C＞T in GJB3 gene；c.919-2A＞G and c.2168A＞G in SLC26A4 gene；m.1494C＞T and m.1555A＞G in m tDNA 12SrRNA gene）were detected with the gene chip technique.Results Among 191 patients with hearing loss，28 cases were found to carry at least one pathogenic gene mutation.The positive detection rate was 14.66％（28/191）.In these patients，7 cases had GJB2 gene mutations（c.235delC homozygous mutation in 3 cases，c.176_191del16/c.235delC compound heterozygous mutation in 1 case，c.235delC heterozygous mutation in 2 cases，c.299_300delAT/c.919-2A＞G compound heterozygous mutation in 1 case）；19 cases had SLC26A4 gene mutations（c.919-2A＞G homozygous mutation in 4 cases，c.919-2A＞G heterozygous mutation in 13 cases，c.919-2A＞G/c.2168A＞G compound heterozygous mutation in 1 case）and 2 cases had mitochondrial DNA 12SrRNA m.1555A＞G mutations.Conclusion SLC26A4 gene mutations are the most common hot spot mutations in deafness patients in the Yulin area.Incidence of GJB2，SLC26A4 and mitochondrial DNA 12SrRNA gene mutations in the deafness population in Yulin is below the average of the overall Chinese deaf population.

Deafness；Genemutation；DNA microarray chip

國(guó)家自然科學(xué)資金項(xiàng)目（81360159）；廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目（桂科攻14124004-1-20）；柳州市科技攻關(guān)項(xiàng)目（2014J030401）；柳州市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目研究成果資助（2014G020404）

1.柳州市婦幼保健院柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西，柳州545001 2.柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科，廣西，柳州545001 3.柳州市婦幼保健院聽(tīng)力診斷中心，廣西，柳州545001

★通訊作者：嚴(yán)提珍，E-mail：439078813@qq.com