師一民　王永強(qiáng)　安　辰　趙　暉　齊　放　張秋霞　陳振振　樊永平　李　明　王　蕾

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100069； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京，100050)

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實(shí)驗(yàn)研究

補(bǔ)腎益髓方及其拆方對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦和脊髓中p-Tau和Beta-tubulin表達(dá)的影響

師一民1王永強(qiáng)1安辰1趙暉1齊放1張秋霞1陳振振1樊永平2李明1王蕾1

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100069； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京，100050)

目的：觀察補(bǔ)腎益髓(Bu Shen Yi Sui，BSYS)方及其拆方補(bǔ)腎(Bu Shen，BS)和化痰活血(Hua Tan Huo Xue，HTHX)方對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)小鼠腦和脊髓中p-Tau和Beta-tubulin的作用。方法：C57BL/6小鼠雌性隨機(jī)分為正常對照(NC)、模型(MO)、醋酸潑尼松(PA)、梓醇(CA)、BSYS、BS和HTHX組。造模當(dāng)天與造模后第7天于小鼠背部兩側(cè)皮下注射抗原，即50 μg髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)35-55、完全弗氏佐劑(CFA)與結(jié)核分支桿菌(TB)混合，并在免疫當(dāng)天和2 d后腹腔注射500 ng的百日咳毒素(PTX)。每天對小鼠進(jìn)行灌胃，觀察其體重及神經(jīng)功能評分，并于造模第20 d和第40 d分別取腦和脊髓進(jìn)行病理檢測。采用免疫組化法檢測p-Tau和beta-tubulin的表達(dá)。結(jié)果：與MO組比較，BSYS、BS和HTHX組體重與神經(jīng)功能評分均出現(xiàn)明顯上升，HE染色可觀察到炎細(xì)胞顯著減少，核固縮減輕，同時，BSYS、BS和HTHX方均可明顯下調(diào)p-Tau表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，上調(diào)beta-tubulin蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：BSYS方及其拆方BS和HTHX均對EAE小鼠有神經(jīng)保護(hù)作用，表現(xiàn)在減少體重丟失，降低神經(jīng)功能評分，減輕炎炎性細(xì)胞浸潤，減輕軸突損傷及促進(jìn)其修復(fù)，尤以BSYS全方更為顯著。

補(bǔ)腎益髓方及其拆方；多發(fā)性硬化；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；P-Tau；Beta-tubulin

多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System，CNS)自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的炎性神經(jīng)退行性病變[1]，病理學(xué)改變是以CNS內(nèi)存在多處炎性反應(yīng)、髓鞘脫失、軸突損傷、膠質(zhì)增生和程度不一的髓鞘再生為特征[2]。其中軸突損傷與患者神經(jīng)功能障礙密切相關(guān)[3]，患者還伴有認(rèn)知功能障礙、感覺障礙、視力障礙、疲勞、共濟(jì)失調(diào)等相關(guān)癥狀[4-6]。因此，如何促進(jìn)軸突損傷的修復(fù)對于臨床治療具有重要意義。但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于MS患者的治療多為調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，對于神經(jīng)修復(fù)面臨諸多困難[7]。

中醫(yī)藥在促進(jìn)軸突再生修復(fù)方面有潛在優(yōu)勢，研究發(fā)現(xiàn)，中藥在改善MS癥狀、調(diào)節(jié)免疫功能、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)、減緩疾病進(jìn)程等都方面具有較好的療效[8]。中醫(yī)認(rèn)為MS以正虛為本，邪實(shí)為標(biāo)。本虛涉及脾、肝、腎三臟不足，標(biāo)實(shí)有瘀血、痰濁、熱毒、水濕、腑實(shí)、痰蒙竅閉等差異[9]。經(jīng)過大樣本臨床病例的統(tǒng)計分析，MS患者的基本病機(jī)概括為肝腎陰虛和痰瘀阻絡(luò)[10]。補(bǔ)腎益髓方(原稱二黃方)是天壇醫(yī)院樊永平教授在長期治療MS的臨床實(shí)踐中創(chuàng)立的有效方，具有補(bǔ)腎化痰活血的功效，對腎虛兼痰瘀互阻的MS患者效果明顯[11]。前期實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，BSYS方對MS動物模型EAE有明顯的防治作用。能夠有效減輕髓鞘脫失與軸突損傷，促進(jìn)神經(jīng)再生與修復(fù)[12-13]。

Tau蛋白是一種微管相關(guān)細(xì)胞骨架蛋白，可在神經(jīng)元與軸突中高度表達(dá)，其異常磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)，造成相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的運(yùn)輸、儲存和釋放障礙，故可作為反映軸突損傷的指標(biāo)蛋白[14]。Beta-tubulin是組成神經(jīng)元微管的重要蛋白之一，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長、分裂及維持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定，在促進(jìn)突觸可塑性調(diào)節(jié)、突起形成、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和神經(jīng)元發(fā)育中發(fā)揮重要作用[15]。故其可以作為軸突修復(fù)的指標(biāo)蛋白。

為了深入探討B(tài)SYS方的作用機(jī)制，我們依其治法將其拆分為BS和HTHX方進(jìn)行研究。主要采用免疫組化法(Immunohistochemistry，IHC)觀察BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠的作用及對其腦與脊髓中p-Tau和beta-tubulin表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物70只SPF級C57BL/6雌性小鼠，體質(zhì)量控制在15～17 g。購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[許可證號為SCXK(京)2012-0001]。動物飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(許可證號SYXK(京)2010-0020)，具備獨(dú)立通氣籠(Individual Ventilated Cages，IVC)系統(tǒng)，單籠飼養(yǎng)，溫度18～22 ℃，相對濕度40%～60%，自由接觸飼料和飲水。每日上午添加飼料、更換水和墊料。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物BSYS方由生地黃、熟地黃、浙貝母、水蛭、全蝎、益母草等組成；BS方由生地黃、熟地黃等組成；HTHX方由浙貝母、水蛭、全蝎、益母草等組成，均由北京亞東生物制藥有限公司制備。醋酸潑尼松片(Prednisone Acetate，PA)由天津力生制藥有限公司生產(chǎn)，梓醇(Catapol，CA)由杭州康木科技有限公司提供。

1.1.3主要試劑髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein，MOG)35-55由北京旭和源生物科技有限公司合成；完全弗氏佐劑(Complete Freund′s Adjuvant，CFA，貨號F5881)、百日咳毒素(Pertussis Toxin，PTX，貨號P7208)均由美國Sigma公司提供；滅活結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium Tuberculosis，TB，貨號231141)由美國BD公司提供。p-Tau抗體(貨號ab131354)和Beta-tubulin(貨號ab6046)均由美國Abcam公司提供；Alexa Fluor594標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號ZF0516)購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司等。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備將小鼠隨機(jī)分為7組：正常(NC)、模型(MO)、PA、CA、BS、HTHX及BSYS組。每組10只。造模當(dāng)天與造模后第7天于小鼠背部兩側(cè)皮下注射0.2 mL的免疫抗原，由50 μg MOG35-55、100 μLCFA、0.3 mg TB和100 μL生理鹽水混合而成。每只動物在免疫當(dāng)天和兩天后腹腔注射500 ng的PTX。正常組注射同體積的生理鹽水[16]。

1.2.2給藥方法PA組小鼠給予PA 5 mg/kg體重灌胃；CA組給予CA 40 mg/kg體重灌胃；BS方組給予BS混懸液1.44生藥/kg體重；HTHX方組給予HTHX混懸液1.57 g生藥/kg體重灌胃；BSYS方組給予相應(yīng)BSYS混懸液3.02生藥/kg體重灌胃。NC和MO組均灌服相同劑量的蒸餾水。1次/d，共計40 d。

1.2.3體重和神經(jīng)功能評分每天測量記錄小鼠體重，并對其進(jìn)行神經(jīng)功能評分。神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)按照Weaver′s的15分評分方法[17]對EAE小鼠的神經(jīng)癥狀進(jìn)行觀察評分。將小鼠尾巴活動分為3個等級，肢體活動分為4個等級，通過累積分?jǐn)?shù)得出評分。若出現(xiàn)死亡則總分記為15分。

1.2.4標(biāo)本采集造模第20 d(急性期)和第40 d(緩解期)取小鼠腦和脊髓，每組10只。常規(guī)灌流，4%多聚甲醛內(nèi)、外固定。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，以2 μm厚度連續(xù)切片。

1.2.5HE染色取材組織塊固定后，常規(guī)石蠟包埋，2 μm切片。組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫至水，后用蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，再用自來水浸泡15 min。置于伊紅液2 min，最后常規(guī)脫水，透明，封片。

1.2.6IHC染色I(xiàn)HC法測定小鼠腦和脊髓中p-Tau、Beta-tubulin表達(dá)。組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫至水，PBS沖洗，放入檸檬酸緩沖液(pH6.0～6.1)，入微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫下自然冷卻至35 ℃以下，用3%H2O2室溫孵育10 min，滴加一抗稀釋液p-Tau(1∶200)/Beta-tubulin(腦1∶450，脊髓1∶500)等，放入4 ℃冰箱中孵育過夜(12 h)。取出后在室溫下復(fù)溫1 h，滴加生物素標(biāo)記的二抗，并進(jìn)行37 ℃孵育。DAB顯色1～5 min，脫水，透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，每個切片選擇5個不重疊視野照相，并用NIS-Elements BR 3.2軟件測定積分光密度值(Integrated Optical Density，IOD)。

2　結(jié)果

2.1BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠體重的影響造模前各組小鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后各小鼠體重緩慢上升，于第11天開始，與NC組比較，其他各造模組小鼠體重開始出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)。于第19天降至最低，后緩慢回升。但第19天到第40天各造模組動物體重均較NC組顯著降低(P<0.01)。在第23天到40天，BSYS和BS組小鼠體重與PA組比較，回升明顯(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

圖1　各組小鼠體重變化

圖2　各組小鼠神經(jīng)功能評分變化

圖3　各組小鼠腦組織病理學(xué)變化(HE×400)

2.2BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠神經(jīng)功能評分的影響各造模組小鼠至第12天陸續(xù)發(fā)病，其神經(jīng)功能評分呈現(xiàn)不同程度升高，此前各治療組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。第17天，各治療組評分明顯低于MO組(P均<0.05)。MO組小鼠評分于第22天達(dá)最高峰，峰值為6.5分，第22天PA與BSYS組評分明顯低于MO組(P<0.01)，HTHX組、BS組和CA組評分也低于MO組，但效果不如BSYS組明顯，尤其HTHX組與BSYS組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨后評分逐漸下降，第25天、32天，各治療組與MO組比較，評分顯著降低，其中CA組和HTHX組評分高于其他治療組，與PA、BSYS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。第35天各組小鼠病情趨于平穩(wěn)，但未恢復(fù)正常，各治療組病情較MO組均明顯減輕，PA和BSYS組評分明顯低于MO組(P<0.01)，各治療組之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義，第34天到40天，各治療組與MO組比較，評分顯著降低，其中BSYS組較PA組評分下降明顯(P<0.05)。見圖2。

2.3BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠腦與脊髓不同時間點(diǎn)病理學(xué)的影響NC組小鼠腦組織，著色均勻，結(jié)構(gòu)有序完整。MO組腦白質(zhì)血管周圍有炎細(xì)胞浸潤，核固縮明顯。PA、CA、BS、HTHX和BSYS組腦白質(zhì)血管周圍有炎細(xì)胞浸潤，部分核固縮。病理程度較MO組低。脊髓病理變化與腦相似。見圖3、圖4。

圖4　各組小鼠脊髓組織病理學(xué)變化(HE×400)

分組N腦第25天第40天脊髓第25天第40天NC44323±3844227±3964412±4884368±378MO46559±514???6200±360???6616±927???6323±602???PA44633±434##4323±793##4712±595##4392±324##CA45679±574#5202±922#5715±264#5497±361#BS44928±390#4547±407#4935±591#4657±277#HTHX45657±635#5324±397#5665±928#5498±597#BSYS44780±420##4437±385##4815±291##4576±290##

注：與NC組比較，***P<0.001；與MO組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.4BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠腦和脊髓中p-Tau的影響各組小鼠發(fā)病第25天和第40天，MO組小鼠腦p-Tau表達(dá)較NC組顯著上調(diào)(P<0.001)，各治療組小鼠腦p-Tau表達(dá)與MO組相比不同程度下降(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。各組小鼠脊髓內(nèi)p-Tau表達(dá)變化趨勢與腦相似。見表1，圖5-6。

圖5　各組小鼠腦中p-Tau蛋白的表達(dá)變化(IHC×400)

圖6　各組小鼠脊髓中P-Tau蛋白的表達(dá)變化(IHC×400)

組別N腦第25天第40天脊髓第25天第40天NC41157±1031184±0561164±0541209±054MO4853±070???887±032???866±049???906±053???PA41047±058##1089±048##1068±069##1104±060##CA4920±048#949±058#939±044#969±047#BS4973±048#990±040#983±054#1021±071#HTHX4940±049#956±056#947±057#962±052#BSYS41011±053##1033±049##1031±062##1070±052##

注：與NC組比較，**P<0.01，***P<0.001；與MO組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.5BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠腦和脊髓中beta-tubulin的影響造模第25天和第40天，MO組小鼠腦beta-tubulin表達(dá)較NC組明顯下調(diào)(P<0.01，P<0.001)，各治療組小鼠腦beta-tubulin表達(dá)與MO組相比不同程度上升(P<0.05，P<0.01)。各組小鼠脊髓內(nèi)beta-tubulin表達(dá)變化趨勢與腦相似。見表2、圖7、圖8。

圖7　各組小鼠腦中beta-tubulin表達(dá)變化(IHC×400)

圖8　各組小鼠脊髓中beta-tubulin表達(dá)變化(IHC×400)

3　討論

MS在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中屬于疑難性疾病，對于MS的治療進(jìn)展關(guān)注一直持續(xù)上升，西醫(yī)治療雖有進(jìn)展嘗試以新的藥物及治療方法替代，但仍以糖皮質(zhì)激素、β干擾素為常規(guī)治療藥物[18-21]，但存在反復(fù)發(fā)作、不良反應(yīng)發(fā)生率較高、費(fèi)用高等問題。中醫(yī)藥治療本病從理論文獻(xiàn)到臨床有自己的獨(dú)特的治療體系，并在近年的治療中取得較好的效果[8,22-27]。中醫(yī)無MS病名，可根據(jù)其臨床表現(xiàn)與病因病機(jī)歸為“骨痿”[28]，以肝腎陰虛與痰瘀阻絡(luò)為主要病機(jī)，樊永平教授以滋補(bǔ)肝腎培其本、化痰活血緩其標(biāo)[29]，二法并用標(biāo)本兼治，在長期的臨床中取得良好的治療效果，在近期的實(shí)驗(yàn)研究中亦取得成果[30-31]。通過本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BSYS方在升高EAE小鼠的體重與降低神經(jīng)功能評分的同時，顯著降低炎細(xì)胞浸潤與減輕細(xì)胞核固縮，說明本方對EAE小鼠有較好的防治作用，這些結(jié)果和以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的[12，32]，關(guān)于本方劑量的選擇，是參考以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BSYS方以3.02 g/kg為優(yōu)，并根據(jù)此將劑量計算拆方BS和HTHX方的劑量。本實(shí)驗(yàn)中以PA作為代表藥物，CA為本方君藥地黃的主要成分。在本次實(shí)驗(yàn)中，PA、CA、BS和HTHX治療組對EAE小鼠也有一定的防治作用，但以BSYS方的效果最優(yōu)。

我們又進(jìn)一步研究了本方對EAE軸突損傷及其修復(fù)作用。Tau過度磷酸化積累是多種神經(jīng)退行性病變的重要特征之一。研究報道p-Tau蛋白在MS患者中大量增加，尤其是疾病早期[33-34]。已有從MS患者腦脊液中提取Tau蛋白作為MS患者的生物標(biāo)記物，用于疾病的診斷[35]。在本次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，急性期和緩解期EAE小鼠腦和脊髓中p-Tau有顯著的升高，各治療組均有明顯降低p-Tau的作用，說明可以減少EAE小鼠的軸突損傷。各治療組之間無明顯差異。

Beta-tubulin在支持神經(jīng)元細(xì)胞骨架和沿神經(jīng)突起和突觸釋放神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，MS患者腦脊液中tubulin的含量遠(yuǎn)低于其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者與正常對照組腦脊液中tubulin的含量，認(rèn)為腦脊液中tubulin的含量可以作為軸突修復(fù)的指標(biāo)之一[36]。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EAE小鼠腦和脊髓中beta-tubulin的表達(dá)在急性期和緩解期均有顯著下降，各治療藥物顯著上升beta-tubulin的表達(dá)，可以促進(jìn)EAE小鼠軸突的修復(fù)。其中以BSYS方效果最為明顯。說明補(bǔ)腎配伍化痰活血法對于MS治療的有效性。

綜上所述，BSYS方及其拆方BS和HTHX均能EAE小鼠有防治作用，并能減輕軸突損傷及促進(jìn)其修復(fù)，尤以BSYS全方更為顯著，為臨床應(yīng)用補(bǔ)腎化痰活血法治療MS提供科學(xué)內(nèi)涵。

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(2016-03-09收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Effects of Bushen Yisui Decoction and Its Decomposed Decoctions on Expressions of p-Tau and Beta-tubulin in Brain and Spinal Cord of Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Shi Yimin1, Wang Yongqiang1, An Chen1, Zhao Hui1, Qi Fang1, Zhang Qiuxia1, Chen Zhenzhen1,Fan Yongping2, Li Ming1, Wang Lei1

(1 Beijing Key Lab of TCM Collateral Disease Theory Research, School of Chinese Medicine, Capital Medical University,Beijing100069,China; 2BeijingTiantanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China)

Objective: To observe effect of the Bushen Yisui Dection (BYD) and its decomposed Bushen Decoctions (BD) and Huatan Huoxue Decoction (HHD) on the expressions of p-Tau and beta-tubulin in the brain and spinal cord of mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Methods: C57BL/6 female mice were randomly divided into normal control (NC), model (MO) and prednisone acetate (PA), catalpol (CA), BYD, BD and HHD groups. The mice were injected subcutaneously with the antigens mixture, including 50 μg OG35-55, CFA and TB at two sites on the back on the 1st day and 7 days later, and then were injected intraperitoneally with 500 ng PTX on days 1st and 2 day later. The mice in each group were administered intragastrically once a day. Meanwhile, the body weight and neurological function of mice were observed. The brain and spinal cord of mice were removed for pathological examination on 20th and 40th day. The expressions of p-Tau and beta-tubulin were detected by immunohistochemistry analysis. Results: Compared with the MO group, the body weight and scores of mice were significantly increased in BYD, BD and HHD groups. HE staining showed a significant reduction in inflammatory cells and nuclear condensation. The expression of p-Tau was significantly reduced, while beta-tubulin was markedly increased in BYD, BD and HHD groups as well (P<0.05,P<0.01). Conclusion: BYD and its decomposed decoctions BD and HHD have neuroprotective effects on reducing weight loss and scores, inflammatory cell infiltration, axonal injury and enhancing the repair of axon in EAE mice. The effect of Bushen Yisui Decoction is more significant particularly.

Bushen Yisui Decoction and its decomposed decoctions; Multiple sclerosis; Experimental autoimmune encephalomyelitis; p-Tau; Beta-tubulin

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81273742、81573898)；北京市教委重點(diǎn)項(xiàng)目(編號：KZ201310025023)；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計劃-長城學(xué)者項(xiàng)目(編號：CIT&TCD20140329)

師一民(1990—)，男，在讀碩士，首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，研究方向：主要從事中醫(yī)藥防治腦病的基礎(chǔ)研究

李明，博士，教授，首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，Tel：(010)83911630，E-mail：13611386113@163.com；王蕾，博士，教授，首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，Tel：(010)83911626，E-mail：tmwangl@ccmu.edu.cn

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.047