羅　鋼　蔡麗英

(黃石市中心醫(yī)院，黃石，435000)

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芪參益氣滴丸對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體及谷氨酰胺合成酶表達的影響

羅鋼蔡麗英

(黃石市中心醫(yī)院，黃石，435000)

目的：探討芪參益氣滴丸對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜谷氨酰胺合成酶及谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達水平的影響。方法：選擇維通利華實驗動物研究所提供的六周齡SPF級SD大鼠80只，體重180～220 g，雄性，根據(jù)隨機數(shù)字表法分為實驗組(例數(shù)=70)、正常組(例數(shù)=10)，進行鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，一次性注射腹腔對胰島β細胞進行選擇性破壞，誘發(fā)實驗性糖尿病；應(yīng)用時由PH 4.4、0.1 mmol/L無菌的檸檬酸鈉緩沖液配制為1% STZ溶液，根據(jù)大鼠體重予以65 mg/kg左下腹腔一次性注射1% STZ，正常組注射相同體積的生理鹽水，72 h后應(yīng)用快速血糖儀檢測血糖水平；血糖水平超過16.7 mmol/L者則為糖尿病大鼠模型；隨機分為對照組(多貝斯對照組)(20只)、治療組(芪參益氣滴丸組)(30只)、糖尿病模型組(模型組)(20只)、正常組(例數(shù)=10)，應(yīng)用RT-PCR法檢測4組大鼠視網(wǎng)膜GFAP mRNA表達水平；應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法(Labelled Streptavidin Biotin Method，LSAB法)檢測4組視網(wǎng)膜的谷氨酸轉(zhuǎn)運體(Glutamate/aspartate Transporter，GLAST)表達水平；應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法(LSAB法)檢測視網(wǎng)膜上谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)的表達水平情況。結(jié)果：對照組、模型組、治療組的大鼠視網(wǎng)膜GFAP陽性表達IOD值顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組、對照組的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(Glialfibrillaryacidprotein，GFAP)陽性表達IOD值顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組的大鼠視網(wǎng)膜GFAP陽性表達IOD值顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組、模型組、治療組的大鼠視網(wǎng)膜GS陽性表達IOD值顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組、對照組的大鼠視網(wǎng)膜GS陽性表達IOD值顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組的大鼠視網(wǎng)膜谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)陽性表達IOD值顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：芪參益氣滴丸可促進視網(wǎng)膜GS和GLAST的表達，降低谷氨酸的高濃度興奮性毒性功能，保護視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞。

糖尿??；谷氨酸；芪參益氣滴丸；谷氨酰胺合成酶；谷氨酸轉(zhuǎn)運體

引發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞嚴(yán)重受損的主要原因之一為谷氨酸的高濃度興奮性毒性。大量研究表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變早期可出現(xiàn)谷氨酸循環(huán)緩慢，細胞外堆積大量的谷氨酸，濃度上升，導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡[1-2]。傳統(tǒng)糖尿病性視網(wǎng)膜病變的主要研究重點為視網(wǎng)膜毛細血管微循環(huán)障礙，且設(shè)定為血管病變導(dǎo)致視覺的缺失及視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的變性[3-4]；糖尿病患者發(fā)生眼底可見的微血管變化之前即發(fā)生視神經(jīng)膠質(zhì)細胞的存活力及細胞功能變化、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維功能的降低；近年來研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變除微血管受損外，糖尿病視網(wǎng)膜病變是一種慢性神經(jīng)阻滯細胞的退行性病變，包括谷氨酰胺代謝病變、激活小膠質(zhì)細胞、大膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生、神經(jīng)細胞凋亡加速，視網(wǎng)膜血管病變的主要原因可能為神經(jīng)膠質(zhì)及神經(jīng)元的變化[5-6]；血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞是形成糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要因素，神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞的功能變化、結(jié)構(gòu)可改變血管的通透性，視網(wǎng)膜血管通透性變化導(dǎo)致谷氨酸由血液進入視網(wǎng)膜實質(zhì)，引發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性改變[7-8]；同時與缺乏神經(jīng)營養(yǎng)因子密切相關(guān)，Müller細胞因是神經(jīng)元與血-視網(wǎng)膜屏障的橋梁，其功能及結(jié)構(gòu)具有獨特性，在導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管病變的同時，可引發(fā)神經(jīng)元功能障礙[9-10]。視網(wǎng)膜內(nèi)的重要神經(jīng)膠質(zhì)細胞為Müller細胞，細胞突起由內(nèi)界膜向外界膜伸展，內(nèi)核層為細胞體，細胞突起可貫穿全層視網(wǎng)膜，將全部視網(wǎng)膜神經(jīng)元突起及胞體均包繞及接觸[11-12]；與視網(wǎng)膜神經(jīng)元的功能及結(jié)構(gòu)密切相關(guān)；糖尿病狀態(tài)下Müller細胞的改變?yōu)楸磉_GFAP水平升高，GFAP為膠質(zhì)纖維酸性蛋白，是特征性神經(jīng)膠質(zhì)細胞標(biāo)記，最早在大腦星形膠質(zhì)細胞中的中間絲結(jié)構(gòu)蛋白中發(fā)現(xiàn)，其表達水平升高是視網(wǎng)膜神經(jīng)元受損的間接性指標(biāo)[13-14]；糖尿病視網(wǎng)膜可表現(xiàn)為膠質(zhì)反應(yīng)性活躍性增生，糖尿病視網(wǎng)膜進展的病理性改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜組織內(nèi)膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生，視網(wǎng)膜中表達GFAP水平顯著升高[15]。活血益氣類藥物可營養(yǎng)周圍神經(jīng)、中樞神經(jīng)因子功能，可促進變性受損的神經(jīng)細胞修復(fù)功能，增強膠質(zhì)細胞的代償功能，對視網(wǎng)膜神經(jīng)組織細胞具有保護神經(jīng)功能，促使神經(jīng)細胞突起生長功能。探析活血益氣法對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的谷氨酰胺合成酶及谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達水平的影響具有重要的臨床價值，故本文建立糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型，檢測糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的視神經(jīng)膠質(zhì)細胞的谷氨酰胺合成酶、谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達水平，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物維通利華實驗動物研究所提供的六周齡SD大鼠SPF級80只，體重180～220 g。

1.2實驗藥物與試劑芪參益氣滴丸(天津天士力制藥集團股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z20030139)，羥苯磺酸鈣膠囊(商品名：多貝斯，西安利君制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20000713)；Dako公司提供的LSAB通用試劑盒，Sigma公司生產(chǎn)的DAB顯色劑，Roche公司提供的細胞凋亡檢測盒，Sigma公司提供的STZ。

1.3實驗儀器Kodak公司提供的Image Plus Pro 6.0圖像分析系統(tǒng)；SAKURA CRM-440型病理切片機，SAKURA PS-53型展片器，日本SAKURA Tissue-Tek TECTM5 SM C1-042-SO型組織包埋機，日本OLYMPUS BH-2型顯微照相系統(tǒng)，日本日立H-600型電子顯微鏡，日本OLypus BH-2型光學(xué)顯微鏡，日本OLypus BX-51型數(shù)碼相機裝置，HANNA Instrumrnts-PH-200型酸度計，Mettler Toledo-AB54型精密電子天平，Roche GLUCOTREND型快速血糖儀。

1.4實驗方法1)六周齡SPF級SD大鼠80只，體重180～220 g，均為雄性，飼養(yǎng)室相對濕度55%～70%，室溫22～25 ℃；實驗期間大鼠可自由飲水及進食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，隨機分為正常組(例數(shù)=10)、實驗組(例數(shù)=70)，進行STZ一次性腹腔注射，對胰島β細胞進行選擇性破壞，誘發(fā)實驗性糖尿?。慌R時將pH 4.4、0.1 mmol/L無菌檸檬酸鈉緩沖液配制為1%的STZ溶液，根據(jù)大鼠體重，進行1%STZ一次性左下腹腔注射，65 mg/kg，正常組注射體積相同的0.9%氯化鈉注射液，建立模型前大鼠12 h禁食，72 h后尾靜脈取血，予以快速血糖儀檢測血糖；血糖超過16.7 mmol/L者則為糖尿病大鼠模型；隨機分為對照組(多貝斯對照組)(20只)、治療組(芪參益氣滴丸組)(30只)、糖尿病模型組(模型組)(20只)、正常組(例數(shù)=10)；成功建立大鼠模型后第二天對照組及治療組給藥，灌胃給藥1次/d，劑量均為0.5 g/kg，應(yīng)用蒸餾水配制羥苯磺酸鈣膠囊、芪參益氣滴丸，配制藥物溶液為100 mg/mL，1次/周，于4 ℃冰箱內(nèi)置存；正常組大鼠予以1 mL 0.9%氯化鈉溶液灌胃；實驗周期為10個月，期間予以大鼠血糖和體重定期檢測；視網(wǎng)膜切片制備：結(jié)束試驗后將大鼠處死，由頸動脈處放血，將眼球摘除，24 h內(nèi)在4 ℃下應(yīng)用4%多聚甲醛固定，順角膜邊緣將眼球壁剪開，將玻璃體、晶體、角膜除去，剩下的眼杯置入固定液內(nèi)再次48 g固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，二甲苯透明，SAKURA CRM-440型病理切片機連續(xù)切片，3 μm切片厚度；進行標(biāo)記鏈霉親合素-生物素過氧化物酶法(LSAB)進行GS、GLAST免疫組織化學(xué)染色：1)石蠟切片脫蠟，梯度乙醇水化；2)5 min流水漂洗，5 min磷酸鹽緩沖液，洗滌兩次；3)15 min3%雙氧水氧化，將內(nèi)源性過氧化物酶消除，5 min流水漂洗，5 min PBS洗滌兩次；4)室溫下10%正常牛血清(BSA)滴加，20 min濕盒孵育；5)在不同的切片內(nèi)滴加一抗：兔抗人GS多抗1:50和兔抗人GLAST多抗1:1800,24 h室溫下孵育濕盒，5 minPBS洗滌三次；6)LSAB二抗滴加，90 min室溫下濕盒孵育，5 minPBS洗滌三次；7)LSAB三抗滴加，90 min室溫下濕盒孵育，5 minPBS洗滌三次；8)0.5 min-1 min部分切片蘇木素復(fù)染，未復(fù)染部分3 min流水沖洗，進行圖像分析；梯度乙醇脫水，風(fēng)干，二甲苯透明，樹脂中性封片；在光學(xué)顯微鏡下監(jiān)測所得切片，予以Image Plus Pro6.0圖像分析系統(tǒng)定量分析未復(fù)染切片，每只大鼠取切片兩張，200倍下隨機選擇視野10處，計算陽性表達積分密度值(IOD)，IOD=平均光密度×面積。見圖1～圖8。

2　結(jié)果

2.14組視網(wǎng)膜表達GLAST表達IOD值情況對照組、模型組、治療組的大鼠視網(wǎng)膜GFAP陽性表達IOD值顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組、對照組的大鼠視網(wǎng)膜GFAP陽性表達IOD值顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組的大鼠視網(wǎng)膜GFAP陽性表達IOD值顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1　GLAST在正常組視網(wǎng)膜的表達，LSAB法×400，蘇木素復(fù)染?！　D2　GLAST在模型組視網(wǎng)膜的表達，LSAB法×400，蘇木素復(fù)染。

圖3　GLAST在治療組視網(wǎng)膜的表達，LSAB法×400，蘇木素復(fù)染?！D4　GLAST在對照組視網(wǎng)膜的表達，LSAB法×400，蘇木素復(fù)染。

圖5　GS在正常組大鼠視網(wǎng)膜的表達，LSAB法×400，未復(fù)染?！　D6　GS在模型組大鼠視網(wǎng)膜的表達，LSAB法×400，未復(fù)染。

圖7　GS在治療組大鼠視網(wǎng)膜的表達，LSAB法×400，未復(fù)染?！　D8　GS在對照組大鼠視網(wǎng)膜的表達，LSAB法×400，未復(fù)染。

2.24組視網(wǎng)膜表達GS表達IOD值變化情況對照組、模型組、治療組的大鼠視網(wǎng)膜GS陽性表達IOD值顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組、對照組的大鼠視網(wǎng)膜GS陽性表達IOD值顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組的大鼠視網(wǎng)膜GS陽性表達IOD值顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1　4組視網(wǎng)膜表達GLAST陽性表達IOD值情況

注：t/P1為模型組與正常組比較，P<0.05；t/P2為治療組與正常組比較，P<0.05；t/P3為對照組與正常組比較，P<0.05；t/P4為治療組與模型組比較，P<0.05；t/P5為治療組與對照組比較，P<0.05；t/P6為對照組與模型組比較，P<0.05。

表2　4組視網(wǎng)膜表達GS表達IOD值變化情況

注：t/P1為模型組與正常組比較，P<0.05；t/P2為治療組與正常組比較，P<0.05；t/P3為對照組與正常組比較，P<0.05；t/P4為治療組與模型組比較，P<0.05；t/P5為治療組與對照組比較，P<0.05；t/P6為對照組與模型組比較，P<0.05。

3　討論

本研究探析糖尿病大鼠予以芪參益氣滴丸對大鼠視網(wǎng)膜谷氨酰胺合成酶及谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達影響，研究結(jié)果與馬棟等[16]的研究結(jié)果大體一致，谷氨酸為視網(wǎng)膜的最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)節(jié)細胞、雙極細胞、光感受器的遞質(zhì)均為谷氨酸，谷氨酸的濃度不同，其傳遞的信號也具有一定的差異，而谷氨酸高濃度具有興奮性毒性，谷氨酸的清除降低或生成增加是導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡的主要病理機制，視網(wǎng)膜中的雙極細胞及神經(jīng)節(jié)細胞中谷氨酸的唯一源頭為Müller細胞，同時可清除視網(wǎng)膜內(nèi)外過量的谷氨酸，其細胞內(nèi)的谷氨酰胺合成酶及包膜的谷氨酸轉(zhuǎn)運體是谷氨酸降解、轉(zhuǎn)運的重要過程[17]；谷氨酰胺合成酶只在Müller細胞內(nèi)存在，Müller細胞對RGCs避免谷氨酸度毒性侵害的作用與GLAST的數(shù)量及功能密切相關(guān)；在谷氨酰胺合成酶的作用下，谷氨酸可轉(zhuǎn)化為谷氨酸胺，由Müller細胞向細胞外釋放，同時神經(jīng)細胞攝取Gln；傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病屬于“消渴”范疇，素體燥熱偏盛，陰津虧損，傷陰耗氣，引發(fā)陰陽兩虛、氣陰兩虛，瘀阻絡(luò)脈，血行不暢；燥熱陰虛、氣弱脾虛，陰損及陽，目失所養(yǎng)是糖尿病視網(wǎng)膜病變的基礎(chǔ)病機；糖尿病視網(wǎng)膜病變的進展病機為氣弱脾虛，因虛致瘀，閉塞目竅，其證候特征為虛實夾雜，本虛標(biāo)實；糖尿病視網(wǎng)膜病變的增殖前期及單純期均為氣陰兩虛證，增殖期為血瘀氣滯、陰陽兩虛；對糖尿病進行活血益氣療法可防止病變向陰陽兩虛狀態(tài)轉(zhuǎn)變；芪參益氣滴丸有降香、三七、丹參、黃芪組成，方中降香辛散氣香，行滯溫通；三七和丹參可通絡(luò)祛瘀活血，同為臣藥；黃芪為君藥，可補氣，祛瘀不傷正，氣旺則血行，促進津液運行；現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪的主要有效成分為微量元素、氨基酸、黃酮、皂苷、多糖；其中黃芪多糖可提高機體的缺氧耐受能力，通過抗氧化功能，促使抗氧化酶的GSH-Px、SOD的活性增強，促使細胞膜穩(wěn)定，促使凋亡抑制基因bcl-2的表達水平提高，p53促凋亡基因的表達下降，降低損傷神經(jīng)細胞，延緩神經(jīng)細胞凋亡進程；可促進受損后恢復(fù)神經(jīng)功能，對神經(jīng)膠質(zhì)細胞急性腦缺血期的過量表達水平進行抑制；丹參酮及丹參素可緩解微循環(huán)障礙，全血粘度下降，對血小板集聚功能進行抑制；避免脂質(zhì)的過氧化，阻斷生成羥自由基。綜上所述，芪參益氣滴丸可促進視網(wǎng)膜GS和GLAST的表達，降低谷氨酸的高濃度興奮性毒性功能，保護視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞。

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(2015-12-02收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Effect of Qishen Yiqi Dripping Pills on the Expression of Glutamate Transporter and Glutamine Synthetase in Diabetic Rats

Luo Gang,Cai Liying

(Huangshi Central Hospital,Hubei Institute of Science and Technology,Hubei 435000,China)

Objective:To investigate the effect of Shenqi Yiqi dripping pills on the expression of glutamine synthetase and glutamate transporters in the retina of diabetic rats.Methods:SD male rats 80,weight 180～220 g were randomly divided into experimental group (n=70) and normal group (n=10).The rats were modeled by STZ injection to induce experimental diabetes.The 1% STZ sterile solution was prepared by sodium citrate buffer PH4.4,0.1 mmol/L,and it was given according to the body weight of rats (65 mg/kg) through left lower abdominal cavity.Common saline were injected of the same volume on the normal group,and blood glucose level was examined by fast blood glucose meter examination after 72 h; mice whose blood glucose level over 16.7 mmol/L were categorized as the model diabetes group,and were randomly divided into the control group (calciumdobesilate control group) (n=20),treatment group (Qishen Yiqi group) (n=30),and diabetic model group (model group) (20 rats).RT-PCR method was used to detect the expression level of mRNA GFAP in four groups of rats.The expression level of glutamate transporter (GLAST) was detected by immunohistochemical staining (LSAB method) and the expression level of glutamine synthetase (GS) was detected by LSAB in four groups.Results:The positive expression of GFAP (Glial fibrillary acid protein) IOD value of the control group,model group,and treatment group were higher than the normal group with statistical difference (P<0.05).The GFAP IOD value in the treatment group and control group were higher than that of the model group (P<0.05).The GFPA IOD value in the treatment group was higher than that of the control group (P<0.05).The positive expression of GS (Glutamine synthetase) IOD value of the control group,model group,and treatment group were higher than the normal group with statistical difference (P<0.05).The GS IOD value in the treatment group and control group were higher than that of the model group (P<0.05).The GS value in the treatment group was higher than that of the control group (P<0.05).Conclusion:The expression of and GS and GLAST can be promoted by Qishen Yiqi dripping pills,which can low the toxin of high concentration of glutamate,and thus protecting retinal nerve cells.

Diabetes mellitus; Glutamic acid; Qishen Yiqi dripping pill; Glutamine synthetase; Glutamate transporter

湖北省黃石市醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目(編號：2010-04)

羅鋼(1975.09—)，男，嘉魚人，碩士研究生，湖北省黃石市中心醫(yī)院主治醫(yī)師，研究方向：眼科視神經(jīng)損傷修復(fù)、青光眼、眼外傷、白內(nèi)障等，E-mail：178536802@qq.com

蔡麗英(1977.12—)，女，漢族，大學(xué)本科，黃石市中心醫(yī)院眼科，研究方向：眼底病、角膜病眼底病、青光眼白內(nèi)障，E-mail：3326884804@qq.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.054