尚巖巖，張巖巖，王桂苓

（阜陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，安徽阜陽 236000）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水果及其制品中氯吡脲殘留量*

尚巖巖，張巖巖，王桂苓

（阜陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，安徽阜陽 236000）

建立了液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測定水果及其制品中氯吡脲的方法。樣品經(jīng)乙腈提取，氨基固相萃取小柱凈化后，用ZORBAX Extend-C18柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）分離，以甲醇-水為流動相等度洗脫，采用多反應監(jiān)測正離子模式檢測，外標法定量。氯吡脲的質(zhì)量濃度在4.0～200.0 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)大于0.999，在5.0，10.0，20.0 μg/kg 3個添加水平下，氯吡脲的平均加標回收率為86%～92%，測定結果的相對標準偏差為5.3%～7.6%（n=5），方法定量下限為2.0 μg/kg。方法靈敏度高，操作簡便，定量準確，可滿足梨、柑桔、黃桃等水果及其罐頭制品中氯吡脲殘留的檢測與確證需要。

氯吡脲；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；水果及其制品

氯吡脲［Forchlorfenuron，1-（2-氯-4-吡啶）-3-苯基脲］簡稱CPPU［1-2］，是目前人工合成的活性最高的細胞分裂素，具有加速細胞分裂、促進細胞增大與分化、誘導芽的發(fā)育、防止落花落果等作用。作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，氯吡脲近年被廣泛應用于蘋果、草莓、橘子、獼猴桃、西紅柿、黃瓜、西瓜等水果和蔬菜生產(chǎn)，以促進果實肥大、提高產(chǎn)量、保鮮等。研究表明，長期接觸氯吡脲會引起體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝紊亂、肺氣腫和體形消瘦［3］。日本“肯定列表”規(guī)定西紅柿等42種水果、蔬菜中氯吡脲最高殘留限量為0.1 mg/kg（杏仁中為0.01 mg/kg），美國和韓國規(guī)定氯吡脲在葡萄中的最高殘留限量分別為0.03， 0.05 mg/kg［3］。2009年，我國規(guī)定西瓜、黃瓜中氯吡脲最高殘留限量為0.1 mg/kg，獼猴桃、葡萄中氯吡脲最高殘留限量為0.05 mg/kg，而其它水果、蔬菜中氯吡脲最高殘留限量尚未制定標準，水果及蔬菜制品（如罐頭、果蔬飲料等）中氯吡脲最高殘留也未制定限量標準。

目前，國內(nèi)外關于氯吡脲在農(nóng)作物中殘留量的分析方法主要是液相色譜法［4-7］，胡繼業(yè)等［8］采用PSA法進行樣品前處理，以高效液相色譜法測定西瓜中的氯吡脲殘留量；Sharma等［9］研究了氯吡脲在葡萄、土壤和水中的殘留行為，使用的是HPLC-UV檢測法；Antonio Valverde等［10］采用液相色譜-飛行時間質(zhì)譜（LC/TOF-MS）法測定了蔬菜中的氯吡脲殘留；張軍等［11］采用電噴霧離子源多反應監(jiān)測模式HPLC-MS/MS法分析檢測葡萄果實中的氯吡脲；鄭玲等［12］利用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜，建立了葡萄、西瓜、柑桔、梨中的氯吡脲分析方法。筆者采用液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法，通過優(yōu)化液相色譜和質(zhì)譜檢測條件，結合固相萃取凈化技術，測定了蔬菜水果及其制品中氯吡脲的殘留量，該法具有靈敏度高、抗干擾能力強等優(yōu)點。

1　實驗部分

1.1主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，美國安捷倫科技有限公司；

三重四極桿質(zhì)譜儀：Agilent 6430型，配ES源，美國安捷倫科技有限公司；

離心機：TD16-WS型，湖南賽特湘儀離心機有限公司；

超聲波提取儀：JK-3200DB型，合肥金尼克機械制造有限公司；氮吹儀：N-EVAP 111型，美國Organomation公司；氯吡脲標準品：純度99.5%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；

氯吡脲標準儲備液：1 mg/mL，準確稱取氯吡脲標準品適量，用甲醇溶解并定容，使用時根據(jù)需要稀釋成適當濃度的標準工作液，于4℃下保存；

乙腈、甲醇：HPLC級，美國Tedia 公司；

氨基固相萃取柱：500 mg/（3 mL），美國Supelco公司；

實驗用水：屈臣氏超純水。

1.2樣品處理

1.2.1提取

準確稱取樣品5.0 g于50 mL具螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，加入3 g NaCl，振蕩混勻1 min，超聲提取30 min，以5 000 r/min 離心10 min，準確移取10 mL上層有機相，轉移至旋蒸瓶中，于45 ℃下旋轉濃縮至近干，用二氯甲烷溶解后待凈化。

1.2.2凈化

將待凈化液轉移至活化后的氨基固相萃取柱中，用10 mL二氯甲烷淋洗后，以10 mL甲醇洗脫；收集洗脫液并于40℃下用氮氣吹干，用1 mL甲醇-水（1∶1）溶液溶解定容［13］，過0.22 μm有機系微孔濾膜，供LC-MS/MS儀測定。

1.3儀器工作條件

1.3.1色譜條件

色譜柱：ZORBAX Extend-C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相：甲醇-水（50∶50），流量為0.50 mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：20 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

掃描方式：ESI正離子模式（ESI+）掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流量：10 L/min ；霧化器壓力：206.85 kPa ；毛細管電壓：4 000 V；母離子：m/z 248；定量離子：m/z 129；定性離子：m/z 93；碰撞電壓：95 V；碰撞能量：定量15 eV，定性35 eV。

2　結果與討論

2.1提取溶劑及提取方式的選擇

水果罐頭中含有大量水分，應選擇極性溶劑溶解，且試劑需對試樣中的糖、蛋白質(zhì)和脂肪的溶解性較小。本實驗中待測物具有微酸性，選擇乙腈（加入適量的鹽酸）作為提取劑，超聲波振蕩30 min提取，回收率可達90%以上。同時，對凈化方法進行優(yōu)化。在報道的氯吡脲測定方法中，凈化方法有液相萃取和固相萃取，其中固相萃取因使用溶劑量少、凈化效果好而應用較多，使用的固相萃取柱有PSA柱、活性炭柱等。根據(jù)文獻［13］，選用Waters Sep-Pak NH2固相萃取小柱，經(jīng)過陰性樣品加標試驗，確定了凈化條件，過柱回收率均在95%以上，且凈化效果好，樣品檢測時均無干擾，且無基質(zhì)抑制現(xiàn)象，可用外標法進行定量。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用1 μg/mL氯吡脲標準溶液，分別在ESI正離子和負離子模式下進行母離子掃描，結果表明，在正離子模式下具有較高的靈敏度，因此確定氯吡脲的檢測模式為ESI 正離子模式，母離子為m/z 248。優(yōu)化得到碰撞電壓為95 V，以m/z 248為母離子進行子離子掃描，選取相對豐度最強的子離子m/z 129，93作為氯吡脲的監(jiān)測離子，并分別對子離子的碰撞能進行優(yōu)化。最后在MRM模式下優(yōu)化了干燥氣溫度、干燥氣流量和霧化器壓力。在1.3.2質(zhì)譜條件下的質(zhì)譜圖見圖1。

2.3色譜條件和定容液的選擇

在正離子模式下，通常選擇乙腈-水或甲醇-水體系作為流動相。試驗對比發(fā)現(xiàn)，以甲醇-水為流動相時，待測物色譜峰形及靈敏度均較好，故選用甲醇-水體系作為流動相。同時對定容液進行選擇，分別用甲醇和不同比例的甲醇-水作為定容液進行試驗，結果表明，當定容液中甲醇的比例增大時，待測物色譜峰面積增加，色譜峰高在甲醇比例為50%時達到最高，其后峰面積的增加完全來自于峰的展寬貢獻。綜合考慮色譜峰形和響應值，選擇體積比為1∶1的甲醇-水作為定容液。在1.3.1色譜條件下加標樣品色譜圖如圖2。由圖2可知，氯吡脲與樣品基質(zhì)分離良好。

圖1　氯吡脲HPLC-MS/MS多反應監(jiān)測圖譜

圖2　2.0 μg/kg加標樣品色譜圖

2.4線性范圍、檢出限

取氯吡啶標準儲備液適量，用甲醇-水溶液（1∶1）分別稀釋成4.0，8.0，20.0，40.0，80.0，100.0，200.0 ng/L的氯吡脲系列標準工作溶液，分別進樣測定，以氯吡啶標準工作溶液的質(zhì)量濃度X（ng/L）對色譜峰面積進行線性回歸，得氯吡脲的線性方程為Y=12 391.65X+3 736.47，相關系數(shù)r2=0.999 6，表明線性良好。對空白樣品進行加標回收試驗，以信噪比為10確定本方法測定水果罐頭中氯吡脲的定量下限為2.0 μg/kg。

2.5加標回收與精密度試驗

以梨罐頭為測試樣品，分別添加氯吡脲5.0，10.0，20.0 μg/kg，每個水平做5個平行樣，樣品加標回收試驗結果見表1。由表1可知，氯吡脲的平均回收率為86%～92%，測定結果的相對標準偏差為5.3%～7.6%，表明本方法精密度和準確度均較高。

表1　氯吡脲樣品加標回收試驗結果（n=5）

3　結語

建立了水果及其制品中氯吡脲殘留檢測的LC-MS/MS分析方法。通過對儀器條件和樣品處理條件進行優(yōu)化，應用于梨、橘子、黃桃等水果飲料的檢測時，方法的靈敏度、精密度均能滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。

［1］ 張衛(wèi)煒，楊永珍.氯吡脲的研究及應用進展［J］.農(nóng)藥科學與管理，2006，27（5）： 36-40.

［2］ Shinichi A，Koya M，Zenichi M，et al. The Use of CPPU for Efficient Propagation of Pineapple［J］. Science Horticulture，2004，100： 7-14.

［3］ 史曉梅，金芬，黃玉婷，等.水果中常用植物生長調(diào)節(jié)劑的研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（4）： 417-422，426.

［4］ Liu Qiang，Gong Daxin，Peng Xiaochun，et al. Determination of forchlorfenuron dissipation and residue in cucumbers and red soil［J］. Journal of Northeast Agricultural University（English Edition），2010，17（1）： 27-31.

［5］ 侯玉茹，楊媛，石磊，等.固相萃取-高效液相色譜法檢測葡萄中氯吡脲的研究［J］.食品科技，2011，36： 255-258.

［6］ 李瑞娟，于建壘，宋國春，等.氯吡脲在獼猴桃和土中的消解動態(tài)與殘留測定［J］.山東農(nóng)業(yè)科學，2009（2）： 78-80，83.

［7］ Chen C L，Li J Z，Wu H L. Residue analysis on forchlorfenuron in watermelon soil field［J］. Environmental Chemistry，2006，25：789-792.

［8］ Hu Jiye，Li Jianzhong. Determination of forchlorfenuron residues in watermelon by solid-phase extraction and high-performance liquid Chromatography［J］. AOAC International，2006，89（6）：1 635-1 639.

［9］ Sharma D，Awasthi M D. Behaviour of forchlorfenuron residues in grape，soil and water［J］. Chemosphere，2003，50： 589-594.

［10］ Antonio V，Ana A，Carmen F，et al. Analysis of forchlorfenuron in vegetables by LC/TOF-MS after extraction with the buffered QuEChERS method［J］. Agric Food Chem，2010，58（6）：2 818-2 823.

［11］ 張軍，杜平.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄中的吡效隆和赤霉素［J］，色譜，2011，29： 1 133-1 136.

［12］ 鄭玲，李麗華，黃大新，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對水果中氯吡脲殘留的測定［J］.食品工業(yè)，2011（7）： 90-92.

［13］ 羅偉強肖小華，李攻科，等.蔬果中氯吡脲殘留樣品前處理及分析方法研究進展［J］.食品安全質(zhì)量檢測學報，2013（4）：1 090-1 092.

Determination of Forchlorfenuron Residues in Fruits and Fruit Products by LC-MS/MS

Shang Yanyan， Zhang Yanyan， Wang Guiling
（Fuyang City Product Quality Supervision and Inspection Institute， Fuyang 236000， China）

A method for determination of forchlorfenuron residues in fruits and fruit products was established by liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）. After being extracted by acetonitrile， the sample was cleaned up by solid-phase extraction NH2column. The separation of compounds was carried on a ZORBAX Extend-C18column（150 mm×2.1 mm， 5 μm） by an isocratic elution using methanol-water as mobile phase. The analyte was detected by tandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring mode with positive electrospray ionization. The forchlorfenuron was quantified by external standard method. Under the optimal conditions， the calibration curve showed a good linearity over the concentration of forchlorfenuron in the range of 4.0-200.0 ng/mL with a correlation coefficient more than 0.999. The average recoveries from spiked samples at three concentration levels of 5.0， 10.0， 20.0 μg/kg ranged from 86%-92% with the relative standards deviations of 5.3%-7.6%（n=5）， the limit of quantitation was 2.0 μg/kg. The method is simple and suitable for the determination and confirmation of forchlorfenuron in pear， orange and yellow peach or their canned products.

forchlorfenuron； liquid chromatography-tandem mass spectrometry； fruit and fruit products

O657.7

A

1008-6145（2016）02-0031-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.02.009

*國家質(zhì)檢總局項目（2011QK166）

聯(lián)系人：張巖巖；E-mail： youyouqingren12@sina.com

2015-12-31