郭再玉，張合亮，水濤，張國哲，趙衛(wèi)華，陳謙，侯延偉

VEGF165在恒河猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定

郭再玉，張合亮，水濤，張國哲，趙衛(wèi)華，陳謙，侯延偉

目的探討血管內(nèi)皮生長因子（VEGF165）轉(zhuǎn)染恒河猴間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）后的表達(dá)情況，以及轉(zhuǎn)染后對MSCs功能的影響。方法通過Ficoll法分離并培養(yǎng)恒河猴骨髓MSCs，進行細(xì)胞表型鑒定。轉(zhuǎn)染pcDNA-eGFPVEGF165至MSCs，熒光顯微鏡觀察增強型綠色熒光蛋白（eGFP）表達(dá)情況，同時流式細(xì)胞技術(shù)對轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進行細(xì)胞表型及eGFP表達(dá)鑒定，RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后VEGF165表達(dá)情況。結(jié)果成功分離到純度較高的MSCs，轉(zhuǎn)染后的MSCs及子代細(xì)胞均有eGFP和VEGF165的表達(dá)，且保留了MSCs的特性。結(jié)論VEGF165基因轉(zhuǎn)染MSCs后可以穩(wěn)定表達(dá)外源基因，且可以維持MSCs的特性。

間質(zhì)干細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子；恒河猴；轉(zhuǎn)基因；間質(zhì)干細(xì)胞移植；綠色熒光蛋白質(zhì)類

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是源于中胚層的干細(xì)胞，不僅有保持自我更新的能力，而且還具有多向分化潛能。MSCs主要存在于骨髓、臍帶、胎盤或者脂肪細(xì)胞，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）含量最為豐富［1］。煙霧病（moyamoya disease，MMD）是一種慢性腦血管閉塞性疾病，于1957年首次報道［2］，可導(dǎo)致腦缺血或腦梗死，且兒童發(fā)病率高于成人［3］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是機體生理活動的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，主要影響骨骼生長和生殖功能。有研究將VEGF基因轉(zhuǎn)染到神經(jīng)干細(xì)胞中，可減少缺血所導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并促進新生血管的形成，降低缺血早期的血管和神經(jīng)結(jié)構(gòu)損害［4］。目前研究已發(fā)現(xiàn)移植MSCs可保護腦卒中模型大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)［5］。因此，本研究擬通過觀察轉(zhuǎn)染VEGF165對恒河猴BMSCs的影響，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療MMD提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物普通級健康雄性恒河猴3只，3歲齡，體質(zhì)量3～4 kg，購自成都平安動物繁育中心。

1.1.2 試劑和儀器MSCs培養(yǎng)基購自O(shè)siris Therapeutics公司。DMEM培養(yǎng)基、山羊血清（NGS）、0.25%胰酶、雙抗、表皮細(xì)胞生長因子（EGF）、TRIzol、lipofectamine 2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Life Technologies公司。胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司。APC標(biāo)記抗人CD29，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗人CD34，PE標(biāo)記的抗人CD45均購自美國BD Biosciences Pharmingen公司，已驗證可與恒河猴存在交叉反應(yīng)。細(xì)胞密度梯度分離液（Ficoll）購自Sigma公司。pcDNA-eGFP-VEGF165載體購自天津天思特生物科技有限公司。超微量分光光度計（NanoDrop2000C型）、PCR儀（AppliedBiosystems?GeneAmp?9700型）購自賽默飛世爾公司，Ti-U倒置熒光顯微鏡購自尼康公司。

1.1.3 引物設(shè)計從GenBank獲取VEGF的基因序列，根據(jù)其編碼區(qū)的堿基序列，設(shè)計引物。β-actin為管家基因，所有引物由華大基因公司合成，各引物序列見表1。

Tab.1Primer sequence of genes that were amplified by RT-PCR表1 RT-PCR檢測的基因引物序列

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離用3%的戊巴比妥鈉以25 mg/kg靜脈給藥和1%的異氟烷氣體全身麻醉動物［6］。備皮后用骨穿針行髂后上棘髂骨穿刺，穿刺成功后，用20 mL注射器抽取5～10 mL骨髓，迅速轉(zhuǎn)移到含有5 U肝素的無菌離心管內(nèi)混勻［7］。對抽取的骨髓先用1倍體積的PBS重懸，然后加入1倍體積的Ficoll（1.077 g/mL）進行密度梯度離心，用含10% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基懸浮骨髓單個核細(xì)胞，調(diào)整密度至1×106/mL，按每瓶5 mL接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)［8］。48 h后半量換液，觀察細(xì)胞貼壁情況并隔天全量換液。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%后，用含EDTA的0.25%胰酶消化傳代，逐日觀察細(xì)胞生長情況和形態(tài)特征。

1.2.2 MSCs的細(xì)胞表型鑒定收集第4代MSCs，1 mL PBS重懸浮細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌3次，最后用100 μL PBS重懸細(xì)胞。分別加入10 μL熒光標(biāo)記的CD29、CD34和CD45抗體，室溫避光孵育30 min。加PBS至1 mL，1 000 r/min離心5 min，以同型抗體作為陰性對照，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原類型。

1.2.3 VEGF165的轉(zhuǎn)染及鑒定將分離的MSCs進行計數(shù)，取4×105個細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板。細(xì)胞融合度達(dá)到60%時，按照說明書將4 μg的pcDNA-eGFP-VEGF165與10 μL lipofectamine 2000混勻，室溫孵育25 min，加入6孔板的細(xì)胞中，37℃孵育6 h后換液，熒光顯微鏡下觀察增強型綠色熒光蛋白（eGFP）的表達(dá)。為了獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞，利用lipofectamine 2000再次轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞傳代培養(yǎng)，經(jīng)過3次細(xì)胞培養(yǎng)傳代后，通過流式鑒定獲取eGFP表達(dá)陽性細(xì)胞，將其命名為VM-MSCs。

1.2.4 VM-MSCs細(xì)胞表型鑒定取對數(shù)生長期的P5代VM-MSCs，0.25%胰酶消化后，按照1.2.2的方法進行細(xì)胞表型鑒定。

1.2.5 RT-PCR檢測VM-MSCs中VEGF165的表達(dá)分別取未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、轉(zhuǎn)染后的VM-MSCs P1代細(xì)胞及P5代細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA并測定RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL:10 μL的2×PCR master mix，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，無菌水7 μL，反應(yīng)條件:95℃5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃7 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 MSCs的培養(yǎng)鏡下觀察結(jié)果顯示，分離的MSCs接種后6 h逐漸貼壁，呈圓形的小亮點，為骨髓單核細(xì)胞。約24 h后細(xì)胞完成貼壁，細(xì)胞出現(xiàn)突起；48 h后，細(xì)胞數(shù)目增多，排列成集落，見圖1。1周后細(xì)胞呈細(xì)長梭形，可進行傳代。

Fig.1Primary culture of MSCs（×100）圖1 原代培養(yǎng)的MSCs（×100）

2.2 MSCs的表面抗原鑒定流式結(jié)果顯示，分離的MSCs CD29表達(dá)陽性，CD34和CD45表達(dá)陰性，其中CD29+為99.7%，CD34-為99.5%，CD45-為99.7%，與MSCs的特征相一致［9］，同時結(jié)合細(xì)胞形態(tài)可確定所分離細(xì)胞為MSCs，且純度較高，見圖2。

Fig.2Results of MSCs detected by flow cytometry圖2 MSCs表面抗原流式鑒定結(jié)果

2.3 VEGF165的表達(dá)鑒定pcDNA-eGFP-VEGF165轉(zhuǎn)染后24 h，可觀察到eGFP的表達(dá)。經(jīng)過再次轉(zhuǎn)染、傳代培養(yǎng)后，VM-MSCs中可觀察到eGFP的表達(dá)，見圖3。因為表達(dá)載體中VEGF與eGFP是融合表達(dá)，所以VM-MSCs可穩(wěn)定表達(dá)外源基因VEGF。同時流式結(jié)果顯示，VM-MSCs中既表達(dá)eGFP，同時又保留了MSCs的細(xì)胞特征，見圖4。

2.4 RT-PCR結(jié)果與未轉(zhuǎn)染的MSCs細(xì)胞相比，VEGF165在P1代及P5代的VM-MSCs中穩(wěn)定表達(dá)，見圖5。

Fig.3The expression of eGFP in the transfected MSCs圖3 eGFP在轉(zhuǎn)染后的MSCs中的表達(dá)

Fig.4Rh MSCs cells that were over-expressed VEGF165detected by flow cytometry圖4 過表達(dá)VEGF165基因的Rh MSCs細(xì)胞表型流式檢測結(jié)果

Fig.5The transfected VEGF165expressions in different stages圖5 轉(zhuǎn)染后不同時段VEGF165的表達(dá)

3 討論

骨髓來源的MSCs有強大的自我更新和增殖能力，可誘導(dǎo)分化成軟移植骨細(xì)胞、神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞等［10］。既往研究顯示，從大齡恒河猴分離出的MSCs增殖速度較緩慢，倍增時間為5～7 d，增殖能力不強［11］。為了獲得增殖能力較強的MSCs，在本實驗中選用3歲齡恒河猴。MSCs的表面標(biāo)記分子主要是CD19、CD29、CD34、CD44、CD90和CD105［12］。結(jié)合以往研究［13］，本實驗中選了CD29、CD34和CD45這3個標(biāo)記分子進行檢測，結(jié)果證實所分離的細(xì)胞為MSCs。

VEGF是由兩個相同分子量亞基以二硫鍵結(jié)合形成的二羥聚體。由于VEGF mRNA在外顯子6和外顯子7的剪接方式不同，可得到VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF2067種同種異構(gòu)體，且各異構(gòu)體具有相同的生物學(xué)特性［14］。目前研究比較成熟的是VEGF165。VEGF165是一種分泌型可溶性蛋白，可與游離的肝素和類肝素蛋白多糖結(jié)合，能直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性［15］。已有研究證明在腦缺血早期使用VEGF，能有效改善缺血區(qū)的血液供應(yīng)狀況，減少神經(jīng)組織的破壞［16］。同時VEGF能促進血管生長，抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，這對誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞維持神經(jīng)干細(xì)胞的特性，促使其發(fā)揮生物潛能，具有積極意義［14］。

本研究結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染后的MSCs能高效地表達(dá)eGFP。RT-PCR結(jié)果表明VEGF成功轉(zhuǎn)入MSCs內(nèi)，并能持續(xù)表達(dá)，且VEGF與eGFP共轉(zhuǎn)染對eGFP的表達(dá)沒有影響，對MSCs的生長和誘導(dǎo)分化也無明顯影響。雖然脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染的基因多數(shù)為瞬時表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率不及病毒介導(dǎo)法，但其具有安全性好、細(xì)胞毒性小、不存在免疫源性、操作相對簡便的優(yōu)點。腦缺血后內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGF受體的表達(dá)高峰局限于缺血早期的1～2周內(nèi)，瞬時表達(dá)的VEGF只可以暫時達(dá)到治療目的。為了保證穩(wěn)定治療，本實驗利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染MSCs后篩選的穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞作為后期研究的細(xì)胞源。如果移植永久表達(dá)VEGF的細(xì)胞，則腦缺血后期VEGF能否起到基因治療的目的尚存疑問。因為VEGF可增加血管通透性，可能會促進腦水腫的進展。最為理想的方法是在過表達(dá)載體的啟動子選擇中使用與MMD進程正相關(guān)的基因的啟動子，可以調(diào)控VEGF的表達(dá)與MMD進展一致，但該方法需進一步的實驗驗證。本研究成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)VEGF的MSCs，運用骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為載體，為進行轉(zhuǎn)基因移植治療提供了可能。

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（2016-05-20收稿2016-08-30修回）

（本文編輯胡小寧）

Expression and identification of VEGF165in bone marrow mesenchymal stem cells of rhesus

GUO Zaiyu，ZHANG Heliang，SHUI Tao，ZHANG Guozhe，ZHAO Weihua，CHEN Qian，HOU Yanwei
Department of Neurosurgery，Teda Hospital of Tianjin，Tianjin 300456，China

ObjectiveTo detect the transferred vascular endothelial growth factor（VEGF）165gene expression in rhesus autologous bone marrow mesenchymal stem cells（MSCs），and to explore the functional viability of transgenic MSCs. MethodsMSCs from rhesus bone were isolated by Ficoll，which were used to detect the phenotype.After the culturing，the expression vector pcDNA-eGFP-VEGF165was transfected into bone marrow MSCs.Fluorescence microscope and flow cytometry were used to detect the enhanced green fluorescent protein（eGFP）expression.At the same time，the phenotype in transfected MSCs was also indentified.The VEGF165expression level was detected by RT-PCR.ResultsThe highly purified MSCs were collected successfully.The transfected MSCs and daughter cells showed expressions of eGFP and VEGF165，which also remained the characteristics of MSCs.ConclusionThe VEGF165gene that is transfected into MSCs can maintain characteristics of MSCs，and stably express foreign genes.

mesenchymal stem cells；vascular endothelial growth factor；macaca mulatta；transgenes；mesenchymal stem cell transplantation；green fluorescent proteins

R743.3

A

10.11958/20160444

濱海新區(qū)衛(wèi)生局科技項目（2011BHKZ007）

天津市泰達(dá)醫(yī)院神經(jīng)外科（郵編300456）

郭再玉（1969），男，副主任醫(yī)師，博士（后），主要從事神經(jīng)外科研究