彭少靜，鄧華英，張媛媛，胡書月，丁玲玲，李繼祥（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460）

重慶地區(qū)豬肉樣品中豬鏈球菌污染、血清型、耐藥性及致病性

彭少靜，鄧華英，張媛媛，胡書月，丁玲玲，李繼祥*
（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460）

采集于重慶地區(qū)屠宰場的豬頜下淋巴結(jié)398 份和農(nóng)貿(mào)市場豬肉樣品140 份，經(jīng)選擇增菌培養(yǎng)后分離出豬鏈球菌132 株，平均檢出率為24.5%（132/538），其中屠宰場和農(nóng)貿(mào)市場樣品的檢出率分別為26.7%（106/398）和18.6%（26/140）。經(jīng)血清型特異性聚合酶鏈式反應(yīng)檢測，樣品中豬鏈球菌血清1型、2型、7型和9型菌株的檢出率分別3.16%（17/538）、3.16%（17/538）、6.88%（37/538）和1.67%（9/538）；藥敏紙片法檢測18 株細菌的耐藥性，發(fā)現(xiàn)對青霉素類和頭孢菌素類藥物100%敏感，對氨基糖苷類、四環(huán)素類和磺胺類藥物耐藥性嚴重；小白鼠用于部分菌株的感染實驗，結(jié)果顯示分離菌株均有致病性。研究結(jié)果表明，屠宰生豬及農(nóng)貿(mào)市場豬肉存在多種血清型的致病性豬鏈球菌污染。

豬鏈球菌；豬肉；血清型；耐藥性；致病性

豬鏈球菌（Streptococcus suis，S. suis）歸類于鏈球菌屬（Streptococcus），為卵圓形、短鏈狀排列的G＋兼性厭氧菌，是重要的人畜共患病的病原菌[1]。豬鏈球菌感染最初由荷蘭學(xué)者Janson和van Dorssen于1951年報道，隨后在所有養(yǎng)豬發(fā)達國家均有報道檢出[2]。從發(fā)病豬中分離到的豬鏈球菌大多屬于血清1～8型，其中又以血清2型菌株占主導(dǎo)[3-4]；不常見的血清型菌株也可以引起嚴重感染，如血清9型菌株較頻繁地發(fā)生于比利時、荷蘭和德國，且與斷奶仔豬的敗血癥、腦膜炎和肺炎的爆發(fā)有關(guān)[5]。自1968年首次在丹麥報道人感染豬鏈球菌以來，世界許多國家或地區(qū)也相繼報道[6]。豬鏈球菌主要通過破損的皮膚、傷口和消化道黏膜等途徑感染人，多發(fā)生于與豬密切接觸的人群（如養(yǎng)豬場工人、獸醫(yī)、屠夫、肉品加工人員等）和食用未煮熟的污染肉品的人群[7-8]。我國自1998年以來，有多起由此引起的食品安全事件，尤其是2005年6—8月在四川地區(qū)發(fā)生的人感染豬鏈球菌事件最為嚴重[9-10]，但在豬肉安全性評價過程中更關(guān)注致瀉性大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特菌等，而忽略豬鏈球菌的污染。

本實驗從重慶地區(qū)2 個區(qū)縣的屠宰場采集豬頜下淋巴結(jié)及農(nóng)貿(mào)市場采集鮮豬肉（精瘦肉），經(jīng)選擇增菌培養(yǎng)后分離鑒定豬鏈球菌，并對分離菌株的血清型、耐藥性、致病性進行測定，了解屠宰生豬及市售鮮豬肉豬鏈球菌污染狀況及污染菌特性，為防止人感染豬鏈球菌提供監(jiān)測數(shù)據(jù)和資料。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

托-休氏培養(yǎng)基（Todd-Hewitt broth，THB） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；多黏菌素E、萘啶酮酸 上海圻明生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑、DL2000 DNA Maker 大連TaKaRa公司；瓊脂糖 美國Invitrogen公司；Gold View核酸染料 北京賽百勝生物技術(shù)公司；藥敏紙片（批號20140901） 杭州微生物試劑有限公司；T100TMThermal Cycler、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與選擇增菌培養(yǎng)

于2014年3—11月隨機采集重慶地區(qū)生豬定點屠宰場豬頜下淋巴結(jié)和農(nóng)貿(mào)市場鮮豬肉樣品，4 ℃保存并立即送實驗室處理。在無菌條件下取樣品深層組織約1.0 g并用無菌眼科剪制成肉漿，加入5.0 mL選擇增菌培養(yǎng)液（THB液體培養(yǎng)基中含15.0 μg/mL多黏菌素E和30.0 μg/mL萘啶酮酸），置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)物在室溫條件下混勻并放置10 min以自然沉淀組織塊，上層液體用于豬鏈球菌的檢測。

1.2.2 豬鏈球菌的分離與鑒定

將增菌培養(yǎng)液在選擇營養(yǎng)瓊脂平板（THB，1.2%瓊脂粉，15.0 μg/mL多黏菌素E，30.0 μg/mL萘啶酮酸）上劃線接種，37 ℃培養(yǎng)16～18 h；挑取圓形、表面光滑濕潤、無色透明、直徑1～2 mm的單菌落進行純培養(yǎng)并革蘭氏染色鏡檢，將革蘭陽性、成對或鏈狀排列的球菌判為疑似豬鏈球菌。按文獻[11]的方法提取細菌基因組DNA；按文獻[12]的報道，以豬鏈球菌種特異性基因gdh為靶基因合成特異性引物gdh-1（CCATGGACAGATAAAGATGG）和g d h-2（G C AG C G TAT T C T G T C A A AC G）（上海立菲生物技術(shù)有限公司合成）并進行PCR分析。豬鏈球菌的預(yù)期擴增片段為688 bp。PCR體系（25.0 μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL（不含M g2＋）、M g C l22.0 m m o l/L、d N T P s 0.2 mmol/L、引物gdh-1和gdh-2各0.4 μmol/L、基因組DNA 1.0 μL、Taq酶1.5 U，加去離子水至25.0 μL。PCR在Bio-Rad T100 Thermal cycler上進行，反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，循環(huán)35 次；72 ℃終延伸 7 min。取6.0 μL PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.2.3 豬鏈球菌的血清型鑒定

利用血清型特異性PCR對豬鏈球菌分離菌株進行血清型鑒定。血清1型和9型按文獻[13]、血清2型按文獻[14]和血清7型按文獻[15]的報道合成血清型特異性引物并進行PCR。

1.2.4 豬鏈球菌的體外藥物敏感性測定

藥敏實驗采用紙片擴散法[16]，質(zhì)控菌為金黃色葡萄球菌ATCC29213。待測細菌單菌落接種于THB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，稀釋菌液至1.5×108CFU/mL；用滅菌棉拭子蘸取菌液并在管內(nèi)壁擠壓去除多余菌液后涂布THB營養(yǎng)瓊脂平板（平皿直徑90 mm，培養(yǎng)基中瓊脂含量1.2%，培養(yǎng)基厚度約4 mm）；每個培養(yǎng)皿均勻放置7 個藥敏紙片，4 ℃放置1 h后置37 ℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈的直徑。根據(jù)杭州微生物試劑有限公司藥敏紙片法的抑菌范圍解釋標準進行細菌對藥物敏感性判定。

1.2.5 豬鏈球菌的致病性測定

豬鏈球菌經(jīng)THB液體培養(yǎng)基在37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，離心，沉淀用滅菌生理鹽水懸浮成1.5×108CFU/mL。7 周齡昆明系小鼠腹腔接種0.5 mL/只，每菌株接種3 只?？瞻讓φ战M小鼠腹腔注射THB液體培養(yǎng)基0.5 mL/只。攻毒后，連續(xù)觀察至少15 d，記錄精神狀態(tài)、飲欲、食欲、發(fā)病及死亡情況。死亡小鼠立刻剖檢，存活小鼠15 d后捕殺、剖檢，觀察病理變化。無菌條件下采取心、肝、脾等進行病原菌分離，鑒定所分離菌株是否為攻毒細菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬鏈球菌的分離與鑒定

538 份樣品經(jīng)選擇增菌培養(yǎng)、分離純化、gdh基因PCR檢測，共獲得132 株豬鏈球菌，檢出率為24.5%；其中頜下淋巴結(jié)樣品的檢出率為26.6%（106/398），鮮肉的檢出率為18.6%（26/140）（表1）。按樣品來源地，重慶YC區(qū)和RC區(qū)樣品的檢出率分別為27.1%（54/199）和23.0%（78/339）；按采樣時間，春季（3—5月）和夏秋季（7—11月）的檢出率分別為17.3%（54/312）和34.5%（78/226）。經(jīng)χ2檢驗，春季和夏秋季樣品豬鏈球菌檢出率間差異極顯著（χ2= 20.03），頜下淋巴結(jié)和鮮肉的檢出率差異不顯著（χ2= 3.21），YC區(qū)和RC區(qū)樣品的檢出率差異不顯著（χ2= 0.94）。

表1 樣品中豬鏈球菌的檢出率Table 1 Detection rate of S. ssuuiiss from pork samples

2.2 豬鏈球菌的血清型

132 株豬鏈球菌，經(jīng)血清分型特異性PCR鑒定，豬鏈球菌血清1型、2型、7型和9型菌株數(shù)分別為17、17、37 株和9 株，其中不同樣品的檢出情況見表1。頜下淋巴結(jié)樣品中7型檢出率最高（7.54%），鮮肉中沒有檢出9型菌株，而2型菌株的檢出率分別為2.97%和5.00%。YC樣品的血清1型、2型和7型的檢出率均在5%左右；RC區(qū)樣品以7型為主（6.77%），血清2型的檢出率為1.77%。夏秋季節(jié)采集樣品中4 種血清型菌株的檢出率均高于春季樣品，其中血清7型菌株在夏秋樣品中的檢出率最高（11.9%），2型菌株的檢出率為4.42%。

豬鏈球菌按照莢膜抗原性的差異可分為35 個血清型，最具有公共衛(wèi)生意義的是血清1型、2型、7型和9型菌株。本工作采集的屠宰場豬頜下淋巴結(jié)和農(nóng)貿(mào)市場鮮肉樣品通過選擇增菌培養(yǎng)后豬鏈球菌的檢出率分別為26.6%和18.6%，其中血清1型、2型、7型和9型菌株的檢出率分別為3.16%、3.16%、6.88%和1.67%，尤其是夏秋季節(jié)的污染要高于春季。王楷宬等[17]調(diào)查重慶市17 個區(qū)縣表觀健康豬腭扁桃體的豬鏈球菌帶菌率為16.54%（225/1 360），其中血清1型、2型、7型和9型菌株的檢出率分別為0（0/1 360）、0.29%（4/1 360）、0.22%（3/1 360）和0.22%（3/1 360）。楊珍等[18]從我國20 個不同地區(qū)采集的248 份豬扁桃體樣品中共檢出14 株豬鏈球菌，檢出率為5.65%，其中3 株為豬鏈球菌2型，2 株為豬鏈球菌7型，1 株為豬鏈球菌9型，8 株未定血清型；20 個采樣點中7 個采樣點檢出豬鏈球菌，其他13 個采樣點未檢出豬鏈球菌。楊筱薇等[19]對上海地區(qū)屠宰場豬扁桃體樣品的檢測，豬鏈球菌的檢出率10.4%（24/231），其中2型、7型和9型的檢出率分別為4.33%（10/231）、1.30%（3/231）和1.30%（3/231）；臧瑩安等[20]對廣州某大型農(nóng)貿(mào)市場表觀健康的豬肉攜帶豬鏈球菌的調(diào)查，陽性率13.6%（9/66），但未分離出血清1型、2型、7型和9型菌株。由此可見，重慶地區(qū)采樣調(diào)查的2個區(qū)縣豬鏈球菌及1型、2型、7型和9型菌株對屠宰生豬及農(nóng)貿(mào)市場鮮肉的污染較為嚴重。

2.3 體外藥物敏感性

從分離鑒定的132 株豬鏈球菌中隨機抽取的18 株細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素中的青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻吩、頭孢曲松、頭孢吡肟和頭孢拉定等100%敏感；對氨基糖苷類抗生素鏈霉素、丁胺卡那霉素和慶大霉素的耐藥菌株分別為15、10 株和4 株；對磺胺異惡唑和復(fù)方新諾明的耐藥菌株分別為18 株和16 株；對氟苯尼考耐藥1 株；對四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、阿奇霉素、紅霉素、克拉霉素和氟苯尼考的耐藥菌株分別為16、14、8、7、6、5 株和1 株；對氟喹諾酮類藥物左氧氟沙星、氟羅沙星和環(huán)丙沙星的耐藥菌株分別為1、2 株和1 株。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213對各藥物的敏感性實驗結(jié)果符合要求。

豬鏈球菌基因組中廣泛存在與四環(huán)素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類等藥物耐藥相關(guān)的基因元件，這些元件可以通過不同的方式插入并整合到化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌和無乳鏈球菌等細菌中[21]。豬鏈球菌已成為動物和人的重要耐藥性病原性細菌[22]。本實驗對18 株豬鏈球菌進行的體外藥敏實驗結(jié)果顯示，對青霉素類和頭孢類藥物敏感性最高，其次是喹諾酮類及酰胺醇類藥物，對氨基糖苷類、四環(huán)素類和磺胺類藥物耐藥性嚴重。因此，在臨床用藥上，青霉素對豬鏈球菌保持良好的效果，依然是主要治療藥物，其次選擇頭孢菌素類、喹諾酮類藥物等藥物作為輔助沿療。由于濫用和不合理使用抗菌藥物是導(dǎo)致病原性細菌耐藥性日趨嚴重的主要因素，建議選擇性地避免、控制或限制某些或某類抗生素的應(yīng)用，或者輪換應(yīng)用抗生素。在我國養(yǎng)殖業(yè)中，加強獸用抗菌藥物的監(jiān)管，做好病原學(xué)診斷及敏感藥物篩選，既可以減少盲目性、節(jié)約成本、達到有效防治，更重要的是降低耐藥性的產(chǎn)生。

2.4 對小白鼠的致病性

豬鏈球菌血清1型菌株、2型、7型和9型分離菌株中各隨機抽取5 株用于致病性測定，實驗菌株均能導(dǎo)致小白鼠100%感染發(fā)病，小鼠死亡情況見表2。從表2可知，除7型的R345株、9型的Y188株和Y1983株細菌引起部分小鼠死亡外，其他17 株分離細菌都能全部致死實驗小白鼠。急性發(fā)病死亡小鼠表現(xiàn)為被毛松亂、四肢及尾部末梢發(fā)青，臨死前呼吸急促、呈趴臥狀；剖檢呈現(xiàn)肝臟和脾臟腫大出血、肺臟充血出血；所有死亡小鼠均能從心、肝和脾檢出與接種一致的豬鏈球菌。病程超過120 h的接種小鼠均表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀，死亡后解檢呈現(xiàn)腦膜充血出血，僅在肝臟中分離鑒定出與接種相一致的豬鏈球菌；未死亡小鼠，捕殺后剖檢無明顯病變，但可從肝臟中檢出與接種一致的豬鏈球菌?？瞻讓φ战M小鼠在實驗過程中未表現(xiàn)出明顯異常，在實驗結(jié)束時捕殺，剖檢無明顯異常，未檢出豬鏈球菌。

表2 20 株豬鏈球菌接種后不同時間致病性結(jié)果Table 2 Pathogenicity of 20 S. suis strains at different times postinoculation

豬鏈球菌不同血清型或同一血清型間不同菌株間的致病性差異也較大，有報道指出國內(nèi)許多分離株接種普通小鼠后均不能使小鼠發(fā)病[23]，而本研究測定的20 株細菌對小白鼠均有致病性。豬鏈球菌2型能引起豬的急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、心內(nèi)膜炎，可通過帶菌動物和污染肉品感染飼養(yǎng)、屠宰、肉品加工等人員，甚至導(dǎo)致食源性感染；除2型以外的其他血清型菌株也有感染動物和人的報道[24-25]。因此，在關(guān)注豬鏈球菌2型菌株的污染及危害的同時，也應(yīng)重視其他血清型菌株對養(yǎng)殖業(yè)和人類健康的威脅。

3 結(jié) 論

重慶地區(qū)2 區(qū)縣屠宰場的豬頜下淋巴結(jié)和農(nóng)貿(mào)市場豬肉經(jīng)選擇增菌培養(yǎng)及細菌分離鑒定，豬鏈球菌的檢出率為24.5%（132/538），其中血清1型、2型、7型和9型菌株的檢出率分別為3.16%、3.16%、6.88%和1.67%。藥敏紙片法檢測18 株豬鏈球菌的耐藥性，發(fā)現(xiàn)對青霉素類和頭孢菌素類藥物100%敏感，對氨基糖苷類、四環(huán)素類和磺胺類藥物耐藥性嚴重。腹腔接種，20 株豬鏈球菌均能100%致小白鼠發(fā)病，除7型的R345和9型的Y188、Y198不能完全致死小白鼠外，其余17 株細菌能100%致死小白鼠，但2型菌株R260和R316引起死亡發(fā)生在接種后288 h。本實驗結(jié)果顯示，重慶地區(qū)屠宰生豬及農(nóng)貿(mào)市場豬肉存在多種血清型的致病性豬鏈球菌污染。

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Contamination, Serotype, Drug Resistance and Pathogenicity of Streptococcus suis from Pork Samples in Chongqing

PENG Shaojing, DENG Huaying, ZHANG Yuanyuan, HU Shuyue, DING Lingling, LI Jixiang*
(Department of Veterinary Medicine, Rongchang Campus, Southwest University, Chongqing 402460, China)

A total of 132 strains of Streptococcus suis (S. suis) were isolated from 398 submaxillary lymphonodi samples collected from pig slaughterhouses and 140 pork samples collected from farmers’ markets in Chongqing. The average contamination rate of S. suis in the total samples was 24.5% (132/538). In addition, the S. suis contamination rates of submaxillary lymphonodi and pork were 26.7% (106/398) and 18.6% (26/140), respectively. The serotype-specic PCR assays were used to identify the serotypes and the detection rates of serotype 1, 2, 7, and 9 were 3.16% (17/538), 3.16% (17/538), 6.88% (37/538) and 1.67% (9/538) in samples, respectively. The drug resistance of 18 isolates was evaluated by K-B method. The results exhibited that these isolates were strongly tolerant to aminoglycosides, tetracyclines and sulfonamides, but sensitive to penicillins and cephalosporins. Infection experiments in mice were conducted to determine the virulence of 15 of the isolates. It was shown that these isolates were pathogenic differently to mice. The results of this study indicated that much attention should be paid to multi-serotype S. suis contamination of pig carcass and pork in quarantine.

Streptococcus suis; pork; serotype; drug resistance; pathogenicity

10.7506/spkx1002-6630-201604042

TS201.6

A

1002-6630（2016）04-0233-05

彭少靜, 鄧華英, 張媛媛, 等. 重慶地區(qū)豬肉樣品中豬鏈球菌污染、血清型、耐藥性及致病性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 233-237. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604042. http://www.spkx.net.cn

PENG Shaojing, DENG Huaying, ZHANG Yuanyuan, et al. Contamination, serotype, drug resistance and pathogenicity of Streptococcus suis from pork samples in Chongqing[J]. Food Science, 2016, 37(4): 233-237. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604042. http://www.spkx.net.cn

2015-05-07

彭少靜（1990—），女，碩士研究生，研究方向為動物疫病與動物性食品安全。E-mail：1003708128@qq.com

*通信作者：李繼祥（1968—），男，教授，博士，研究方向為動物疫病與動物性食品安全。E-mail：jixianglucky@126.com