劉曉鵬，張俊霞，姜 寧,，宋宜枝，向極釬，王秋霜，吳 皓（.湖北民族學院生物科學與技術(shù)學院，湖北 恩施 445000；.南京醫(yī)藥股份有限公司博士后工作站，江蘇 南京 00；.南京中醫(yī)藥大學博士后流動站，江蘇 南京 00）

響應面試驗優(yōu)化超聲輔助提取連錢草多糖工藝及其體外抗氧化活性

劉曉鵬1,2,3，張俊霞1，姜 寧1,*，宋宜枝1，向極釬1，王秋霜2，吳 皓3
（1.湖北民族學院生物科學與技術(shù)學院，湖北 恩施 445000；2.南京醫(yī)藥股份有限公司博士后工作站，江蘇 南京 210012；3.南京中醫(yī)藥大學博士后流動站，江蘇 南京 210023）

通過中心復合試驗優(yōu)化超聲輔助提取連錢草多糖的工藝，以1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）自由基（2,2’--azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical，ABTS＋?）清除能力、Fe2＋螯合力、鐵離子還原抗氧化力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）和N,N-二甲基-對苯二胺（N,N-dimethyl-p-phenylenediamine，DMPD）自由基清除能力為指標，研究連錢草多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，超聲輔助提取連錢草多糖的最優(yōu)工藝為pH 7.2、液固比32∶1（mL/g）、超聲功率270 W、超聲時間8 min，此條件下多糖提取率在4.95%～5.12%范圍內(nèi)。體外抗氧化活性結(jié)果顯示，連錢草多糖DPPH自由基清除能力為（0.51±0.04）μmol Trolox/mg，ABTS＋?清除能力為（0.69±0.04）μmol Trolox/mg，F(xiàn)e2＋螯合力為（0.51±0.29）μmol EDTA/mg，F(xiàn)RAP值為（3.45±0.03）μmol Trolox/mg，DMPD自由基清除能力為（0.17±0.01）μmol Trolox/mg。

連錢草；多糖；超聲輔助提?。豁憫娣治?；抗氧化

連錢草為唇形科活血丹屬植物活血丹（Glechoma longituba (Nakai) Kupr.）干燥地上部分，曬干或鮮用。連錢草性味涼辛，微苦，微寒，歸肝、腎、膀胱經(jīng)[1]。連錢草具有利尿、預防腎結(jié)石[2]、抑菌[3]、抗炎鎮(zhèn)痛[4]、降血糖[5]、抗腫瘤[6]以及抑制破骨細胞生長[7]等藥理作用。

多糖是中藥的主要活性成分之一，而目前對連錢草的研究主要集中在萜類[8]、黃酮類[9]、有機酸類[10-11]，對連錢草多糖的研究則較少，僅前期研究了水浴法提取工藝的優(yōu)化[12]，而無對該多糖其他方面研究的報道。本研究通過考察提取液pH值、液固比、超聲功率和超聲時間等因素，采用單因素試驗和中心復合試驗優(yōu)化超聲輔助提取連錢草多糖的工藝，并考察5 個抗氧化指標以揭示其體外抗氧化活性，旨在為連錢草這一傳統(tǒng)中藥的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

連錢草由南京同仁堂洪澤科技有限公司提供，烘干，粉碎，過60 目篩；1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、菲咯嗪（ferrozine試劑）、三吡啶三吖嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ）、N,N-二甲基對苯二胺二鹽酸鹽（N,N-dimethyl-p-phenylenediamine，DMPD）、Trolox 日本東京化成工業(yè)株式會社；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度定量試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；葡萄糖、無水乙醇、蒽酮等（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan GO全波長酶標儀 美國Thermo公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；RT-02A型多功能粉碎機 弘荃機械企業(yè)有限公司；COUCTER型離心機 美國Beckman公司；JY96-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芒生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲輔助提取連錢草多糖工藝的優(yōu)化

1.3.1.1 連錢草多糖的提取[13]

稱取一定量的連錢草干粉末，加入適量緩沖液，超聲波處理一定時間后，離心取上清液進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10，向濃縮液中緩慢加入無水乙醇至乙醇終體積分數(shù)為80%，4 ℃靜置過夜，離心，沉淀用無水乙醇洗滌3 次后用蒸餾水溶解。將上述溶液、三氯甲烷、正丁醇按體積比25∶5∶1混合并劇烈振蕩20 min，離心取上清液，此過程重復5 次以除去蛋白。葡萄糖為標準品，硫酸-蒽酮法測多糖含量[14]，多糖提取率按下式計算：

式中：ρ為測定樣液的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取體積/mL；m為連錢草質(zhì)量/mg。

測量抗氧化活性前，將上述提取多糖樣品置于截留相對分子質(zhì)量3 500的透析袋中，于蒸餾水中透析過夜以除去小分子物質(zhì)。透析液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得連錢草多糖凍干粉。檢測凍干粉中的多糖含量；牛血清白蛋白為標準品，BCA法檢測其蛋白含量，具體操作按試劑盒說明書進行；沒食子酸為標準品，F(xiàn)olin-Ciocalteu法測多糖凍干粉的總酚含量[15]；蘆丁為標準品，分光光度法測量總黃酮含量[16]。

1.3.1.2 單因素試驗

稱取一定量的連錢草粉末，按照下列條件進行單因素試驗：分別配制pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液，按液固比30∶1（mL/g）加入樣品中，超聲時間4 min、超聲功率200 W；固定pH 7.0、超聲功率200 W和超聲時間4 min，改變液固比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）；固定pH 7.0、液固比30∶1（mL/g），分別用功率為50、100、150、200、250、300、350 W的超聲波處理4 min；提取液pH 7.0、液固比30∶1（mL/g）、超聲功率200 W條件下分別處理2、4、6、8、10 min。考察各單因素對連錢草多糖提取率的影響。

1.3.1.3 中心復合試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert 8.0軟件進行中心復合試驗設(shè)計，以pH值、液固比、超聲功率和超聲時間為自變量，多糖提取率為響應值優(yōu)化連錢草多糖的提取工藝。試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 中心復合試驗因素與水平Table 1 Coded levels for factors used in central composite design

根據(jù)中心復合試驗，建立pH值、液固比、超聲功率和超聲時間與多糖提取率的回歸方程，并進行響應面分析，優(yōu)化出連錢草多糖提取的最佳工藝，并對優(yōu)化的工藝進行驗證，證明此工藝的可行性。

1.3.2 連錢草多糖體外抗氧化活性的測定

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力測定

連錢草多糖DPPH自由基清除能力的測定按照Gülcin等[17]方法進行。Trolox為標準品，濃度分別為2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，以Trolox濃度為橫坐標、DPPH自由基清除能力為縱坐標，制作出Trolox對DPPH自由基清除能力的標準曲線。連錢草多糖的DPPH自由基清除能力用每毫克樣品μmol Trolox當量表示（μmol Trolox/mg）。

1.3.2.2 ABTS＋?清除能力測定

參照Chen等[18]的方法測定連錢草多糖的ABTS＋?清除能力。Trolox作為標準品，作出Trolox的ABTS＋?清除能力（濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）標準曲線。連錢草多糖的ABTS＋?清除能力以每毫克樣品μmol Trolox當量表示（μmol Trolox/mg）。

1.3.2.3 Fe2＋螯合力測定

Fe2＋螯合力依照文獻[19]測定。EDTA作為測定該指標的標準品，濃度為7.8、15.6、31.3、62.5、125、250 μmol/L，計算Fe2＋螯合力與EDTA濃度的線性回歸方程。樣品的螯合力用每毫克樣品μmol EDTA當量表示（μmol EDTA/mg）。

1.3.2.4 鐵離子還原抗氧化力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定

FRAP測定采用Fernandes等[20]的方法。Trolox為標準品，測定濃度分別為5、10、20、40、80、160 μmol/L的FRAP值，計算FRAP值與Trolox濃度的線性回歸方程。用每毫克樣品μmol Trolox當量表示（μmol Trolox/mg）連錢草多糖的FRAP。

1.3.2.5 DMPD自由基清除能力測定

連錢草多糖DMPD自由基清除能力參考文獻[19]進行測定。Trolox為標準品，測定不同濃度（分別為6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L）的Trolox對DMPD自由基清除能力，制作Trolox DMPD自由基清除能力的標準曲線。連錢草多糖的DMPD自由基清除能力以μmol Trolox當量表示（μmol Trolox/mg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 連錢草多糖凍干粉組分分析

連錢草多糖凍干粉為白色粉末，得率為4.52%，其中多糖含量為97.28%，未檢測到蛋白質(zhì)、酚類以及黃酮類化合物。因此，可以推斷凍干粉中連錢草多糖是體外抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 超聲輔助提取連錢草多糖工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗結(jié)果

圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1 Results of single factor experiments

當提取液pH值較低時，連錢草多糖的提取率較低，隨著提取液pH值逐步增加，提取率顯著上升，當pH值達到7.0時，提取率最高，隨后pH值的提高不再增加連錢草多糖的提取率，反而有所下降（圖1A）。液固比能顯著影響連錢草多糖的提取率，當液固比較小時，增大液固比可以提取連錢草多糖的提取率，當液固比達到30∶1（mL/g）時，多糖提取率不再顯著增加（圖1B）。由圖1C可以看出，當超聲功率為250 W時，多糖提取率最高，低于或高于250 W，提取率均有所下降。隨著超聲時間的延長，連錢草多糖的提取率顯著上升，當處理時間超過8 min后，提取率增加不再顯著（圖1D）。所以，在pH 6～8、液固比20∶1～40∶1（mL/g）、超聲功率200～300 W、超聲時間6～10 min范圍內(nèi)進行中心復合試驗。

2.2.2 中心復合試驗結(jié)果

2.2.2.1 回歸模型的建立

表2 中心復合試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Central composite design with experimental values of polysaccharide yield

中心復合試驗結(jié)果如表2所示。由統(tǒng)計軟件Design-Expert 8.0分析，建立了如下四元二次回歸方程：Y=4.86＋0.10A＋0.25B＋0.31C－0.26D＋0.03AB＋ 0.22AC＋0.10AD＋0.29BC＋0.07BD－0.17CD－0.26A2－0.58B2－0.41C2－0.46D2。

表3 中心復合試驗結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of the results of central composite design

該模型的決定系數(shù)R2為0.967 5，校正后決定系數(shù)為0.937 2。對建立的模型進行方差分析，結(jié)果列于表3中，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬性不顯著（P＞0.1），說明此回歸模型能很好地擬合實際。AB、AD和BD項不顯著（P＞0.05），需將此3項從回歸模型中刪除。因此，回歸模型最終為：Y＝4.86＋0.10A＋0.25B＋0.31C－0.26D＋0.22AC＋0.29BC－0.17CD－0.26A2－0.58B2－0.41C2－0.46D2。

2.2.2.2 驗證實驗結(jié)果

由上述回歸方程計算得知，當A＝0.47、B＝0.39、C＝0.72、D＝－0.33時，Y出現(xiàn)極大值。即當提取條件為pH 7.2、液固比32∶1（mL/g）、超聲功率268 W、超聲時間7.68 min時，連錢草多糖的提取率最高，達5.09%。為了操作方便，將優(yōu)化的工藝定為：pH 7.2、液固比32∶1（mL/g）、超聲功率270 W、超聲時間8 min。并對優(yōu)化的工藝進行驗證，得到多糖的提取率在4.95%～5.12%之間，說明該工藝穩(wěn)定可靠，對生產(chǎn)實踐具有很好的指導作用。

本課題組曾優(yōu)化水浴法提取連錢草多糖的工藝，得到的最佳工藝為pH 7.2、液固比33∶1（mL/g）、提取溫度89 ℃、提取時間160 min，在此條件下，多糖得率為（3.40±0.05）%[12]。與水浴提取法相比，超聲輔助法不僅縮短了提取時間，還大大提高了提取率。

2.2.2.3 響應面分析

圖2 各因素交互作用對連錢草多糖提取率的影響Fig.2 Interactive effects of extraction parameters on the yield of polysaccharides

由表3可以得知，pH值與超聲功率、液固比與超聲功率、超聲功率與超聲時間的交互作用能顯著影響連錢草多糖的提取率（P＜0.05）。通過響應面分析可以看出，液固比32∶1（mL/g）、超聲時間7.68 min時，隨著pH值的上升和超聲功率的加大，多糖提取率急劇增加，當pH 7.0～7.5、超聲功率260～280 W時，多糖提取率最高（圖2a），當pH值和超聲功率繼續(xù)提高后，多糖提取率急劇下降。這可能是因為pH值不適宜時，即使提高超聲功率，多糖也不易溶出；如pH值適宜，超聲功率過小，多糖溶出速率慢，超聲功率過大又會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，均使提取率降低；只有二者協(xié)同作用，都達到最佳條件時，提取率才會最大。如圖2b所示，當pH 7.2、超聲時間7.68 min時，多糖提取率隨著液固比和超聲功率水平的上升急劇增加，液固比約32∶1（mL/g）、超聲功率260～280 W時，達到最大值，隨后提取率隨二者的增加急劇下降。如圖2c所示，pH值和液固比分別為7.2和32∶1（mL/g）時，超聲功率和時間水平的上升會使多糖提取率急劇提高，隨后提取率上升趨勢變緩，當超聲功率260～280 W、超聲時間7～8 min時，多糖的提取率最高。

2.3 連錢草多糖體外抗氧化活性測定結(jié)果

Trolox由于具有較強的抗氧化能力，常被用作體外抗氧活性測定的標準品[21-22]。本研究采用Trolox為標準品，將連錢草多糖的5 個體外抗氧化活性指標以每毫克μmol Trolox當量表示，能具體顯示多糖的體外抗氧化活性。

2.3.1 DPPH自由基清除能力

Trolox在2.5～80 μmol/L濃度范圍內(nèi)與DPPH自由基清除率線性方程為y=0.002 9x－0.016 4，決定系數(shù)R2為0.954 5，將測得的連錢草多糖DPPH自由基清除率代入方程中得連錢草多糖DPPH自由基清除能力為（0.51±0.04）μmol Trolox/mg。

DPPH自由基清除能力是常用的體外抗氧化活性指標，多糖能清除DPPH自由基是因為它們能提供質(zhì)子。Thetsrimuang等[23]從真菌Lentinus polychrous Lév.的菌絲體、新鮮子實體、干燥子實體中提取了多糖，并比較了3 種粗多糖的DPPH自由基清除能力，發(fā)現(xiàn)菌絲體多糖的清除能力最強，達0.131 μmol Trolox/mg。因此，連錢草多糖的DPPH自由基清除能力明顯強于Lentinus polychrous Lév.菌絲體多糖，這可能是因為連錢草多糖能提供更多的質(zhì)子清除DPPH自由基。

2.3.2 ABTS＋?清除能力

當Trolox濃度在1.25～40 μmol/L范圍內(nèi)與ABTS＋?清除率的線性方程為y＝0.008 9x＋0.031 2，決定系數(shù)R2為0.972 3，將測得的連錢草多糖ABTS＋?清除率代入上述回歸方程中，得到連錢草多糖的ABTS＋?清除能力為（0.69±0.04）μmol Trolox/mg。

Mateos-Aparicio等[24]依次用0.05 mol/L NaOH、1 mol/L KOH和4 mol/L KOH溶液從豆渣的乙醇不溶物中提取出3 種多糖0.05MSF（0.05 mol/L NaOH溶液、0.05 mol/L NaOH可溶性多糖）、1MSF（1 mol/L KOH溶液、1 mol/L KOH可溶性多糖）、4MSF（4 mol/L KOH溶液、4 mol/L KOH可溶性多糖），對ABTS＋?清除能力進行評價，3 種多糖的ABTS＋?清除能力分別為（0.078±0.005）、（0.068±0.007）、（0.063±0.004）μmol Trolox/mg，由此可知連錢草多糖的ABTS＋?清除能力大于豆渣中提取的多糖。由于清除ABTS＋?涉及到電子的轉(zhuǎn)移，所以連錢草多糖較大豆渣中提取的多糖能提供更多的電子。

2.3.3 Fe2＋螯合力

在一定濃度范圍內(nèi)（7.8、15.6、31.3、62.5、125、250 μmol/L），EDTA 的Fe2＋螯合力與濃度呈線性關(guān)系（y＝0.003 7x＋0.073 6，R2為0.937 9），由該線性方程得到連錢草多糖的Fe2＋螯合力為（0.51±0.29）μmol EDTA/mg。

一些過渡金屬如Fe2＋、Cu＋、Pb2＋、Co2＋等能促使活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，其中Fe2＋是最強的促氧化劑，能導致脂質(zhì)過氧化體的產(chǎn)生[25]；菲咯嗪能與Fe2＋形成在562 nm波長處有吸收峰的Fe2＋-菲咯嗪復合物，當加入抗氧化劑后，該吸光度減弱，并在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，可以反映樣品的Fe2＋螯合力[26]。

Jiang Changxing等[27]的研究表明，采用超聲輔助提取的榕樹（Ficus microcarpa）氣生根多糖在3.6 mg/mL時，F(xiàn)e2＋螯合率達81.3%。Yuan等[28]從桑葉中提取了粗桑葉多糖（mulberry leaves polysaccharides，MLP），并將MLP進行分離純化，得到兩種純的多糖MLP-3a和MLP-3b，對這3 種多糖的Fe2＋螯合力進行了測定，發(fā)現(xiàn)當質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時，它們的 Fe2＋螯合率分別為92.96%、51.33%、87.76%。

關(guān)于多糖螯合Fe2＋的機理至今鮮見系統(tǒng)闡述，但有研究者證實如某物質(zhì)含兩個或兩個以上如下基團：—OH、—SH、—COOH、—PO3H2,、C＝O、—NR2、—S—和—O—，并能進行有效地配置，就會具有金屬螯合能力[29]；對槲皮素螯合金屬的機理也證明這一點[30]。因此，推測多糖螯合Fe2＋的機理也是因為具有某些上述功能團，但具體的作用原理還需進一步研究。

2.3.4 FRAP值

抗氧化劑將鐵-三吡啶三吖嗪（Fe3＋-TPTZ）復合物還原成藍色的亞鐵離子形式（Fe2＋），此形式在593 nm波長處有吸收峰，吸光度越高，抗氧化力越強。

Trolox在一定濃度范圍內(nèi)（5～160 μmol/L），F(xiàn)RAP值與其濃度成正比，線性方程為y＝0.001 4x＋0.004 5，決定系數(shù)R2為0.997 9。由此，測得連錢草多糖的FRAP為（3.45±0.03）μmol Trolox/mg。

多糖能阻止Fe3＋轉(zhuǎn)化為Fe2＋，其中一個原因是能提供電子，另一個原因是具有大量重復的—OH[31]。Gómez-Ordó?ez等[32]依次采用冷水、熱水、0.1 mol/L HCl溶液和2 mol/L KOH溶液提取，從食用紅藻Mastocarpus stellatus中得到4 種多糖，測量4 種多糖的FRAP值，得到最高的為冷水提取組分，為0.045 μmol Trolox/mg。所以，連錢草多糖的還原Fe3＋能力要高于食用紅藻Mastocarpus stellatus中的4 種多糖。這可能是因為連錢草多糖提取電子的能力強于食用紅藻Mastocarpus stellatus中的4種多糖或具有更多的—OH的重復結(jié)構(gòu)。

2.3.5 DMPD自由基清除能力

以Trolox濃度（6.25～100 μmol/L）為自變量，以DMPD自由基清除率為因變量，得到DMPD自由基清除率與Trolox濃度的線性方程為y＝0.008 6x＋0.043 8（決定系數(shù)R2為0.936 9）。將測得的連錢草多糖的DMPD自由基清除率代入上述方程中，得到連錢草多的DMPD自由基清除能力為（0.17±0.01）μmol Trolox/mg。

DMPD在含有適宜氧化劑的酸性溶液中能形成穩(wěn)定的DMPD自由基，該自由基在505 nm波長處有最大吸收峰?？寡趸瘎┤缒芴峁湓咏oDMPD自由基，則會在波長505 nm處的吸光度降低，該方法與ABTS＋?清除能力的測定相比，終點吸光度更穩(wěn)定。這種方法對疏水性物質(zhì)的測定靈敏性和重復性都要差，而多糖大多為親水性的，所以，此法特別適合測定多糖的抗氧化性[33]。

Rana等[34]檢測了印度黃檀（Dalbergia sissoo）葉、柚木（Tectona grandis）皮和美洲含羞草（Mimosa diplotricha）種子多糖的DMPD自由基清除能力，結(jié)果顯示3 種多糖IC50值分別為（3.360±0.080）、（2.360±0.070）、（4.980±0.100） mg/mL。本研究采用μmol Trolox/mg為單位對連錢草多糖的DMPD自由基清除能力進行量化，由于采用了不同的標準來衡量多糖的DMPD自由基清除能力，所以無法比較其能力的強弱。

3 結(jié) 論

本研究采用中心復合試驗優(yōu)化了超聲輔助提取連錢草多糖的工藝，當提取條件為pH 7.2、液固比32∶1（mL/g）、超聲功率268 W、超聲時間7.68 min時，連錢草多糖的提取率達到5.09%，優(yōu)于水浴提取法；并研究了連錢草多糖體外抗氧化活性，表明連錢草多糖具有較強的DPPH自由基、ABTS＋?清除能力，較高的Fe2＋螯合力、FRAP值以及DMPD自由基清除能力。因此，連錢草多糖有望開發(fā)成具有很好抗氧化活性的藥物或食品添加劑。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典: 一部[M]. 2010版. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 158-159.

[2] 楊念云, 劉培, 郭建明. 連錢草提取物對腎結(jié)石模型大鼠的防治作用[J]. 中國現(xiàn)代應用藥學, 2014, 31(8): 918-920. DOI:10.13748/ j.cnki.issn1007-7693.2014.08.004.

[3] 陶勇, 石米揚. 連錢草的抑菌活性研究[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 2011, 31(10): 824-825.

[4] 何平, 鄒佳峻, 費士杰. 連錢草水提物抗炎鎮(zhèn)痛實驗研究[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志, 2014, 35(2): 63-64.

[5] 袁春玲, 王佩琪, 郭偉英. 連錢草的降血糖作用及其機制研究[J]. 中藥藥理與臨床, 2008, 24(3): 57-58. DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2008.03.023.

[6] QIAO Z, KOIZUMI Y, ZHANG M, et al. Anti-melanogemesis effect of Glechoma hederacea L. extract on B16murine melanoma cells[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 76(10): 1877-1883. DOI:10.1271/bbb.120341.

[7] HWANG J K, ERKHEMBAATAR M, GU D R, et al. Glechoma hederacea suppresses RANKL-mediated osteoclastogenesis[J]. Journal of Dental Research, 2014, 93(7): 685-690. DOI:10.1177/0022034514536579.

[8] 楊念云, 段金廒, 李萍, 等. 連錢草中的黃酮類化學成分[J].中國藥科大學學報, 2005, 36(3): 210-212. DOI:10.3321/ j.issn:1000-5048.2005.03.004.

[9] 黃天賜, 聶晶, 張立群. 連錢草中黃酮、有機酸類成分的HPLC指紋圖譜[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2013, 19(1): 132-135. DOI:10.13422/ j.cnki.syfjx.2013.01.041.

[10] 朱求方, 王永毅, 瞿海斌. 連錢草的化學成分研究[J]. 中草藥, 2013, 44(4): 387-390. DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2013.01.041.

[11] 劉杰, 李國強, 吳霞, 等. 連錢草的化學成分研究[J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(4): 695-698. DOI:10.4268/cjcmm20140428.

[12] 姜寧, 劉曉鵬, 張俊霞, 等. Box-Behnken設(shè)計-效應面法優(yōu)化連錢草多糖提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(14): 317-320; 326. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.056.

[13] 鄭義, 王衛(wèi)東, 李勇, 等. 高良姜多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性[J]. 食品科學, 2014, 35(2): 126-131. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201402023.

[14] 張惟杰. 復合多糖生化研究技術(shù)[M]. 上海: 上?？茖W技術(shù)出版社, 1987: 7.

[15] 杜俊娜, 陳書霞, 程智慧, 等. 響應曲面法優(yōu)化大蒜中總酚提取工藝及其抗氧化活性測定[J]. 食品科學, 2012, 33(10): 72-77.

[16] 田春蓮, 蔣鳳開. 茜草總黃酮提取工藝研究[J]. 食品科學, 2011, 32(24): 60-63.

[17] GüLCIN I, HUYUT Z, ELMASTAS M, et al. Radical scavenging and antioxidant activity of tannic acid[J]. Arabian Journal of Chemistry, 2010, 3(1): 43-53. DOI:10.1016/j.arabjc.2009.12.008.

[18] CHEN D, FAN J, WANG P, et al. Isolation, identification and antioxidative capacity of water-soluble phenylpropanoid compounds from Rhodiola crenulata[J]. Food Chemistry, 2012, 134(4): 2126-2133. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.04.011.

[19] AK T, GüLCIN I. Antioxidant and radical scavenging properties of curcumin[J]. Chemico-Biological Interactions, 2008, 174(1): 27-37. DOI:10.1016/j.cbi.2008.05.003.

[20] FERNANDES V C, DOMINGUES V F, FREITAS V, et al. Strawberries from integrated pest management and organic farming: phenolic composition and antioxidant properties[J]. Food Chemistry, 2012, 134(4): 1926-1931. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.03.130.

[21] VERNAZA M G, DIA V P, MEJIA E G, et al. Antioxidant and antiinflammatory properties of germinated and hydrolysed Brazilian soybean flours[J]. Food Chemistry, 2012, 134(4): 2217-2225. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.04.037.

[22] SOVRANI V, BLANDINO M, SCARPINO V, et al. Bioactive compound content, antioxidant activity, deoxynivalenol and heavy metal contamination of pearled wheat fractions[J]. Food Chemistry, 2012, 135(1): 39-46. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.04.045.

[23] THETSRIMUANG C, KHAMMUANG S, CHIABLAEM K, et al. Antioxidant properties and cytotoxicity of crude polysaccharides from Lentinus polychrous Lév.[J]. Food Chemistry, 2011, 128(3): 634-639. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.03.077.

[24] MATEOS-APARICIO I, MATEOS-PEINADO C, JIMéNEN-ESCRIG A, et al. Multifunctional antioxidant activity of polysaccharide fractions from the soybean byproduct okara[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 82(2): 245-250. DOI:10.1016/j.carbpol.2010.04.020.

[25] XIONG Q, LI X, ZHOU R, et al. Extraction, characterization and antioxidant activities of polysaccharides from E. corneum gigeriae galli[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 108(12): 247-256. DOI:10.1016/j.carbpol.2014.02.068.

[26] TANG J, NIE J, LI D, et al. Characterization and antioxidant activities of degraded polysaccharides from Poria cocos sclerotium[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 105(5): 121-126. DOI:10.1016/ j.carbpol.2014.01.049.

[27] JIANG C X, LI X, JIAO Y P, et al. Optimization for ultrasoundassisted extraction of polysaccharides with antioxidant activity in vitro from the aerial root of Ficus microcarpa[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 110(38): 10-17. DOI:10.1016/j.carbpol.2014.03.027.

[28] YUAN Q X, XIE Y F, WANG W, et al. Extraction optimization, characterization and antioxidant activity in vitro of polysaccharides from mulberry (Morus alba L.) leaves[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 128(1): 52-62. DOI:10.1016/j.carbpol.2015.04.028.

[29] YUAN Y V, BONE D E, CARRINGTON M F. Antioxidant activity of dulse (Palmaria palmata) extract evaluated in vitro[J]. Food Chemistry, 2005, 91(3): 485-494. DOI:10.1016/j.foodchem.2004.04.039.

[30] FIORUCCI S, GOLEBIOWSKI J, CABROL-BASS D, et al. DFT study of quercetin activated forms involved in antiradical, antioxidant, and prooxidant biological processes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(3): 903-911. DOI:10.1021/jf061864s.

[31] SHENG J, SUN Y. Antioxidant properties of different molecular weight polysaccharides from Athyrium multidentatum (Doll.) Ching[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 108(1): 41-45. DOI:10.1016/ j.carbpol.2014.03.011.

[32] G?MEZ-ORD??EZ E, JIMéNEZ-ESCRIG A, RUPéREZ P. Bioactivity of sulfated polysaccharides from the edible red seaweed Mastocarpus stellatus[J]. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre, 2014, 3(1): 29-40. DOI:10.1016/j.bcdf.2014.01.002.

[33] GüLCIN I, BURSAL E, SEHITO?LU M H, et al. Polyphenol contents and antioxidant activity of lyophilized aqueous extract of propolis from Erzurum, Turkey[J]. Food and Chemical Toxicology, 48(8/9): 2227-2228. DOI:10.1016/j.fct.2010.05.053.

[34] RANA V, DAS M K, GOGOI S, et al. Multifunctional properties of polysaccharides from Dalbergia sissoo, Tectona grandis and Mimosa diplotricha[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 102(4): 341-350. DOI:10.1016/j.carbpol.2013.11.035.

Optimization by Response Surface Methodology of Ultrasound-Assisted Extraction and Antioxidant Activities of Polysaccharides from Glechoma longituba (Nakai) Kupr.

LIU Xiaopeng1,2,3, ZHANG Junxia1, JIANG Ning1,*, SONG Yizhi1, XIANG Jiqian1, WANG Qiushuang2, WU Hao3
(1. College of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China; 2. Postdoctoral Research Station, Nanjing Medical Co. Ltd., Nanjing 210012, China; 3. Postdoctoral Research Station, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

In this study, we optimized the ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from the dried aboveground part of Glechoma longituba (Nakai) Kupr. by response surface methodology (RSM) based on central composite design and measured the antioxidant activities of the extracted polysaccharides using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging, 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid radical (ABTS+·) scavenging, Fe2+chelating activity, ferric reducing antioxidant power (FRAP), and N,N-dimethyl-p-phenylenediamine radical scavenging methods. The optimal extraction conditions were obtained as follows: pH, 7.2; liquid-to-solid ratio, 32:1 (mL/g); ultrasonic power, 270 W; and ultrasonic time, 8 min. Under these conditions, the yield of polysaccharides was 4.95%–5.12%. The extracted polysaccharides exhibited powerful antioxidant activities. The DPPH radicals and ABTS+· scavenging activities, Fe2+chelating activity, FRAP value and DMPD radical scavenging capacity were (0.51 ± 0.04) μmol Trolox equivalent (TE)/mg, (0.69 ± 0.04) μmol TE/mg, (0.51 ± 0.29) μmol EDTA-2Na equivalent (EE)/mg, (3.45 ± 0.03) μmol TE/mg and (0.17 ± 0.01) μmol TE/mg, respectively.

Glechoma longituba (Nakai) Kupr.; polysaccharides; ultrasound-assisted extraction; response surface methodology; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201604003

TS201.1

A

1002-6630（2016）04-0013-07

劉曉鵬, 張俊霞, 姜寧, 等. 響應面試驗優(yōu)化超聲輔助提取連錢草多糖工藝及其體外抗氧化活性[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 13-19. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604003. http://www.spkx.net.cn

LIU Xiaopeng, ZHANG Junxia, JIANG Ning, et al. Optimization by response surface methodology of ultrasound-assisted extraction and antioxidant activities of polysaccharides from Glechoma longituba (Nakai) Kupr.[J]. Food Science, 2016, 37(4): 13-19. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604003. http://www.spkx.net.cn

2015-06-29

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAI04B04-5）；江蘇省“企業(yè)博士后集聚計劃”項目（2011033）；

2013年湖北省戰(zhàn)略性新興（支柱）產(chǎn)業(yè)人才培養(yǎng)（生物工程）項目；

2014年度湖北省本科高?！皩I(yè)綜合改革”試點項目（生物工程）

劉曉鵬（1971—），男，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物。E-mail：18913386031@189.cn

*通信作者：姜寧（1968—），女，副教授，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物。E-mail：jiangn888@163.com