王佳奇，宋明銘，陳 凱，王月亮，丁傳波，鄭毅男，申 雷，劉文叢（吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118）

響應(yīng)面試驗優(yōu)化落葉松中二氫槲皮素純化工藝

王佳奇，宋明銘，陳 凱，王月亮，丁傳波，鄭毅男，申 雷，劉文叢*
（吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118）

目的：優(yōu)選落葉松中二氫槲皮素的最佳純化工藝。方法：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計料液比、結(jié)晶溫度和結(jié)晶時間三因素三水平的試驗?zāi)Ｐ?，以二氫槲皮素的純度作為評價指標，對二氫槲皮素的純化工藝進行優(yōu)化。結(jié)果：最佳純化條件為料液比1∶12（g/mL）、結(jié)晶溫度5 ℃、結(jié)晶時間20 h。結(jié)論：研究結(jié)果可為二氫槲皮素純化工藝的確定以及工業(yè)生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

二氫槲皮素；重結(jié)晶；響應(yīng)面

落葉松，學名為Larix gmelinii (Rupr.) Kuzen，是落葉松屬的一種喬木，是我國高山針葉林的重要組成樹種。落葉松的分布非常廣泛，是一種最耐寒的針葉 樹種。落葉松分布在大、小興安嶺、長白山、老爺嶺、河北北部、陜西秦嶺、甘肅、四川、云南西北部以及新疆等地區(qū)。

二氫槲皮素又名花旗松素，是一種天然的活性物質(zhì)，屬于二氫黃酮醇類化合物，廣泛存在于落葉松、花旗松、刺玫薔薇、水紅花等植物中[1-5]，具有抗氧化[6-7]、抗炎[8]、抗病毒[9]、防曬美白[10]、抑制惡性腫瘤細胞生長[11]、抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡[12-13]等生物活性，因此被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域。目前，市場對二氫槲皮素的需求量較大，但其價格頗高，尤其是高純度的二氫槲皮素。查閱相關(guān)文獻可知，純化二氫槲皮素的方法主要是重結(jié)晶法、大孔樹脂吸附法和聚酰胺樹脂吸附法，后兩種方法的純化過程比較復(fù)雜，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)時成本較高。本研究采用響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，對影響二氫槲皮素重結(jié)晶的主要因素行優(yōu)化，以期能夠為工業(yè)化生產(chǎn)高純度二氫槲皮素提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

落葉松樹墩由吉林省臨江健維天然生物科技有限公司提供，由吉林農(nóng)業(yè)大學鄭毅男教授鑒定為松科（Pinaceae）落葉松屬（Larix）植物長白落葉松（Larix olgensis Henry var. koreana Nakai）。

二氫槲皮素標準品（純度≥99%） 俄羅斯Doio公司；甲醇（色譜級） 美國天地（Tedia）試劑公司；純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司；其余試劑均為分析純 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2010A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有LC solution工作站、SPD-20A紫外檢測器） 日本島津公司；TGL-20B高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；JHBE-50S閃式提取器 河南金鼎科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線繪制

精密稱取二氫槲皮素標準品5 mg，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，分別移取2、4、6、8 mL對照品溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的對照品溶液。

H P L C條件：色譜柱：H y p e r s i l O D S 2（4.5 mm×250 mm，5 μm）；流動相：冰醋酸-水（1∶59，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：288 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

1.3.2 二氫槲皮素粗品的提取

長白落葉松樹根部分，粉碎成木屑并烘干。取粉碎后的木屑200 g，加入5 倍量三重水，4 ℃靜置12 h，過濾，殘渣加入50%乙醇溶液（用鹽酸調(diào)pH 4），根據(jù)料液比1∶5閃提120 s。提取液減壓回收乙醇，在60 ℃恒溫水浴中濃縮至原體積1/3，加入8 倍50%乙醇溶液，室溫沉降2 h，取上清液，減壓回收乙醇，濃縮液烘干，得到粗品。

1.3.3 單因素試驗

將二氫槲皮素粗品按1∶2（g/mL）比例添加乙醇溶液，加熱溶解后，加入一定量的水加熱至沸騰，在一定溫度條件下重結(jié)晶，5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，將沉淀在60 ℃恒溫水浴中烘干，采用HPLC法測定其純度。

1.3.3.1 料液比的篩選

固定結(jié)晶溫度10 ℃、結(jié)晶時間18 h，按上述方法，對料液比（二氫槲皮素粗品-水）為1∶4、1∶6、1∶8、 1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18（g/mL）的混合物進行處理，以二氫槲皮素純度為指標，篩選確定最佳料液比。

1.3.3.2 結(jié)晶溫度的篩選

固定料液比1∶12（g/mL）、結(jié)晶時間18 h，按上述方法，分別在結(jié)晶溫度為0、5、10、15、25 ℃條件下結(jié)晶，以二氫槲皮素純度為指標，篩選確定最佳結(jié)晶溫度。

1.3.3.3 結(jié)晶時間的篩選

固定料液比1∶12（g/mL）、結(jié)晶溫度5 ℃，按上述方法，分別結(jié)晶12、16、20、24、32 h，以二氫槲皮素純度為指標，篩選確定最佳結(jié)晶時間。

1.3.4 響應(yīng)面試驗

綜合單因素試驗結(jié)果，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對純化工藝進行優(yōu)化。選取料液比、結(jié)晶溫度和結(jié)晶時間3 個因素，通過Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，對純化工藝進行響應(yīng)面分析。試驗因素和水平設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 二氫槲皮素標準曲線的繪制

測定不同質(zhì)量濃度的二氫槲皮素標準品溶液在288 nm波長處的峰面積，以質(zhì)量濃度X（mg/mL）對峰面積Y繪制標準曲線，得到回歸方程為：Y＝4×107X＋326 571，R2＝0.999 2，在質(zhì)量濃度0.1～0.5 mg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 二氫槲皮素的粗品提取結(jié)果

計算得長白落葉松木屑中二氫槲皮素粗品平均含量為21.43 mg/g，其純度為70%。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 料液比對二氫槲 皮素純度的影響

圖1 料液比對二氫槲皮素純度的影響Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on the purity of dihydroquercetin

由圖1可知，隨著溶劑用量的升高，二氫槲皮素的純度也隨之增 加，當料液比為1∶12時，二氫槲皮素的純度達到最高，之后又隨著溶劑用量的增加而降低。因此，Box-Behnken 試驗選取的料液比的范圍為1∶8～1∶16。

2.3.2 結(jié)晶溫度對二氫槲皮素純度的影響

圖2 結(jié)晶溫度 對二氫槲皮 素純度的影響Fig.2 Effect of recrystallization temperature on the purity of dihydroquercetin

由圖2可知，隨著溫度的升高，二氫槲皮素的純度有所增加，在5 ℃時達到最大值，隨后又隨著溫度的升高而有所降低。原因可能是因為溫度過低，溶液中的雜質(zhì)會因結(jié)晶速度過快而被包裹在結(jié)晶中，而溫度過高，使分子的熱運動加快，利于溶質(zhì)由固相向液相轉(zhuǎn)移，因此，Box-Behnken試驗選取的結(jié)晶溫度的范圍為0～10 ℃。

2.3.3 結(jié)晶時間對二氫槲皮素純度的影響

圖3 結(jié)晶時間對二氫槲皮素純度的影響Fig.3 Effect of recryst allization time on the purity of dihy droquercetin

由圖3可知，隨著結(jié)晶時間的延長，二氫槲皮素的純度有所增加，在20 h時達到最大值，隨后又隨著結(jié)晶時間的延長而有所降低，原因可能是結(jié)晶時間短時，二氫槲皮素未被充分結(jié)晶出來，而結(jié)晶時間較長時，液體中的大量雜質(zhì)轉(zhuǎn)移到結(jié)晶中。因此，Box-Behnken試驗選取的結(jié)晶時間范圍為16～24 h。

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

由單因素試驗分析，根據(jù)Box-Behnken原理[14-15]設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進行優(yōu)化試驗。1～12號為析因試驗，13～17號為中心試驗，分析方案及試驗結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental and predicted results

2.4.2 模型方程建立與顯著性檢驗

利用Design-Exper 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元化回歸擬合分析，得到二氫槲皮素純度與各因素變量的二次方程模型為：

Y＝96＋0.86X1＋0.77X2－2.39X3＋2.87X1X2－0.70XX－1.11XX－8.12X2－2.60X2－4.36X21323123

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由表3可知，經(jīng)F檢驗顯示總模型方程極顯著（P＜0.01）?；貧w系數(shù)R2＝0.989 7，表明模型相關(guān)度好。其校正決定系數(shù)為0.976 4，表明試驗誤差較小。失擬項P＝0.692 3＞0.05，表明模型失擬度不顯著，可用此模型對結(jié)果進行分析和預(yù)測。從F值得分析結(jié)果可以看出，所選的各因素水平范圍內(nèi)，對二氫槲皮素純度影響大小的順序為：結(jié)晶時間＞料液比＞結(jié)晶溫度。

2.4.3 響應(yīng)面分析

圖4 各因素交互作用對二氫槲皮素純度影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effects of various factors on the purity of dihydroquercetin

由圖4和表3中P值可知，模型的一次項X1、X2顯著，X3極顯著，交互項X1X2極顯著、X2X3顯著、X1X3不顯著，二次項X12、X22、X32都極顯著，表明各影響因素對二氫槲皮素純度的影響不是簡單的線性關(guān)系。由圖4可知，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的大小強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[16]。料液比和結(jié)晶溫度交互作用最為顯著，其次是結(jié)晶溫度和結(jié)晶時間交互作用，比較而言，料液比與結(jié)晶時間交互作用最小。

2.5 二氫槲皮素最佳純化條件驗證實驗結(jié)果

當料液比1∶12、結(jié)晶溫度5 ℃、結(jié)晶時間20 h時，測定二氫槲皮素的純度為96.20%，與預(yù)測值96.00%基本相符合，偏差較小。說明得到的回歸方程與實際情況擬合較好，進一步驗證了該模型的可行性。

3 結(jié) 論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析對二氫槲皮素純化條件進行優(yōu)化，并得到回歸方程。結(jié)果表明，各影響因素對二氫槲皮素純度的影響程度大小依次為結(jié)晶時間＞料液比＞結(jié)晶溫度。料液比和結(jié)晶溫度對二氫槲皮素純度的交互影響最為顯著。經(jīng)回歸分析并結(jié)合實際條件確定二氫槲皮素最佳純化工藝為料液比1∶12、結(jié)晶溫度5 ℃、結(jié)晶時間20 h，測定實際二氫槲皮素純度為96.20%，與預(yù)測值96.00%基本相符合，說明該回歸方程可以較好預(yù)測實驗結(jié)果。因此，選擇響應(yīng)面法來優(yōu)化二氫槲皮素純化工藝是可行的。純化某一天然產(chǎn)物并非只有一種固定的辦法，不同方法各有其優(yōu)缺點[17]。

席丹瑩等[18]把二氫槲皮素的粗品用水重結(jié)晶達到5 次以上，得純度為95%的純品。陳玥舟[7]比較了H103樹脂和聚酰胺樹脂純化二氫槲皮素后的效果，純化后的純度為55.0%和72.7%。然后又通過半制備液相色譜儀系統(tǒng)收集二氫槲皮素，凍干后測得樣品純度達到91.7%。張黎等[19]用酸水解醇提取液，在大孔樹脂富集及結(jié)晶后，得到二氫槲皮素的純度大于99%。張澤生等[20]以水溶劑提取落葉松中的二氫槲皮素，然后比較乙醇沉淀法、大孔樹脂吸附法和聚酰胺樹脂吸附法3種純化方法對二氫槲皮素粗提物純化的效果。其中聚酰胺樹脂的純化效果最佳。Wei Yun等[21]采用高速逆流色譜法，溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯-甲醇-水（25∶1∶25，V/V），從400 mg草藥仙鶴草粗提物中分離出11 mg花旗松素-3-糖苷，分離純度達到96%。此外還有硅膠色譜法[22-24]、凝膠色譜法[25]、HPLC法[26-30]等。而本 實驗采用乙醇和水重結(jié)晶的方法純化二氫槲皮素。此新方法彌補了硅膠色譜和凝膠色譜作用時間長、上樣量低，聚酰胺色譜、HPLC和高效逆流色譜分離成本高、處理樣品量少的問題，且遵循節(jié)約能源、綠色環(huán)保的原則，可用于大批量工業(yè)生產(chǎn)，具有較高的研究價值。

[1] 崔寶玉, 劉玉, 劉喆, 等. 二氫槲皮素的研究進展[J]. 黑龍江科學, 2010, 1(4): 37-40.

[2] 張宏偉, 鄭偉. 二氫槲皮素的研究進展[J]. 口腔護理用品工業(yè), 2011, 20(2): 25-28.

[3] 劉剛, 張雁南, 杜乾坤, 等. 水紅花子花旗松素乙醇回流提取工藝優(yōu)化[J]. 食品與機械, 2013, 29(3): 134-137; 186.

[4] 譚亞南, 佟苗苗, 張宇瑤, 等. 不同貯存期水紅花子中花旗松素的含量比較[J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(17): 2779-2781.

[5] MA C H, YANG L, WANG W J, et al. Extraction of dihydroquercetin from Larix gmelinii with ultrasound-assisted and microwave-assisted alternant diges tion[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2012, 13(7): 8789-8804. DOI:10.3390/ijms13078789.

[6] 劉妍, 王遂. 二氫槲皮素的提取及抗氧化性研究[J]. 化學研究與應(yīng)用, 2011, 21(1): 107-111. DOI:10.3969/j.issn.1004-1656.2011.01.020.

[7] 陳玥舟. 落葉松中二氫槲皮素的提取及活性研究[D]. 天津: 天津科技大學, 201 1.

[8] LEE C W, P ARK N H, KIM J W, et al. Study of skin anti-ageing and anti-inflammatory effects of dihydroquercetin, natur al triterpendoids, and their synthetic derivatives[J]. Bioorg Khim, 2012, 38(3): 374-381.

[9] ZARUBAEV V, GARSHININAI A, KALININA N, et al. Anti-influenza activity of dihydroquercetin against lethal influenza virus infection[J]. Antiviral Research, 2010, 7(4): 50-86. DOI:10.1016/j.antiviral.2010.02.420.

[10] MIYAZAWA M, TAMURA N. Inhibitory compound of tyrosinase activity from the sprout of Polygonum hydropiper L. (Benitade)[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2007, 30(3): 595-597.

[11] 翟延君, 程飛, 王添敏, 等. 花旗松素對人宮頸癌Hela細胞的體外抗腫瘤活性及其機理 研究[J]. 中成藥, 2011, 33(12): 2052-2055. DOI:10.3969/j.issn.1001-15 28.2011.12.007.

[12] 師智勇, 孫宗全, 王國華. 花旗松素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J]. 華中醫(yī)學雜志, 2008, 32(4): 287-289.

[13] SUN X, CHEN R C, YANG Z H, et al. Taxifolin prevents diabetic cardio-myopathy in vivo and in vitro by inhibition of oxidative stress and cell apoptosis[J]. Food and Chemical Toxicology, 2014, 63: 2 21-232. DOI:10.1016/j.fct.2013.11.013.

[14] 李志西, 杜雙奎. 實驗優(yōu)化設(shè)計與統(tǒng)計分析[M]. 北京: 科學出版社, 2010: 212-243.

[15] 李春英, 李曉娟, 楊磊, 等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化甘草酸和甘草黃酮聯(lián)合提取工藝[J]. 黑龍江大學自然科學學報, 2009, 26(3): 390-395. DOI:10.3969/j.issn.1001-7011.2009.03.025.

[16] 劉成梅, 游海. 天然產(chǎn)物有效成分的分離與應(yīng)用[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2003: 21.

[17] 譚斌, 周雙德, 張友勝. 二氫楊梅素純化方法的比較研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2 008, 24(7): 631-634. DOI:10.3969/j.issn.1673-9078.2008.07.004.

[18] 席丹瑩, 王正平, 寧正祥. 二氫槲皮素衍生物的制備及其抗氧化性能研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2007, 23(10): 29-31. DOI:10.3969/ j.issn.1673-9078.2007.10.009.

[19] 張黎, 郭建華, 夏柯, 等. 一種二氫槲皮素單體的分離純化方法: 中國, CN 101781277A[P]. 2010-07-21.

[20] 張澤生, 陳玥舟, 王利婷. 落葉松中二氫槲皮素提取工藝優(yōu)化及其純化的研究[J]. 中國食品添加劑, 2011(5): 54-58. DOI:10.3969/ j.issn.1006-2513.2011.05.002.

[21] WEI Y, XIE Q Q, ITO Y C. Preparative separation of axifolin-3-glucoside, hyperoside and amygdalin from plant extracts by high-speed countercurrent chromatography[J]. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 2009, 32(7): 1010-1022. DOI:10.1080/10826070902790983.

[22] 謝周濤, 胡進. 水紅花子乙酸乙酯部位化學成分研究[J]. 中藥材, 2009, 32(9): 1397-1399. DOI:10.3321/j.issn:1001-4454.2009.09.022.

[23] 王巖, 周莉玲, 李銳, 等. 顯齒蛇葡萄化學成分的研究[J]. 中藥材, 2002, 25(4): 254-256. DOI:10.3321/j.issn:1001-4454.2002.04.012.

[24] 鄭國華, 楊娟, 馮其麟. 霉茶化學成分研究(Ⅱ)[J]. 中藥材, 2009, 32(3): 370-372.

[25] 徐任生. 天然產(chǎn)物化學[M]. 2版. 北京: 科學出版社, 2004: 4-20.

[26] 黃阿要, 董瑞建. 功能性成分提取與分離純化方法研究進展[J]. 揚州大學烹飪學報, 2006(1): 59-62. DOI:10.3969/ j.issn.1009-4717.2006.01.017.

[27] 王宇, 王遂. RP-HCLP法測定落葉松中二氫槲皮素的含量[J]. 化學工程師, 2009(2): 22-24.

[28] 樊鐵波, 劉紅煜, 湯青, 等. HPLC法測定松針中二氫槲皮素含量[J].中國藥師, 2009(8): 1046-1048.

[29] 張元桐, 翟延君, 康廷國, 等. HPLC法測定不同地區(qū)水紅花子中花旗松素含量[J]. 中國中藥雜志, 2007, 32(20): 2190-2191.

[30] 魏艷, 陳曉青, 馬志祥, 等. 紅蓼不同提取部位花旗松素和總黃酮含量的測定[J]. 中成藥, 2008, 30(12): 1853-1855. DOI:10.3969/ j.issn.1001-1528.2008.12.045.

Optimization of Purification Process for Dihydroquercetin in Larch Roots by Response Surface Methodology

WANG Jiaqi, SONG Mingming, CHEN Kai, WANG Yueliang, DING Chuanbo, ZHENG Yinan, SHEN Lei, LIU Wencong*(College of Traditional Chinese Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: To optimize the purification conditions for dihydroquercetin in larch roots. Methods: Single factor method combined with Box-behnkn response surface methodology was used to optimize four factors including solid/liquid ratio, recrystallization temperature and time by establishing a model involvin g four independent variables at three levels each based on dihydroquercetin purity. Results: The optimal purification conditions were determined as recrystallized for 20 h at 5 ℃ at a liquid-to-solid ratio of 1:12 ( dihydroquercetin: water). Conclusion: The results of the study can provide scientific basis for the determination of the purification process of dihydroquercetin in industrial production.

dihydroquercetin; recrystallization; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201604004

R931.6

A

1002-6630（2016）04-0020-05

王佳奇, 宋明銘, 陳凱, 等. 響應(yīng)面試驗優(yōu)化落葉松中二氫槲皮素純化工藝[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 20-24.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604004. http://www.spkx.net.cn

WANG Jiaqi, SONG Mingming, CHEN Kai, et al. Optimization of purification process for dihydroquercetin in larch roots by response surface methodology[J]. Food Science, 2016, 37(4): 20-24. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201604004. http://www.spkx.net.cn

2015-06-09

國家科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項目（13C26212201221）

王佳奇（1991—），女，碩士研究生，研究方向為中藥新藥研究與開發(fā)。E-mail：loveyueyang3344@sina.cn

*通信作者：劉文叢（1968—），男，教授，博士，研究方向為中藥新藥研究與開發(fā)。E-mail：jwlw6803@126.com