張培良，王國凱，郁　陽，劉勁松，王舉濤，許鳳清，馬宗慧，張　楠，王　剛

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院　現(xiàn)代中藥安徽省工程技術研究中心，安徽 合肥　230012)

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不同生長時期鳳丹內(nèi)生真菌的分離鑒定及多樣性研究

張培良，王國凱，郁陽，劉勁松，王舉濤，許鳳清，馬宗慧，張楠，王剛

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院現(xiàn)代中藥安徽省工程技術研究中心，安徽 合肥230012)

目的對不同生長時期鳳丹根皮內(nèi)生真菌進行分離鑒定。方法運用組織分離法進行分離，采用形態(tài)學與分子生物學相結合的手段進行鑒定。結果共得到內(nèi)生真菌45株，分屬于9屬13種，其中枯萎期4屬4種，分別為FusariumKeratoplasticum、Myrotheeiumprestonii、Septoriellaphragmitis、Cosmosporacymosa，相對分離頻率為40%?；ㄆ?屬9種，分別為Fusariumacutatum、Fusariumcircinatum、Fusariumfujikuroi、Alternariaalternata、Alternariaarborescens、Climacocystismontana、Pyrenochaetalycopersici、Penicilliumcrustosum、Rhexocercosporidiumpanacis，相對分離頻率為60%。結論鳳丹根皮中內(nèi)生真菌組成豐富，且在不同生長時期其種類組成具有多樣性。

鳳丹；內(nèi)生真菌；分離；鑒定

鳳丹(PaeoniaostiiT. Hong et J. X. Zhang)，其根皮稱“鳳丹皮”[1]。鳳丹皮為安徽四大道地藥材之一，富含丹皮酚等多種生物活性成分?，F(xiàn)代藥理學研究[2-5]表明，鳳丹皮具有抗菌、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、降血壓、降血糖、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、保肝等作用。

內(nèi)生真菌是指在某一段時期生活在植物組織內(nèi)，對植物沒有引起明顯病害癥狀的真菌[6]。近年來研究表明，內(nèi)生真菌能夠促進宿主植物生長和抗逆性以及產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的代謝產(chǎn)物，是藥材形成道地性的關鍵因子[7]。目前，對鳳丹的研究主要集中在化學成分的分析、分離和藥理作用方面。本研究對鳳丹的內(nèi)生真菌組成進一步研究，以期為研究鳳丹藥材道地性以及尋找新型藥用微生物資源奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料供試藥材地上部分枯萎期以及花期健康植株：分別于2016年1月和3月采自安徽省銅陵市鳳凰山，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學方成武教授鑒定為鳳丹(PaeoniaostiiT. Hong et J. X. Zhang)。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基：不含抗生素，由北京奧博星生物技術有限責任公司提供。LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD雙人單面潔凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司；TGL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；SPT-P250C智能生化培養(yǎng)箱：合肥華德利科學器材有限公司；T-Gradient Thermoblock PCR儀：德國Biometra公司；G-BOX凝膠成像系統(tǒng)Gene-Snap：英國Syngene公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；通用引物：為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1(5′-TCCGTAGGTGA-ACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，均由上海生工生物工程股份有限公司定制。

1.2內(nèi)生真菌分離方法取新鮮鳳丹根皮切成約0.5 cm的小段，置于無菌小燒杯中。無菌操作方法：依次用75%的乙醇浸洗2～3 min，3%的次氯酸鈉浸洗3～5 min，75%的乙醇浸洗30 s，無菌水沖洗4～6次，然后用無菌濾紙吸干多余水分，再用無菌刀片將材料切成0.2 cm×0.2 cm的小塊段。將上述組織塊接種于PDA培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿中接種4塊組織塊，置26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～15 d。觀察到培養(yǎng)基上從各植物組織塊內(nèi)部向周圍長出菌絲時，采用尖端菌絲挑取法將真菌轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)、轉(zhuǎn)接，按上述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)2～3代，確保所得菌為純菌。取最后一次沖洗用的無菌水200 μL涂布于PDA培養(yǎng)基表面，平行3份，作為空白對照。

1.3內(nèi)生真菌菌落形態(tài)觀察與鑒定對照《真菌鑒定手冊》[8]，根據(jù)所分得的真菌菌落、培養(yǎng)特征、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結構類型以及孢子的形態(tài)、顏色、大小進行初步鑒定分類。

1.4內(nèi)生真菌DNA提取已純化的菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，26 ℃恒溫避光培養(yǎng)5～7 d。用無菌藥匙將培養(yǎng)基上長滿的菌絲刮出置于無菌研缽中，參照試劑盒步驟進行操作得到DNA溶液，置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

1.5目的片段的擴增和測序擴增真菌rDNA-ITS的上游引物ITS 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應體系50 μL，其中內(nèi)切酶25 μL，ITS1(20 μmol/ L)2 μL，ITS4(20 μmol/L)2 μL，雙蒸水19 μL，DNA模板2 μL。

PCR擴增程序：預變性95 ℃，5 min，變性95 ℃，1 min，復性49 ℃，1 min，延伸72 ℃，2 min，30個循環(huán)，最后延伸72 ℃，10 min。擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液，以100 V電壓電泳約40 min，溴化乙錠染色5 min，由凝膠成像系統(tǒng)進行觀察，拍照。檢測后置于-20 ℃冰箱中保存，備用。將PCR擴增產(chǎn)物進行測序。將測序結果提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫，與相關種屬序列進行同源性比較，并進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

1.6序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建利用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST對序列進行相似性分析，同時采用Clustal X 1.81將序列對齊，利用MEGA 4.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并以自展法進行檢測，共循環(huán)1 000次，構建鄰接樹。

1.7分析方法內(nèi)生真菌的定植率可以反映宿主植物受內(nèi)生真菌侵染的程度[9]，而相對分離頻率可以衡量植物組織中某種內(nèi)生真菌的優(yōu)勢度[10]，分別按以下方法計算：

定植率=受內(nèi)生真菌侵染的組織塊數(shù)/全部供試樣本組織塊數(shù)×100%；

相對分離頻率=分到的某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)/分離到的總菌株數(shù)×100%。

2　結果

2.1不同生長時期鳳丹內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹構建通過組織分離法從鳳丹中共分離得到9屬13種內(nèi)生真菌。對比分離得到的13種內(nèi)生真菌與其同源性相似的13種已知菌種的16 S DNA序列，利用MEGA 4.0和Clustal X 1.81構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果見圖1。

圖1　內(nèi)生真菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2內(nèi)生真菌形態(tài)學觀察對分離得到的內(nèi)生真菌進行菌落特征以及顯微觀察，菌株FD1、FD3、FD5、FD7、FD13長有茂密的白色菌絲，呈棉絮狀，其中含有大量的分生孢子，隔膜明顯，多為3～5隔，5～7 d后菌絲開始變成黃褐色，在顯微鏡下，菌絲呈無規(guī)則狀分布，孢子散落在菌絲中。菌株FD6表面分生孢子球形、橢圓形或梨形，灰褐色，不易散落，顯微鏡下菌絲呈墨綠色，孢子散落其中。菌株FD9表面分生孢子呈球形，黃褐色，易散落，顯微鏡下呈淺綠色，不規(guī)則狀聚集分布。菌株FD2、FD4、FD8、FD10、FD11、FD12因不產(chǎn)孢子，形態(tài)鑒別無意義，故只能通過分子學鑒定。見圖2。

2.3rDNA-ITS序列PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳對分離得到的內(nèi)生真菌提取DNA，得到DNA提取液，進行rDNA-ITS序列擴增，550 bp左右處出現(xiàn)一條單一明亮的條帶。見圖3。

注：M. marker; 1. FD1; 2. FD2; 3. FD3;4. FD4; 5. FD5; 6. FD6; 7. FD7; 8. FD8; 9. FD9; 10. FD10; 11. FD11; 12. FD12; 13. FD13。

圖3內(nèi)生真菌16 S rDNA的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.4不同生長時期鳳丹根皮內(nèi)生真菌種類組成在不同時期鳳丹根皮共160個組織塊中，有144個組織塊侵染有內(nèi)生真菌，定植率為0.9，共得到內(nèi)生真菌

45株，結合形態(tài)特征、ITS序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，所得的鳳丹45株內(nèi)生真菌分屬于9屬13種，其中枯萎期鳳丹根皮組織塊80個，分離出內(nèi)生真菌18株，共4屬4種，分別為Fusarium1種、Myrotheeium1種、Septoriella1種、Cosmospora1種，相對分離頻率為40%?；ㄆ邙P丹根皮組織塊80個，分離出內(nèi)生真菌27株，共6屬9種，分別為Fusarium3種、Alternaria2種、Climacocystis1種、Pyrenochaeta1種、Penicillium1種、Rhexocercosporidium1種，相對分離頻率為60%。Fusarium為優(yōu)勢屬，共有18株，其相對分離頻率為40%。而Fusarium中的F.keratoplasticum與F.acutatum為鳳丹的優(yōu)勢真菌，其相對分離頻率分別為22.22%以及17.78%。見表1。

表1　鳳丹內(nèi)生真菌的多樣性統(tǒng)計及其相對分離頻率

3　討論

內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)是普遍存在的，但在不同生長時期內(nèi)，內(nèi)生真菌種類和數(shù)量具有很大的差異。曹益鳴等[11]曾對不同生長周期的茅蒼術內(nèi)生真菌的種類做過統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌在植株不同生長期均有分布，但在苗期和花期時數(shù)量較多，種類豐富，分離率為39.6%和36.5%。另一方面，包括溫度、降水等因素在內(nèi)的環(huán)境因子直接作用于內(nèi)生真菌，形成真菌群落的季節(jié)性演替現(xiàn)象。呂立新等[12]對茅蒼術的內(nèi)生真菌多樣性進行調(diào)查，將兩種化學型的茅蒼術移栽至同境中，發(fā)現(xiàn)隨著季節(jié)的變化，內(nèi)生真菌群落顯示出一定的演替規(guī)律，夏季內(nèi)生真菌的多樣性高于春季和秋季。本研究從不同生長時期的鳳丹根部中共分離得到了9屬13種內(nèi)生真菌，其中枯萎期4屬4種，共18株，花期6屬9種，共27株，除了優(yōu)勢菌屬鐮刀屬(Fusarium)在鳳丹的枯萎期以及花期中都分離得到外，其他菌屬在不同生長時期上都表現(xiàn)出獨一性，表明鳳丹內(nèi)生真菌在不同生長時期，其種類和數(shù)量上具有顯著性差異，花期的內(nèi)生真菌豐富度大于枯萎期。且本研究所獲得的鳳丹內(nèi)生真菌與鄭艷等[13]所分離得到的內(nèi)生真菌種類基本不相同，進一步豐富了鳳丹內(nèi)生真菌資源。對其進行分析，發(fā)現(xiàn)供試藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)以及所使用的培養(yǎng)基都不相同，是本研究最終所得到的內(nèi)生真菌與鄭艷等[13]所獲得的內(nèi)生真菌種類存在差異的最主要原因。

內(nèi)生真菌具有合成與宿主植物相同或者相似活性成分的能力。從Stierie等[14]從紅豆杉中分離到一株內(nèi)生真菌Taxmyces andreanae可產(chǎn)生與宿主紅豆杉相同的抗癌代謝產(chǎn)物紫杉醇以后，內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物引起了學者們廣泛的關注。經(jīng)過近20年的研究，除從內(nèi)生真菌中分離得到與宿主相同或者相似的化合物以外，還發(fā)現(xiàn)種類豐富的次生代謝產(chǎn)物，其種類涵蓋萜類、醌類、生物堿、異香豆素類、苯并呋喃類、甾體和多肽化合物、酚類等，有很多次生代謝產(chǎn)物十分新穎，利用植物內(nèi)生真菌生產(chǎn)抗癌藥物、殺蟲劑、抑菌劑、植物激素、抗病毒劑、抗氧化劑、免疫抑制劑等均有研究報道。本研究對鳳丹藥用部位內(nèi)生真菌組成進行初步研究，分離得到的內(nèi)生真菌在相關國內(nèi)外文獻中未曾報道，有助于豐富鳳丹內(nèi)生真菌的種類資源，為進一步尋找與鳳丹產(chǎn)生相似活性的次生代謝產(chǎn)物提供物質(zhì)保障。

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Isolation and Identification of Endophytic Fungi fromPaeoniaostiiand Their Diversity in Different Growth Periods

ZHANGPei-liang,WANGGuo-kai,YUYang,LIUJin-song,WANGJu-tao,XUFeng-qing,MAZong-hui,ZHANGNan,WANGGang

(SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine&AnhuiEngineeringResearchCenterofModernizedChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

ObjectiveTo isolate and identify the endophytic fungi from the root bark ofPaeoniaostiiin different growth periods. MethodsTissue isolation was used to isolate the endophytic fungi fromPaeoniaostii, and morphology and molecular biology were used to identify them. ResultsA total of 45 strains of endophytic fungi were obtained fromPaeoniaostii, and they belonged to 13 species in 9 genera. The isolated endophytic fungi in withering period belonged to 4 species in 4 genera:Fusariumkeratoplasticum,Myrotheciumprestonii,Septoriellaphragmitis, andCosmosporacymosa, and the relative isolation frequency was 40%. The isolated endophytic fungi in florescence belonged to 9 species in 6 genera:Fusariumacutatum,Fusariumcircinatum,Fusariumfujikuroi,Alternariaalternata,Alternariaarborescens,Climacocystismontana,Pyrenochaetalycopersici,Penicilliumcrustosum, andRhexocercosporidiumpanacis, and the relative isolation frequency was 60%. ConclusionThere are abundant endophytic fungi in the root bark ofPaeoniaostiiand the species diversity is present in different growth periods.

Paeoniaostii; Endophytic fungus; Isolation; Identification

安徽省高校自然科學基金重點項目(KJ2016A853)；安徽省2015年公益性技術應用研究聯(lián)動計劃(1501ld04001)

張培良(1994-)，男，碩士研究生

王剛，kunhong_8@163.com

R931.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.05.023

2016-05-09；編輯：姚實林)