吳海港，葉兆偉，張廣強(qiáng)

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，河南信陽(yáng)464000）

環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素對(duì)豬鏈球菌體外聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

吳海港，葉兆偉，張廣強(qiáng)

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，河南信陽(yáng)464000）

為了觀察環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素聯(lián)合用藥產(chǎn)生作用，采用環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素體外抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)菌株為臨床上分離的豬鏈球菌17株，采用微量稀釋法檢測(cè)兩種藥物對(duì)豬鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC），依據(jù)最小抑菌濃度再采用棋盤(pán)稀釋法及時(shí)間-殺菌曲線判斷聯(lián)合藥敏效果。結(jié)果顯示，在17株豬鏈球菌對(duì)兩種藥物聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中呈協(xié)同作用的占64.71%，相加作用的占23.53%，無(wú)關(guān)作用的占11.76%，無(wú)拮抗作用，聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中對(duì)豬鏈球菌的平均部分抑菌指數(shù)（FIC）為0.54，說(shuō)明環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素聯(lián)合用藥具有較好的協(xié)同作用。

環(huán)丙沙星；林可霉素；聯(lián)合用藥；豬鏈球菌

環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素是臨床上應(yīng)用最多的抗菌藥物之一，臨床主要用于治療呼吸道及相關(guān)細(xì)菌感染性疾病。但是隨著畜牧業(yè)規(guī)模化、集約化發(fā)展，藥物的大量使用，甚至濫用已造成大量的耐藥菌株，環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素的臨床抗菌作用已有所下降，為延緩環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素耐藥菌株的產(chǎn)生，提高環(huán)丙沙星及林可霉素的用藥安全性及抗菌活性等，尋求新的聯(lián)合用藥技術(shù)，增加療效，抑制耐藥菌株的產(chǎn)生。為此，本試驗(yàn)選用棋盤(pán)稀釋法測(cè)定環(huán)丙沙星和林可霉素聯(lián)合用藥對(duì)豬鏈球菌的體外抑菌效果，以期探討環(huán)丙沙星和林可霉素是否具有增效作用，為獸醫(yī)臨床疾病的控制打開(kāi)新的途徑。

1材料與方法

1.1藥品環(huán)丙沙星原料（含量99.5%，由河南自然康動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：H010105）；鹽酸林可霉素原料（含量99.0%，由河南自然康動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：H0080306）；試驗(yàn)前精密稱取各藥，無(wú)菌操作配制成所需濃度的藥液，分裝后置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)菌株豬鏈球菌17株（由信陽(yáng)動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)中心提供，系臨床分離致病菌）。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)參考菌為鏈球菌藥敏質(zhì)控株CVCC3223，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3培養(yǎng)基5%犢牛血清的營(yíng)養(yǎng)肉湯、鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按照常規(guī)方法制作，用于豬鏈球菌培養(yǎng)。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1菌液的制備試驗(yàn)前將菌種經(jīng)培養(yǎng)、復(fù)壯、重新分離同一平板上性狀相似的2～3個(gè)菌落，接種到3～5mL肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃培養(yǎng)8～10 h。

為確定茵液濃度，對(duì)細(xì)菌分別作平板活菌計(jì)數(shù)：將原菌液以10-1倍稀釋，分別如下：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8；將各菌液分別取10-6、10-7、10-8的濃度以微量加樣器取100 μL到預(yù)先準(zhǔn)備好的鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，將玻璃刮鏟在火焰上灼燒滅菌冷卻后，將菌液均勻推散在平板培養(yǎng)基表面（經(jīng)無(wú)菌檢查合格），每個(gè)濃度涂3個(gè)平板；培養(yǎng)24 h后觀察，計(jì)算菌落數(shù)。

1.4.2單藥最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定方法采用12×8的96孔V型孔底的微孔稀釋板，每排的1～12孔各加入50 μL 5%犢牛血清的營(yíng)養(yǎng)肉湯，再取50 μL 4倍終濃度的藥液從第1孔做倍比稀釋至11孔，稀釋完第11孔后棄去50 μL，12孔為無(wú)藥對(duì)照。再加50 μL稀釋好的菌液于每排的1～12孔，使最終每孔菌液濃度為1×105CFU/mL，37℃孵育18～24 h后觀察結(jié)果。試驗(yàn)時(shí)每種藥物對(duì)每種菌做3排重復(fù)，同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)菌CVCC3223做質(zhì)量控制。

1.4.3聯(lián)合藥敏試驗(yàn)采用棋盤(pán)微量稀釋法以各藥對(duì)應(yīng)各種菌MIC值確定藥物稀釋度，采用7個(gè)稀釋度，藥物最高濃度為其MIC的2倍，依次對(duì)倍稀釋為1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍濃度，兩種藥物的稀釋分別在96孔板上按橫列和縱列進(jìn)行聯(lián)合，接種菌量為1×105CFU/mL，37℃孵育18～24 h后觀察結(jié)果。

1.5結(jié)果判定以FIC作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判定依據(jù)。

FIC指數(shù)的計(jì)算公式：

（FIC：≤0.5協(xié)同作用；0.5～1相加作用；1～2無(wú)關(guān)作用；＞2拮抗作用）。

1.6體外藥效動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)選取17株鏈球菌中的13-5株為試驗(yàn)菌株，測(cè)定環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素單用及聯(lián)合用藥（1∶1）的時(shí)間-殺菌曲線。環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素單藥取1MIC濃度，聯(lián)合用藥取最佳抑菌點(diǎn)濃度，對(duì)照管不含藥物，分別將菌液和藥液混合，使菌液終濃度為1×105CFU/mL，37℃培養(yǎng)，分別于0、1、2、4、.6、8、10、12 h取0.1 mL培養(yǎng)液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，繪制時(shí)間-殺菌曲線。

2結(jié)果

2.1環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素單用體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素單用及聯(lián)合用藥的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，從表1可以看出，單用環(huán)丙沙星對(duì)豬鏈球菌的MIC值為8～256 μg/mL，鹽酸林可霉素單用時(shí)對(duì)豬鏈球菌的MIC值為16～256 μg/mL。

2.2環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果環(huán)丙沙星與鹽酸林可霉素聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果由表1可以看出，17株菌中有11株呈協(xié)同作用，所占比例64.71%；4株為相加作用占23.53%；2株為無(wú)關(guān)作用占11.76%；無(wú)拮抗作用。環(huán)丙沙星與鹽酸林可霉素聯(lián)用對(duì)豬鏈球菌FIC的平均值分別為0.54，具有較好的協(xié)同作用。

表1環(huán)丙沙星和林可霉素單用及聯(lián)合應(yīng)用藥敏試驗(yàn)

表2兩藥聯(lián)用對(duì)豬鏈球菌FIC構(gòu)成比

2.3時(shí)間-殺菌曲線測(cè)定結(jié)果環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素單用及聯(lián)合用藥對(duì)豬鏈球菌13～5的時(shí)間-殺菌曲線見(jiàn)圖1，從圖1可以看出，在1 h時(shí)，環(huán)丙沙星組、鹽酸林可霉素組及聯(lián)合用藥組都出現(xiàn)菌數(shù)下降趨勢(shì)，但差異不大。從4 h開(kāi)始，鹽酸林可霉素組菌數(shù)開(kāi)始出現(xiàn)上升趨勢(shì)。在10 h時(shí)環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素的菌數(shù)差異不顯著，但低于對(duì)照組，減少約103倍，而聯(lián)合用藥組和對(duì)照組相比減少約105倍。在12 h時(shí)，和對(duì)照組相比，環(huán)丙沙星減少約103倍，鹽酸林可霉素減少約102倍，而聯(lián)合用藥組減少約106倍，可見(jiàn)兩藥合用有較好的協(xié)同作用。

圖1環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素單用及聯(lián)合對(duì)豬鏈球菌的時(shí)間-殺菌曲線

3討論

環(huán)丙沙星是第3代喹諾酮類抗生素，是一種廣譜的抗生素，其作用機(jī)理主要是抑制細(xì)菌的DNA回旋酶而發(fā)揮快速殺菌作用。鹽酸林可霉素對(duì)常見(jiàn)革蘭陽(yáng)性菌有較強(qiáng)抗菌活性。可作為耐青霉素、紅霉素替代藥物，其作用機(jī)制主要是作用于核糖體的50S亞基，阻止肽鏈的延長(zhǎng)，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成［1］。體外藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌對(duì)環(huán)丙沙星的MIC值為8～256 μg/ mL，對(duì)鹽酸林可霉素的MIC值為16～256 μg/mL，與文獻(xiàn)報(bào)道MIC值相比［2-4］，豬鏈球菌對(duì)環(huán)丙沙星和林可霉素表現(xiàn)出一定的耐藥性，往往臨床治療豬鏈球菌病時(shí)效果不佳，造成養(yǎng)殖過(guò)程中用藥劑量加大，易導(dǎo)致食品動(dòng)物中的藥物殘留。

環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素體外藥敏試驗(yàn)及時(shí)間-殺菌曲線表明，兩者連用對(duì)豬鏈球菌具有協(xié)同或相加作用，其協(xié)同增效機(jī)制可能是通過(guò)不同途徑阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，起到抑菌和殺菌的作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，兩者合用可提高療效、減少耐藥發(fā)生和降低毒副反應(yīng)，因此臨床中治療由豬鏈球菌引起的感染，可以采用環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素聯(lián)合用藥，可有效殺滅細(xì)菌同時(shí)減緩耐藥的發(fā)生。但是由于兩種抗生素聯(lián)合使用對(duì)某些或某一種細(xì)菌起到協(xié)同或相加作用，并不是對(duì)所有的細(xì)菌均能起到增效作用［5-6］，因此在臨床使用中不能隨意將兩種抗生素進(jìn)行聯(lián)合用藥，具體應(yīng)用情況還要以實(shí)驗(yàn)室結(jié)果為依據(jù)。

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S858.28

B

0529-6005（2016）08-0108-02

2015-03-02

信陽(yáng)市科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目（140052）

吳海港（1982-），男，講師，碩士，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)研究及教學(xué)，E-mail：haigang413@126.com