高翔，李棟梁，趙景義，徐發(fā)榮，陳艷紅，周磊

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京海淀100193；2.北京市動物疫病預防控制中心，北京大興102600）

豬流行性腹瀉病毒SD2014株全基因組序列測定與遺傳演化分析

高翔1，李棟梁2，趙景義2，徐發(fā)榮2，陳艷紅1，周磊1

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京海淀100193；2.北京市動物疫病預防控制中心，北京大興102600）

為分析豬流行性腹瀉病毒（PEDV）在國內(nèi)的流行及變異情況，對2014年在山東省某豬場流行的PEDV毒株SD2014進行全基因組測序，并與國內(nèi)外代表毒株進行序列比對、同源性分析和遺傳演化分析。結(jié)果表明，SD2014毒株全長28，036 nt（除去PolyA）。遺傳演化分析顯示該毒株與美國分離株OH851以及我國2010年后分離的變異毒株屬于同一分支。通過對S基因和ORF3序列進行對比，發(fā)現(xiàn)SD2014與我國早期分離株BJ-2011-1變異位點相似，且與歐美毒株和疫苗株（CV777）差異明顯。提示自2010年P(guān)ED暴發(fā)后，與疫苗株差異較大的變異株仍在國內(nèi)流行，該病防控形勢依然嚴峻。

豬流行性腹瀉病毒；全基因組序列；遺傳演化

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種豬的高度接觸性傳染病，感染豬以急性腸炎、水樣腹瀉、嘔吐為主要特征［1-2］。5日齡及以下仔豬由于腹瀉和嘔吐造成嚴重脫水，死亡率可高達90%～100%。該病自1971年首次在英國被發(fā)現(xiàn)以來［3］，在世界上多個養(yǎng)豬國家均已有報道［4-7］。2010年冬季以來，我國各省份均暴發(fā)了有史以來最為嚴重的PED，2013年5月后北美各國及日本也有大量關(guān)于PED的報道［8-13］。對大量PEDV臨床分離株進行序列測定及抗原分析發(fā)現(xiàn)，不同的PEDV毒株在基因序列和抗原性等方面都存在較大差異，并可導致致病性的差異。因此，分析PEDV各毒株的基因變異、親緣關(guān)系以及與疫苗株的相似性對闡明流行毒株的遺傳演化規(guī)律，以及今后PEDV疫苗株的選擇提供重要的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1待檢樣品采自山東省疑似PED發(fā)病仔豬的腸道組織及糞便，-80℃保存。

1.2主要試劑KOD聚合酶、M-MLV、RNA酶抑制劑、dNTPs、pEASY-Blunt克隆試劑盒，購自北京全式金公司；TRIzol，購自Invitrogen公司；膠回收純化試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；RACE試劑盒購自Takara公司。

1.3引物設(shè)計參考實驗室前期研究，將病毒全基因組分為27個片段，運用Oligo7軟件設(shè)計54條PCR引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。1.4病料處理及RNA提取取發(fā)病仔豬腸道組織、糞便等加入DMEM后研磨制成懸液，離心取上清，用TRIzol提取RNA。

1.5反轉(zhuǎn)錄選用下游引物，M-MLV進行RNA反轉(zhuǎn)錄，制備cDNA模板。反轉(zhuǎn)錄體系共20 μL，具體為5Xbuffer 4 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、10μmol/L下游引物2 μL、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、RNA模板12 μL；42℃反應1 h。

1.6PCR擴增及片段回收選用片段特異性引物，配置PCR反應體系，共50 μL

2xbuffer 25 μL、2 mmol/L dNTPs 10 μL、10 μmol/L上下游引物各1.5 μL、KOD酶1 μL、cDNA模板3 μL，剩余用無菌雙蒸水補足至50 μL。反應程序為94℃3 min，98℃10 s、55℃30 s、68℃30 s/kb延伸，30個循環(huán)，68℃7 min。PCR后膠回收目的片段。每個片段獨立重復3次。

1.7克隆測序使用pEASY-Blunt克隆目的片段，陽性質(zhì)粒送至鉑尚生物測序。測序結(jié)果經(jīng)DNAstar軟件拼接，采用ClustalX、Lasergene、GeneDoc等進行序列比對，使用ClustalW算法將測定的序列與PEDV經(jīng)典毒株和變異株進行同源性分析，并使用Neighbor-Joining Method在MGEA 5.1軟件中繪制進化樹，Bootstrap數(shù)為1000。

2結(jié)果與分析

2.1片段擴增經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴增片段與預期大小一致（圖1）。

圖1SD2014毒株全基因組引物擴增結(jié)果

2.2序列測定與拼接利用通用測序引物M13F/ R對陽性克隆進行測序，經(jīng)3次獨立實驗選取保守序列。使用DNAstar把27個片段序列進行拼接，得到SD2014的全基因組序列，全長為28，036nt（不含polyA尾），已錄入GenBank數(shù)據(jù)庫（登錄號：KX064280.1）

2.3病毒的全基因組序列分析參考國內(nèi)外PEDV毒株的序列，對SD2014進行全基因組分析?；蚪M的組成及各段基因的位置和長度見表1。

表1SD2014的全基因組組成

通過分子生物學軟件Lasergene和MEGA5.1，將SD2014與另外49株國內(nèi)外PEDV毒株進行序列對比并繪制出進化樹。

從圖2可以看出，在進化樹中PEDV毒株可以分成兩個分支，一組全部為2010年暴發(fā)后的變異毒株，另一組主要為疫苗用毒株及2010年前的早期分離株。SD2014與2013年在美國暴發(fā)的毒株親緣性較近，而且與2010年后在中國大量流行的毒株同屬于同一個大分支內(nèi)，而與2010年前的經(jīng)典毒株及疫苗株都有較大的差別。

選取不同地域的分離株與SD2014進行核苷酸與氨基酸同源性對比，見表2。其中SD2014全基因組同源性與我國早期分離株BJ-2011-1最近，其次是美國分離株OH851以及韓國分離株KNU-1406-1，而與疫苗株CV777以及SM98親緣性較遠。

2.4S基因比對S基因與PEDV免疫保護相關(guān)，同時也是PEDV變異最大的基因，SD2014的S基因全長4 161 nt，編碼1 386個氨基酸，分為S1、S2區(qū)域。SD2014與其他7株P(guān)EDV毒株相比較，核苷酸同源性為93.6%～99.0%，氨基酸的同源性為92.5%～99.1%。SD2014變異情況和BJ-2011-1最為相似，在S1區(qū)域內(nèi)與其他毒株存在明顯差異，如圖3所示。

2.5ORF3比對ORF3為PEDV的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因，可影響病毒致病性。SD2014中ORF3全長為675 nt，編碼224個氨基酸。將8株P(guān)EDV毒株的ORF3進行序列對比，可知SM98與SD2014和其他毒株相比在C端有70個氨基酸的缺失，其余序列整體上變異不大。SD2014在以下幾個氨基酸位點出現(xiàn)突變（93：L-＞F，147-148：LE-＞AL；159：S-＞F）。

圖2全基因組遺傳進化樹

3討論

PED作為養(yǎng)豬業(yè)危害較嚴重的傳染病之一，自2010年全國性暴發(fā)之后近年仍在各省份散在發(fā)生。SD2014引起發(fā)病的豬場，PED發(fā)病率為80%，死亡率約為30%。

通過對SD2014及49株P(guān)EDV毒株進行全基因組序列比對并繪制進化樹發(fā)現(xiàn)毒株可總體分成兩大分支，一支是以CV777、SM98為代表的經(jīng)典毒株群，包括國內(nèi)最早的分離株CH/S，及少量2010年后分離的毒株，另一支則全部為2010年暴發(fā)后的分離株，以SD2014，BJ-2011-1和國外毒株OH851為代表。SD2014與2010年后分離毒株親緣性較近，與疫苗株親緣關(guān)系較遠，核酸同源性只有96.5%～96.7%，并且變異集中發(fā)生在S基因和ORF3區(qū)域。

S蛋白具有促進宿主免疫應答、介導病毒入細胞等功能，同時其編碼區(qū)域為PEDV變異最大的區(qū)域之一。S基因序列比對發(fā)現(xiàn)，SD2014與CV777和SM98 S基因的同源性只有93.6%～93.9%，同2010年后的分離毒株相似，較經(jīng)典毒株在此區(qū)域存在插入和缺失等變異情況，這可能是導致毒株毒力變強以及免疫失效的一個原因。

表2SD2014與7株國內(nèi)外PEDV毒株全基因組核苷酸和氨基酸序列的同源性比較

綜合以上結(jié)果表明，2010年后暴發(fā)的一批變異毒株目前仍在我國流行，并以成為我國田間主要流行株。該類毒株與疫苗株親緣性較遠，是造成免疫失效的重要原因，其為PED的預防和控制的提出了新的挑戰(zhàn)。

圖3SD2014毒株與參考毒株S基因編碼氨基酸序列對比

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WholeGenomic Sequencing and Phylogenic Analysis of PorcineEpidemic Diarrhea Virus SD2014 Strain

GAO Xiang1，LI Dong-liang2，ZHAO Jing-yi2，XU Fa-rong2，CHEN Yan-hong1，ZHOU Lei1
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.Beijing Center for Animal Disease Control and Prevention，Beijing 102600，China）

To analyze the variation and epidemic situation of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）in China，the whole genomic sequencing，sequence aligning and phylogenetic analysis on the newly isolated strain SD2014 were performed.The results showed that the whole genome of SD2014 virus was 28，036 nt in length，excluding PloyA tail.A according to the phylogenetic analysis，SD2014 was clustered with American prototype strain OH851 and Chinese variants isolated after 2010，in the same branch.Based on the results of sequence alignment on S gene and ORF3，the SD2014 shared high identities with representative strain BJ-2011-1 of chinese isolates but low identity with vaccine strain CV777，suggesting that the variant is still circulating in the field，and causes problems for PED prevention and control.

porcine epidemic diarrhea virus；whole genomic sequence；evolution

s：CHEN Yan-hong；ZHOU Lei

S852.65+1

A

0529-6005（2016）08-0012-04

2016-07-07

高翔（1995-），男，本科生，專業(yè)方向為動物病毒遺傳演化分析和診斷方法的URP研究，E-mail：stu2088@163.com

陳艷紅，E-mail：chenyh@cau.edu.cn；周磊，E-mail：leosj@cau.edu.cn