程晉龍，劉蒙蒙，胡楠，張國(guó)中

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193；2.北京市畜牧總站，北京朝陽(yáng)100107）

ClassⅠ新城疫病毒BJ 1株微基因組的構(gòu)建及功能鑒定

程晉龍1，劉蒙蒙1，胡楠2，張國(guó)中1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193；2.北京市畜牧總站，北京朝陽(yáng)100107）

將以綠色熒光蛋白（EGFP）為報(bào)告基因的ClassⅠ類(lèi)新城疫病毒（NDV）BJ1株微基因組質(zhì)粒pOK-M和3個(gè)輔助蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L共轉(zhuǎn)染BSR T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h即可見(jiàn)到明顯的綠色熒光，表明微基因組及其3種輔助質(zhì)粒均獲得了表達(dá)，并具有各自的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步建立該毒株的反向遺傳操作系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。

新城疫病毒；ClassⅠ；微基因組；反向遺傳；輔助質(zhì)粒

新城疫病毒（NDV）為副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒屬（Rubulavirus）成員，是禽Ⅰ型副黏病毒的代表株。病毒核酸為單股負(fù)鏈RNA，根據(jù)基因組長(zhǎng)度NDV分為ClassⅠ和ClassⅡ兩類(lèi)［1］，其中ClassⅠ型NDV基因組長(zhǎng)15 198 nt［2］，廣泛存在于野鳥(niǎo)和家禽中，多為無(wú)致病性或致病性較弱的毒株；ClassⅡ類(lèi)NDV基因組包括兩種長(zhǎng)度：15 186 nt或15 192 nt［3］，其中既包括強(qiáng)毒株也包括弱毒株。因?yàn)殡u群暴發(fā)的致死性新城疫通常是由ClassⅡNDV中的強(qiáng)毒株引起［4-5］，所以人們對(duì)ClassⅡNDV研究較早。ClassⅠ類(lèi)NDV因其通常沒(méi)有致病性所以研究較少，但該類(lèi)病毒在各種鳥(niǎo)類(lèi)中廣泛存在。有研究表明，ClassⅠ類(lèi)NDV在傳代過(guò)程中毒力有增強(qiáng)的可能性［6］，因此該類(lèi)NDV對(duì)養(yǎng)禽業(yè)有潛在的威脅。

NDV的微基因組是包含了病毒全長(zhǎng)基因組3′和5′末端UTR（非編碼區(qū)）序列，并用反向互補(bǔ)的EGFP（綠色熒光蛋白）替代其間的編碼區(qū)序列所構(gòu)成的一種缺損病毒，因其需要輔助蛋白的幫助才能完成編碼區(qū)蛋白（EGFP）的表達(dá)，所以人們往往把其作為檢測(cè)輔助質(zhì)粒的重要工具。本研究構(gòu)建了ClassⅠ類(lèi)NDV BJ1株的微基因組及其3種輔助質(zhì)粒，并對(duì)他們的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，為建立該毒株全基因組反向遺傳操作系統(tǒng)和開(kāi)展功能基因組研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1毒株本研究所用ClassⅠNDV毒株系本實(shí)驗(yàn)室于2014年從北京某活禽市場(chǎng)分離獲得，通過(guò)接種SPF雞胚進(jìn)行病毒傳代。

1.2質(zhì)粒和細(xì)胞真核表達(dá)載體pCI-neo，購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；表達(dá)T7 RNA聚合酶的BSR T7/5細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的質(zhì)粒pEGFPN1，購(gòu)自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司。

1.3分子生物學(xué)試劑M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4連接酶，購(gòu)自Promega公司；dNTP，購(gòu)自TaKaRa公司；Lipofectamine 2000、限制性?xún)?nèi)切酶以及TRIZol抽提試劑，購(gòu)自Invitrogen公司；Plasmid Mini Kit，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司。

1.4微型基因組的構(gòu)建微基因組包括4部分：T7啟動(dòng)子和cDNA的3′UTR、EGFP、cDNA的5′UTR、核酶序列和T7終止子，分別命名為M1、M2、M3、M4。大小分別為211 bp、720 bp、121 bp和136 bp。設(shè)計(jì)引物（表1）PCR擴(kuò)增得到4個(gè)目的片段，再使用融合PCR的方法得到完整的微基因組片段。用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和PstⅠ對(duì)微基因組和pOK進(jìn)行酶切，電泳鑒定后進(jìn)行膠回收純化，然后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，挑取菌落做菌液PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定，得到陽(yáng)性質(zhì)粒pOK-M。

表1用于擴(kuò)增微基因組片段的引物

1.5輔助質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物（表2）利用PCR方法獲得3種輔助蛋白NP、P、L的目的片段，用特定的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)目的片段和表達(dá)載體pCI-neo進(jìn)行酶切，酶切后對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收純化，然后將相應(yīng)的目的片段與載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，挑取菌落做菌液PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。其中對(duì)NP、P和pCI-neo載體用XholⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切。由于L基因組較長(zhǎng)，采用了分段克隆的方式進(jìn)行拼接并轉(zhuǎn)移到pCI載體中。將得到陽(yáng)性質(zhì)粒分別命名為pCI-NP、pCI-P和 pCI-L。

1.6輔助質(zhì)粒功能的鑒定采用Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，將pOK-M、pCINP、pCI-P和pCI-L 4種質(zhì)粒共2 μg按照2∶2∶1∶1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于6孔板的BSR T7/5細(xì)胞，設(shè)置缺少pCI-L轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照，37℃下作用5 h，更換含有10%胎牛血清的DMEM。37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因的表達(dá)情況。

表2用于擴(kuò)增NP、P、L的引物

2結(jié)果

2.1微型基因組的構(gòu)建NDV的微基因組分為四部分，其中M1片段包括EcoRⅠ酶切位點(diǎn)、T7啟動(dòng)子和cDNA的3′UTR，M2為反向互補(bǔ)的EGFP，M3為cDNA的5′UTR，M4包含核酶序列、T7終止子和PstⅠ酶切位點(diǎn)，M為上述4個(gè)片段經(jīng)融合PCR后的產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收測(cè)序比對(duì)后，序列正確，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

圖1微基因組4部分及融合PCR產(chǎn)物的電泳鑒定

2.2輔助質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴(kuò)增得到的NP、P、L1、L2、L3基因片段大小分別為1.5 kb、1.2 kb、1.5 kb、2.2 kb和2.8 kb，PCR產(chǎn)物膠回收后測(cè)序，與原測(cè)序結(jié)果比對(duì)，序列正確，無(wú)突變，電泳鑒定結(jié)果如圖2所示。采用常規(guī)連接轉(zhuǎn)化的方法克隆到pCI-neo載體中，經(jīng)測(cè)序鑒定后得到3種輔助質(zhì)粒，命名為pCI-NP、pCI-P、pCI-L。

圖2NP、P和L基因PCR產(chǎn)物的電泳鑒定

2.3輔助質(zhì)粒功能的鑒定pOK-M、pCI-NP、pCIP和pCI-L 4種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR T7/5細(xì)胞24 h后，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中可觀察到明顯的特異性綠色熒光（圖3A），表明報(bào)告基因EGFP得到表達(dá)，說(shuō)明輔助質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物具有功能活性，可以啟動(dòng)微基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。而在陰性對(duì)照組中未觀察到熒光（圖3B）。

圖3轉(zhuǎn)染BSR T7/5細(xì)胞24 h后特異性熒光的觀察結(jié)果

3討論

ClassⅠ型NDV毒株多是弱毒株或無(wú)致病性的毒株，主要存在于野生鳥(niǎo)或水禽中。近年來(lái)，在我國(guó)大陸、香港、臺(tái)灣等活禽市場(chǎng)中均能分離到ClassⅠ型NDV毒株，而Yu等的研究證明，某些ClassⅠ型弱毒株在雞體內(nèi)經(jīng)過(guò)傳代會(huì)發(fā)生毒力增強(qiáng)的現(xiàn)象［7］，可能造成ND的流行。由于該類(lèi)病毒在各種鳥(niǎo)類(lèi)中廣泛存在，不同毒株混合感染還可能會(huì)造成不同毒株的重組，使得ND的防治變得更加復(fù)雜。

反向遺傳技術(shù)已經(jīng)成為NDV研究不可或缺的技術(shù)平臺(tái)，也被稱(chēng)為“病毒拯救”［7］。NDV的拯救首先要構(gòu)建3種輔助質(zhì)粒，分別為表達(dá)NP、P、L蛋白的質(zhì)粒，這3種質(zhì)粒對(duì)NDV的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄起著重要作用，而微基因組一般作為檢測(cè)輔助質(zhì)粒生物活性的工具。本研究通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出NP、P、L基因，并分別成功克隆到pCI-neo載體上，經(jīng)測(cè)序鑒定，擴(kuò)增的目的片段序列正確。其中L片段分3段進(jìn)行克隆。為了檢測(cè)這3種輔助質(zhì)粒的活性，本研究又構(gòu)建了NDV的微基因組。NDV的微基因組是包含了病毒全長(zhǎng)基因組3′和5′末端UTR（非編碼區(qū)）序列，并用反向互補(bǔ)的EGFP（綠色熒光蛋白）替代其間的編碼區(qū)序列所構(gòu)成的一種缺損病毒，需要輔助蛋白的幫助才能完成編碼區(qū)蛋白（EGFP）的表達(dá)。因此，微基因組中EGFP的表達(dá)可以說(shuō)明構(gòu)建的輔助質(zhì)粒具有表達(dá)活性。

本研究利用構(gòu)建的微基因組質(zhì)粒pOK-M對(duì)構(gòu)建的3個(gè)輔助質(zhì)?；钚赃M(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)染的BSR T7/5細(xì)胞中可觀察到特異性熒光，說(shuō)明3個(gè)輔助質(zhì)粒均有表達(dá)活性，為進(jìn)一步建立該病毒的反向遺傳操作平臺(tái)奠定了基礎(chǔ)。

［1］Czegledi A，Ujvari D，Somogyi E，et al.Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1（Newcastle disease virus）and evolutionary implications［J］.Virus Res，2006，120：36-48.

［2］Locke D P，Sellers H S，Crawford J M，et al.Newcastle disease virus phosphoprotein gene analysis and transcriptional editing in avian cells［J］.Virus Res，2000，69：55-68.

［3］Krishnamurthy S，Samal S K.Nucleotide sequences of the trailer: nucleocapsid protein gene and intergenic regions of NDV strain Beaudette C and completion of the entire genome sequence［J］.J GenVirol，1998，79：2419-2424.

［4］Ganar K，Das M，Sinha S，et al.Newcastle disease virus:current status and our understanding［J］.Virus Res，2014，184：71-81.

［5］Alexander D J，Wilson G W C，Russell P H，et al.Newcastle disease outbreaks in fowl in Great Britain during 1984［J］.Vet Rec，1985，117：429-434.

［6］Shengqing Y，Kishida N，Ito H，et al.Generation of velogenic Newcastle disease viruses from a nonpathogenic waterfowl isolate by passaging in chickens［J］.Virology，2002，301（2）：206-211.

［7］趙長(zhǎng)光，宋松林，趙繼勛，等.新城疫病毒反向遺傳技術(shù)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2011，47（10）：56-59.

Construction and Identification of Mini-genomeof ClassⅠNewcastleDiseaseVirus Strain BJ 1

CHENG Jin-long1，LIU Meng-meng1，HU Nan2，ZHANG Guo-zhong1
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.Beijing Animal Husbandry Station，Beijing 100107，China）

To examine the efficiency of the mini-genome rescue system，BSR-T7/5 cells were co-transfected with pOK-M，pCI-NP，pCI-P，pCI-L.The results showed that the green fluorescence was observed in the co-transfected group，but there was no green fluorescence in the control groups in 24 h.The result indicated that the NP，P and L proteins were all expressed.In conclusion，we established a mini-genome system that could be applied to the recovery of NDV BJ1 strain.

NDV；ClassⅠ；Mini-genome；Reverse genetics；Helper plasmids

ZHANG Guo-zhong

S852.65+9.5

A

0529-6005（2016）08-0009-03

2015-05-05

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專(zhuān)項(xiàng)資金（CARS-PSTP）

程晉龍（1993-），男，本科生，就讀于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)，E-mail：15611528256@163.com

張國(guó)中，E-mail：zhanggz@cau.edu.cn