劉暢，王軍，劉紅羽，呂文發(fā)

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春130118）

肉牛黃體期和卵泡期陰道菌群結構的比較研究

劉暢，王軍，劉紅羽，呂文發(fā)

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春130118）

為了研究生殖激素對陰道菌群的影響，選取7頭健康肉牛，分別采集黃體期和卵泡期陰道分泌物，提取細菌總DNA，根據(jù)DGGE克隆測序結果，選擇5種特異性細菌，利用熒光定量PCR技術檢測各細菌數(shù)量。結果表明，總菌、大腸桿菌、鞘氨醇單胞菌和睡眠嗜血桿菌菌群數(shù)量在兩組間無顯著差異（P＞0.05），但黃體期鏈球菌屬數(shù)量顯著高于卵泡期（P＜0.01），卵泡期乳桿菌屬數(shù)量顯著高于黃體期（P＜0.05）。結果提示，肉牛黃體期與卵泡期的陰道菌群結構存在顯著差異。

肉牛；黃體期和卵泡期；陰道；Real-time PCR；菌群

機體生殖道菌群是一個復雜的微生態(tài)系統(tǒng)，由于細菌培養(yǎng)手段的局限性，傳統(tǒng)細菌分離鑒定方法使得我們對其結構知之甚少。利用傳統(tǒng)細菌分離方法研究發(fā)現(xiàn)，牛陰道內菌群主要由鏈球菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬和乳桿菌屬組成［1-2］，對人和某些哺乳動物陰道菌群進行分析，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬是主要組成成分，乳桿菌屬可以保護機體免受病原菌侵入［3-4］。

Cowley等對發(fā)情周期不同階段小鼠陰道菌群的研究發(fā)現(xiàn)，處于卵泡期小鼠陰道細菌數(shù)量較黃體期多［5］；而Koiter等卻發(fā)現(xiàn)小鼠黃體期陰道細菌數(shù)量高于卵泡期［6］。上述結果提示，不同生理時期生殖激素對陰道菌群有影響。前期本實驗室應用PCR-DGGE技術檢測出黃體期與卵泡期肉牛陰道細菌有：氣球菌、綠色氣球菌、睡眠嗜血桿菌、多動物鏈球菌、嗜冷桿菌、大腸桿菌、鞘氨醇單胞菌，但不能準確判斷細菌數(shù)量上的差異。根據(jù)前期試驗結果，設計不同細菌特異性引物，應用熒光定量PCR技術對健康肉牛黃體期和卵泡期陰道菌群進行定量分析，比較不同生理時期肉牛陰道菌群差異，為進一步開發(fā)微生態(tài)制劑奠定基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑QIAamp DNA MiniKit、膠回收試劑盒，購自QIAGEN公司；DL-2 000 Marker、TaqDNA聚合酶、pMD18-T質粒、SYBR@GreenIPremix-ExTaqTM等，均購自TaKaRa公司；Primer synthesis、50×TAE緩沖液，購自上海生工生物工程技術服務有限公司；質粒提取試劑盒，購自Axygen公司。

1.2基因組DNA提取選取15頭西門塔爾雜交肉牛開展同期發(fā)情，篩選7頭母牛，分別采集黃體期（L1-L7）和卵泡期（F1-F7）陰道樣品，采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒［7-8］按說明書提取細菌基因組DNA。應用NanDrop 2 000檢測濃度，對每個樣品進行不同濃度的稀釋，最終達到20 mg/L。

1.3引物的設計與合成總菌及5種菌屬特異性引物根據(jù)PCR-DGGE及16S rDNA基因序列設計。將6對引物用BLAST軟件進行在線核實其特異性后由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列見表1。

表1熒光定量PCR特異性引物

1.4標準曲線的制作檢測各個特異性引物最佳反應條件，之后將各標準菌株PCR產(chǎn)物切膠、回收后所得的產(chǎn)物進行連接轉化，將陽性菌液提取的質粒作為熒光定量PCR的標準品，測定OD值及濃度，換算為各標準品1 μL的拷貝數(shù)，用于制作標準曲線。

1.5待測樣品定量分析采用兩步法進行PCR擴增，將待測肉牛黃體期與卵泡期樣品提取的DNA分別進行總菌及5種細菌16S rDNA熒光定量PCR反應，反應體系20 μL：SYBR GreenⅠ10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，DNA模板2 μL，補ddH2O至20 μL；反應程序為：95℃預變性30 s；95℃變性5 min，不同退火（如表1）溫度復性34 s，40個循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，1個循環(huán)。每次試驗同時設標準品校正和ddH2O代替DNA模板的陰性對照，每個樣品均同時做3個平行復孔。

1.6統(tǒng)計學方法應用SPSS18.0軟件對熒光定量結果進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩個樣本均數(shù)的比較根據(jù)正態(tài)分布檢驗結果采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2結果

2.1定量曲線結果根據(jù)熒光定量PCR擴增結果，總菌及5種特異性菌標準曲線的相關系數(shù)（R2）均大于0.98，斜率在-3～-3.5之間；通過溶解曲線，確定了總菌、鏈球菌屬、大腸桿菌、鞘氨醇單胞菌、睡眠嗜血桿菌和乳桿菌屬的Tm值分別在85.01℃、84.4℃、82.17℃、83.22℃、80.98℃和86.8℃左右。2.2特異菌群定量檢測結果不同生理時期陰道細菌結果如表2所示，用lg copies表示。結果顯示，黃體期肉牛陰道內鏈球菌屬數(shù)量極顯著高于卵泡期（P＜0.01），而卵泡期肉牛陰道內乳桿菌屬的數(shù)量顯著高于黃體期（P＜.05），其他細菌，兩組間差異不顯著（P＞0.05）。

表2不同生理時期細菌定量檢測結果

3討論

生殖道菌群對生殖道健康起重要作用，本試驗應用Real-time PCR檢測健康肉牛陰道菌群結構，發(fā)現(xiàn)生殖激素對陰道菌群有影響。前期利用DGGE技術研究了肉牛黃體期和卵泡期陰道菌群結構，研究并未發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬，但基于DGGE技術不能檢測低于1%的菌及乳桿菌屬的重要價值，本研究利用Real-time PCR測定了乳桿菌數(shù)量，研究發(fā)現(xiàn)，牛陰道中確實存在乳桿菌，但數(shù)量低于1%，且顯著低于哺乳動物陰道乳桿菌所占比例，結果與Rodriguez等對奶牛和肉牛黃體期陰道乳

斑點熱（spotted fever）是由斑點熱群立克次體（Spotted fever group rickettsia，SFGR）所引起的一組疾病的總稱。SFGR為專性細胞內寄生，是人獸共患的一大類自然疫源性疾病。蜱作為保菌宿主，SFGR在蜱種維持著持久的感染循環(huán)，可經(jīng)卵垂直傳遞立克次體以保持其種群的連續(xù)性。近年來，世界范圍內新發(fā)及再發(fā)立克次體并逐年上升［2］。從病原學和WHO立克次體研究中心證實我國至少存在3種斑點熱立克次體，而從病人分離出病原體以及從基因檢測證據(jù)表明，我國至少存在10桿菌屬的分離相一致［13］。黃體期總菌數(shù)量比卵泡期多，但差異不顯著；黃體期鏈球菌屬數(shù)量極顯著高于卵泡期，這與H.M.COWLEY［5］研究小鼠陰道總菌及鏈球菌屬數(shù)量黃體期比卵泡期少相反，這種結果的差異可能是由于試驗動物和研究方法不同導致的?；谝陨?，提示發(fā)情周期不同階段陰道菌群存在變化并與生殖激素的分泌密切相關，但具體機制尚不清楚還有待于進一步研究。

［1］李炳志.奶牛子宮內膜炎菌群分析及微生態(tài)制劑對其療效觀察［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2008.

［2］Zambrano-Nava S，Boscan-Ocando J，Nava J.Normal bacterial flora from vaginas of Criollo Limonero cows［J］.Trop Anim Health Pro，2011，43（2）：291-294.

［3］Wang Y，Ametaj B N，Ambrose D J，et al.Characterisation of the bacterial microbiota of the vagina of dairy cows and isolation of pediocin-producing Pediococcus acidilactici［J］.BMC Microbiol，2013，13：19.

［4］Lamont R F，Sobel J D，Akins R A，et al.The vaginal microbiome：new information about genital tract flora using molecular based techniques［J］.BJOG，2011，118（5）：533-549.

［5］H M COWLEY GSH.Changes in Vaginal Bacterial Flora During the Oestrous Cycle of the Mouse［J］.Microbial ecology in health and disease，1991，4：229-235.

［6］Koiter T R，Hazenberg M P，van der Schoot P.Regulation of the bacterial microflora of the vagina in cyclic female rats［J］.J Exp Zool，1977，202（1）：121-128.

［7］Santos T M，Gilbert R O，Bicalho R C.Metagenomic analysis of the uterine bacterial microbiota in healthy and metritic postpartum dairy cows［J］.J Dairy Sci，2011，94（1）：291-302.

［8］孫城濤.健康與子宮內膜炎奶牛陰道菌群結構的比較研究［D］.長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2014.

［9］Ling Z，Liu X，Chen X，et al.Diversity of cervicovaginal microbiota associated with female lower genital tract infections［J］.Microb Ecol，2011，61（3）：704-714.

［10］Malinen E，Kassinen A，Rinttila T，et al.Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria［J］.Microbiology，2003，149（Pt 1）：269-277.

［11］周麗沙，李慧，張穎，等.石油污染土壤鞘氨醇單胞菌遺傳多樣性16S rDNA-PCR-DGGE分析［J］.土壤學報，2011，（04）：804-812.

［12］Fu C J，Carter J N，Li Y，et al.Comparison of agar plate and real-time PCR on enumeration of Lactobacillus，Clostridium perfringens and total anaerobic bacteria in dog faeces［J］.Lett Appl Microbiol，2006，42（5）：490-494.

［13］Rodriguez C，Cofre J V，Sanchez M，et al.Lactobacilli isolated from vaginal vault of dairy and meat cows during progesteronic stage of estrous cycle［J］.Anaerobe，2011，17（1）：15-18.

Comparison of vaginal micro flora structureof beef cattlebetween luteal and follicular phase

LIU Chang，WANG Jun，LIU Hong-yu，LV Wen-fa
（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

In order to investigate the effect of hormones on the vaginal flora，vaginal swab samples from seven cattle were collected during the luteal and follicular phase.Total bacterial DNA was extracted for real-time PCR.Following the DGGE cloned results，five specific bacteria species were selected.The real-time PCR was used to measure the quantity of the vaginal flora between the luteal and follicular phase，respectively.The results indicated that there was no significant difference between the luteal phase and follicular phase in total bacteria species，Escherichia coli，Sphingomonas and Haemophilus somnus（P＞0.05）.However，the Streptococcus number was significantly higher in the luteal phase than that in follicular phase（P＜0.01）.Conversely，follicular phase Lactobacillus was significantly higher than that in the luteal phase（P＜0.05）.The current results suggest that beef cattle micro flora structure differs significantly during the luteal phase and the follicular phase.

beef；luteal and follicular phase；vaginal；Rea-time PCR；flora

LV Wen-fa

S814.8

A

0529-6005（2016）08-0016-02

2015-12-31

吉林省現(xiàn)代肉牛產(chǎn)業(yè)技術體系（201534）；吉林省重大科技攻關專項（20140203016NY）；吉林省發(fā)改委產(chǎn)業(yè)技術研發(fā)專項（2013779）；國家自然科學基金（31172227）

劉暢（1990-），女，碩士，從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：398950510@qq.com

呂文發(fā)，E-mail：wenfa2004@163.com