戴銀，張丹俊，沈?qū)W懷，趙瑞宏，胡曉苗，侯宏艷，潘孝成，周學(xué)利

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031）

安徽番鴨細(xì)小病毒的分離和PCR檢測(cè)

戴銀，張丹俊，沈?qū)W懷，趙瑞宏，胡曉苗，侯宏艷，潘孝成，周學(xué)利

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031）

為研究安徽省番鴨細(xì)小病毒遺傳變異狀況，通過(guò)番鴨胚接種分離了安徽流行株，并進(jìn)行PCR檢測(cè)。將擴(kuò)增基因序列AH-MDPV-1和AH-MDPV-2在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性搜索比對(duì)，結(jié)果顯示，兩者與番鴨細(xì)小病毒基因同源性均大于99%；與鵝細(xì)小病毒基因同源性分別介于79%～90%和78%～81%之間。進(jìn)一步將AH-MDPV-1與7條參比的細(xì)小病毒基因序列進(jìn)行比對(duì)，可見(jiàn)番鴨細(xì)小病毒的該部分基因相對(duì)較為保守，而與鵝細(xì)小病毒基因相應(yīng)區(qū)域具有明顯差異，表明該基因特異性較強(qiáng)，可以作為番鴨細(xì)小病毒的鑒定依據(jù)。同時(shí)可判定該病毒分離株為番鴨細(xì)小病毒。

番鴨細(xì)小病毒；病毒分離；PCR檢測(cè)

番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovlrus，MPV）引起的急性傳染病，主要侵害1-3周齡的雛番鴨，又稱(chēng)3周病。病雛番鴨常表現(xiàn)為喘氣、消瘦、拒食、軟腳和腹瀉等主要臨床癥狀，剖檢可見(jiàn)消化道及小腸部位病變。該病具有高度的傳染性，其發(fā)病率較高，死亡率可達(dá)50%～80%；且少數(shù)病愈鴨生長(zhǎng)緩慢，大多成為“僵鴨”［1-2］。番鴨細(xì)小病毒病最早由我國(guó)學(xué)者林世堂等發(fā)現(xiàn)，隨后國(guó)內(nèi)外不斷有相關(guān)的研究報(bào)道［3-6］。目前，番鴨細(xì)小病毒病已是嚴(yán)重危害番鴨養(yǎng)殖業(yè)的主要疫病，我國(guó)多地雛番鴨大量死亡，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近期安徽省部分番鴨群也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似病癥，且呈現(xiàn)暴發(fā)的趨勢(shì)，為進(jìn)一步研究番鴨細(xì)小病毒的流行發(fā)病趨勢(shì)和遺傳進(jìn)化特征，更好地防控該病，我們采集了病料，并進(jìn)行了病毒分離和PCR鑒定，以及初步的基因序列分析。

1材料與方法

1.1材料非免疫健康番鴨胚，購(gòu)自非疫區(qū)；病料來(lái)源于安徽省某養(yǎng)鴨場(chǎng)，具明顯番鴨細(xì)小病毒病癥狀的番鴨。DNA提取試劑、Taq酶、dNTP等PCR試劑，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)經(jīng)Oligo6.0軟件分析，參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的番鴨細(xì)小病毒基因序列（登錄號(hào)：KM093740），及已發(fā)表的文獻(xiàn)［7-8］，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性擴(kuò)增引物。P-1：5′-AAGAGAAAGAAAACCCGT-3′，P-2：5′-GTTGCCTCCAAAGGAGGTA-3′；P-3：5′-TGTACCCTTCTATGGCTGTG-3′，P-4：5′-TTCTCCATATCATCAATAG-3′。兩個(gè)預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為624 bp和900 bp。擴(kuò)增的目的片段分別命名為AH-MDPV-1，AH-MDPV-2。引物

由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2病毒的分離取疑似番鴨細(xì)小病毒病病料組織研磨，經(jīng)過(guò)處理制成濾過(guò)液接種12日齡番鴨胚，棄去24 h前死亡的胚胎，收集72～120 h之間死亡的胚胎尿囊液。

1.2.3基因組DNA的提取按常規(guī)方法提取總基因組DNA［8］。將尿囊液經(jīng)5 000 r/min離心10 min，取上清，分別加入10%SDS至終濃度為2%，再加蛋白酶K至50 μg/mL，充分混勻，37℃水浴2 h后，用等量飽和酚抽提1次，再用等量飽和酚-氯仿抽提2次，用等體積氯仿抽提1次，加入1/10體積3 mol/L NaAC（pH值5.2）和2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，16 000 r/min離心10 min，沉淀病毒核酸，TE（pH值8.0）溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4基因的擴(kuò)增以提取的基因組DNA為模板，分別采用P1、P2和P3、P4為上下游引物，擴(kuò)增基因AH-MDPV-1和AH-MDPV-2。PCR反應(yīng)體系：10× PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 3.0 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，加雙蒸水補(bǔ)足60 μL。按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.5基因序列分析測(cè)序后的基因序列在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比對(duì)搜索，選擇番鴨和鵝細(xì)小病毒株（goose parvovirus，GPV）共7條參比序列作為分析樣本，登錄號(hào)分別為番鴨JF926695，鵝EF515837，番鴨U22967，番鴨KC171936，X75093，鵝EU5833 92，鵝U34761。使用Clustal X 1.83軟件比對(duì)序列，采用DNAStar、MegAlign等軟件分析各序列同源性。

2結(jié)果

2.1病毒的分離從接種病料的番鴨胚中分離出1株病毒，可見(jiàn)病變胚體發(fā)育受阻，全身出血，胸和背頭部均有充、出血點(diǎn)，尤以頭部出血更為嚴(yán)重，胚體死亡時(shí)間在3～7 d。

2.2基因組DNA的提取由電泳圖可見(jiàn)，所提取的兩個(gè)樣品基因組DNA在2 000 bp上方均有明顯的DNA條帶（圖1），雖然部分條帶有部分降解拖尾現(xiàn)象，但由于PCR的高敏感性，該模版完全能夠滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.3番鴨AH-MDPV基因的擴(kuò)增以提取的基因組DNA為模板，P1、P2和P3、P4為引物PCR擴(kuò)增，分別獲得了一條約600 bp和900 bp大小的特異性DNA片段（圖2），與預(yù)期目的片段大小相符。將擴(kuò)增的基因產(chǎn)物純化、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Gen-Bank中登錄的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)。

圖1基因組DNA電泳圖

圖2AH-MDPV基因的PCR擴(kuò)增

2.4同源性分析將獲得的兩個(gè)基因序列AHMDPV-1和AH-MDPV-2分別在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性搜索比對(duì)，結(jié)果顯示，兩者與番鴨細(xì)小病毒基因同源性均大于99%；除個(gè)別鵝細(xì)小病毒基因序列外，AH-MDPV-1和AH-MDPV-2與鵝細(xì)小病毒同源性均相對(duì)較低，分別介于79%～90%和78%～81%之間。隨后從中選擇7條參比序列，與AH-MDPV-1進(jìn)行比對(duì)（圖3）。可見(jiàn)與AHMDPV-1同源性最高的是來(lái)自于國(guó)內(nèi)番鴨細(xì)小病毒株的基因序列KC171936，為99.8%，最低是鵝細(xì)小病毒株序列U34761。進(jìn)一步序列分析可見(jiàn)番鴨細(xì)小病毒的該部分基因相對(duì)較為保守，僅有個(gè)別堿基發(fā)生突變，而與鵝細(xì)小病毒相應(yīng)區(qū)域則差異顯著，表明該基因特異性較強(qiáng)，可以作為鑒定依據(jù)。因此，可判定該次分離的安徽病毒株為番鴨細(xì)小病毒。

3討論

3.1隨著番鴨養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，病毒的不斷更新變異，番鴨細(xì)小病毒已經(jīng)成為危害世界番鴨養(yǎng)殖業(yè)較為嚴(yán)重的病毒之一［9］。本研究通過(guò)非免疫健康番鴨鴨胚分離了番鴨細(xì)小病毒，并進(jìn)行PCR檢測(cè)，序列分析顯示，擴(kuò)增序列AH-MDPV-1與鵝細(xì)小病毒相應(yīng)序列差異明顯，證實(shí)為番鴨細(xì)小病毒基因組特異基因。同時(shí)可見(jiàn)AH-MDPV-1與所比較的番鴨細(xì)小病毒毒株的基因序列均大于99%，最高的是來(lái)自于國(guó)內(nèi)番鴨細(xì)小病毒毒株的基因序列KC171936。研究結(jié)果表明，安徽流行的番鴨細(xì)小病毒毒株與國(guó)內(nèi)的部分流行株同源性較高，可能來(lái)自于共同祖先，但主要毒力相關(guān)基因是否發(fā)生變異，還需要進(jìn)一步深入研究。

3.2鵝細(xì)小病毒是小鵝瘟的烈性傳染病的病原，鵝細(xì)小病毒既能感染鵝又可以感染番鴨，同樣是危害極為嚴(yán)重的疫病之一。研究結(jié)果可見(jiàn)番鴨與鵝細(xì)小病毒毒株同源性總體相對(duì)較低，基因序列同源性?xún)H介于82.1%～86.5%之間。但研究表明，鵝細(xì)小病毒與番鴨細(xì)小病毒的病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組、病理變化和臨床癥狀等方面較為相似，在實(shí)際生產(chǎn)中小鵝瘟雛鵝活疫苗和抗血清也能夠提高雛番鴨對(duì)MDPV的抵抗能力［7-8，10］。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒與細(xì)小病毒屬其他成員特征差異較大，但卻與依賴(lài)病毒屬的腺聯(lián)病毒關(guān)系密切，他們可能來(lái)源于共同的祖先，且可能是自主細(xì)小病毒與依賴(lài)細(xì)小病毒進(jìn)化的“聯(lián)接點(diǎn)”［11］。盡管鵝細(xì)小病毒與番鴨細(xì)小病毒有很多相似的特點(diǎn)，但感染的寄主卻有差異，說(shuō)明兩者在抗原特征上存在差異。血清檢測(cè)也證實(shí)番鴨細(xì)小病毒與鵝細(xì)小病毒抗原差異性很大。接下來(lái)我們將進(jìn)一步克隆獲得番鴨細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的完整基因，深入研究其遺傳學(xué)特點(diǎn)、抗原性差異及病毒致病機(jī)理為該病的預(yù)防控制奠定基礎(chǔ)。

圖3基因序列分析

［1］謝麗基，謝芝勛，劉加波，等.番鴨細(xì)小病毒熒光定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（3）：218-221.

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Separation and PCR Detections of Muscovy Duck Parvovirus in Anhui

DAI Yin，ZHANG Dan-jun，SHEN Xue-huai，ZHAO Rui-hong，HU Xiao-miao，HOU Hong-yan，PAN Xiao-cheng，ZHOU Xue-li
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei 230031，China）

To investigate the variation status of muscovy duck parvovirus in Anhui province，the Anhui epidemic strain was isolated from the muscovy duck embryo，and then was identified by PCR sequence analysis.The sequence similarity of AH-MDPV-1 and AH-MDPV-2 genes were analyzed，and the gene homology between Anhui strain and the other Muscovy duck parvoviruses all were 99%.However，the homology between both genes and genes of goose parvovirus ranged from 79%to 90%and from 78%to 81%，respectively.Alignment of AH-MDPV-1 and 7 gene sequences from NCBI database，the genes of Muscovy duck parvoviruses were relatively conservative，but obvious difference was observed between Muscovy duck parvoviruses and goose parvoviruses. The result indicated that AH-MDPV-1 was the specific gene of Muscovy duck parvovirus，and could be used for gene identification.

Muscovy duck parvovirus；Separation；PCR for detection

ZHANG Dan-jun

S852.65+9.2

A

0529-6005（2016）08-0035-03

2015-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31302044）；國(guó)家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-41）；安徽省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)肉禽產(chǎn)業(yè)發(fā)展資金項(xiàng)目和院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（11C0404）資助

戴銀（1980-），女，助理研究員，博士，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究，E-mail：daiyin2020@163.com

張丹俊，E-mail：zhangdj694@sina.com