劉小花, 侯作賢, 張夢婷, 王　影, 封士蘭

(1. 蘭州大學 藥學院, 甘肅 蘭州　730000；2. 蘭州大學 資產(chǎn)與實驗室管理處, 甘肅 蘭州　730000)

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中藥制劑分析課的體驗式教學改革研究與實踐

劉小花1, 侯作賢2, 張夢婷1, 王影1, 封士蘭1

(1. 蘭州大學 藥學院, 甘肅 蘭州730000；2. 蘭州大學 資產(chǎn)與實驗室管理處, 甘肅 蘭州730000)

將體驗式教學應用于中藥制劑分析課程,以培養(yǎng)學生的動手能力、實驗設計能力及理論與實踐的結(jié)合能力為目的,讓學生有機會對先進的大型儀器進行體驗式上機操作。具體實施是以甘肅道地藥材“黃芪”為研究對象,建立其多種指標成分含量測定的方法,讓研究生和本科生獨立完成實驗,以此促進學生學習的積極性和主動性,真正實現(xiàn)教學與科研的充分結(jié)合,達到以教學促進科研、以科研提升教學的目的。

中藥制劑分析； 超高效液相色譜； 體驗式教學

體驗式教學[1-4]是培養(yǎng)學生使之具有獨立、自主和創(chuàng)新精神,以學生的自我體驗為主要學習方式,力求在師生互動和學生親身體驗的過程中達到認知與體驗過程的有機結(jié)合的一種教學方法。與傳統(tǒng)的教學模式相比較,體驗式教學以學生為主體,注重感覺體驗,鼓勵學生自我探索。體驗式教學是適應當代大學生需求的教學方式。 體驗式教學的價值和意義不僅提供了一種教學方法,更重要的是提供了一種有助于學生主體開展思考的教學理念[2]。體驗式教學有4種模式:情境體驗、案例體驗、實踐體驗和拓展活動體驗[4]。

高效液相色譜技術(shù)是中藥制劑分析中最常用也是最先進的現(xiàn)代分析手段,是教師必須講授和學生必須要掌握的內(nèi)容。前期蘭州大學藥學院實驗中心推進本科生綜合實驗和設計性實驗改革[5-7],取得了不錯的成績,積累了一定經(jīng)驗。本項目要求學生查閱大量的關于黃芪藥材含量測定方法的文獻[8-13],要求學生盡可能選擇多種實驗方案,通過對樣品處理方法的選擇和色譜測定條件的優(yōu)化,用對照品進行比對,建立UPLC(超高效液相色譜)法測定黃芪中多種指標成分含量的實驗方法,并與HPLC(高效液相色譜)法測定其含量[7]進行比較,尋找出UPLC的優(yōu)勢。通過此項目的建立使學生掌握超高效液相色譜儀的使用和維護,了解藥物分析及中藥制劑分析的一般流程,激發(fā)學生實踐學習的積極性,有利于培養(yǎng)學生的動手能力、儀器的使用與操作,以及綜合思維與創(chuàng)新能力。

1　實驗

1.1儀器與試劑

儀器:超高效液相色譜儀(Waters ACQUITYTM UPLC),KQ3200DB超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司),電熱恒溫水浴鍋(上海恒一),分析天平(BS224S型,十萬分之一,德國Sartorius賽多利斯)。

試劑:乙腈,色譜純,德國默克公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

黃芪藥材:自采或購買(見表1),經(jīng)蘭州大學藥學院生藥學研究所馬志剛教授鑒定為蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fish.) Bge. Var. mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根。

對照品:毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素均購自中國食品藥品檢定研究院。

表1　黃芪藥材來源與品種

1.2黃芪藥材提取物制備

稱取黃芪藥材2 g,用10倍量的95%乙醇回流提取,共提取3次,每次1 h,合并提取液,將提取液蒸發(fā)濃縮,得黃芪提取物濃縮液,置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3標準溶液配制

分別取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、金雀異黃酮標準品適量,用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.100、0.130、0.116、0.103、0.157 mg·mL-1的對照品溶液,置于4 ℃冰箱冷藏備用

1.4色譜條件

Fluoro-Phenyl 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)；流動相為乙腈和超純水,梯度洗脫,洗脫程序見表2；進樣量2 μL；柱溫25 ℃；檢測波長254 nm。

表2　梯度洗脫條件

2　實驗結(jié)果與討論

2.1色譜條件選擇

經(jīng)查閱文獻[11-13],確定了最佳色譜條件:流動相組成為乙腈和水,洗脫方式為梯度洗脫,流速為0.3 mL·min-1。該色譜方法使所得的色譜峰窄,峰形較好,且使得各分析物得到了很好的分離。

2.2方法學考察

2.2.1線性關系

分別取“1.3”項下對照品儲備液,以及毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素,均以進樣量(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果表明這5種化合物的回歸方程均呈良好的線性關系,見表3。

表3　4種化合物在生物樣品中的標準曲線和相關系數(shù)

2.2.2 精密度實驗

取對照品溶液測定日內(nèi)精密度和日間精密度。同一對照品溶液在同一天內(nèi)連續(xù)進樣6次,每次進樣5 μL,計算日內(nèi)精密度,5個黃酮類化合物的RSD見表4。

同一對照品溶液連續(xù)3天每天進樣2次,計算日間精密度,5個黃酮類化合物的RSD見表4。

日內(nèi)和日間精密度的RSD<2%,符合規(guī)定。

2.2.3重復性實驗

取1號黃芪藥材(來自于臨夏地區(qū))6份,每份2 g,精密稱定,制備成供試品溶液,按照樣品測定方法測定。測得5個黃酮類化合物的平均含量和RSD,結(jié)果見表4。5種化合物重復性試驗的RSD<2%,符合規(guī)定。

表4　5個黃酮類化合物的精密度和重復性實驗結(jié)果

2. 2.4準確度實驗

以加樣回收率考察準確度。取同一批已知含量的1號黃芪藥材(來自于臨夏地區(qū))5份,每份2 g,精密稱定,各加入適量的各種對照品溶液(毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的質(zhì)量濃度分別為0.100、0.130、0.116、0.103、0.157 mg·mL-1),按照供試品溶液制備中的操作測定,計算5個化合物的加樣回收率,結(jié)果見表5。5個黃酮類成分平均回收率在96.86%～101.09%,RSD<2%,符合規(guī)定。

表5　加樣回收率試驗結(jié)果(n=5)

表5(續(xù))

2.3樣品測定

取6批黃芪藥材,制備成樣品溶液,精密吸取2 μL進入UPLC儀進行分析,含量測定結(jié)果見表6,色譜圖見圖1、圖2。

表6　黃芪藥材中5種黃酮類成分的含量

由圖1、圖2可知,通過與對照品比對,鑒別出黃芪藥材提取物的UPLC色圖譜中5個色譜峰的結(jié)構(gòu),F1—F5號峰對應的化合物分別為毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素,其保留時間分別為1.912、3.484、4.018、4.703、5.569 min。

3　結(jié)果與討論

3.1提取效能評價

該實驗要求學生查閱中藥中常用的幾種樣品處理方法的操作和使用,使學生熟悉回流提取、超聲提取和索氏提取法等樣品提取方法,并采用不同溶劑進行提取；實驗結(jié)果顯示,選用95%乙醇作為溶劑對6批來自不同產(chǎn)地的黃芪藥材進行回流提取,5個黃酮類成分在該提取條件下得到的提取率高、提取時間短、操作簡單,適合于學生實驗。

圖1　6批黃芪藥材提取物UPLC-DAD 色譜圖(254 nm)

圖2　黃芪藥材與5個對照品UPLC-DAD 色譜圖(254 nm)

3.2檢測系統(tǒng)評價

采用UPLC法對6批來自不同產(chǎn)地的黃芪藥材進行黃酮類成分的含量測定,測得各對照品的最大吸收波長如下:毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷為258.1 nm,芒柄花苷為249.8 nm,毛蕊異黃酮為248.7 nm,金雀異黃酮為259.3 nm,芒柄花素為248.7 nm。本實驗選取254 nm為檢測波長,對這5個黃酮類成分進行分析,其結(jié)果準確、重復性好。說明將UPLC法應用于黃芪藥材中黃酮類成分的質(zhì)量控制中效果好。

3.3含量測定分析

用UPLC法測定黃芪藥材內(nèi)5種黃酮類成分含量大小的順序為:毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷>毛蕊異黃酮>芒柄花苷>芒柄花素>金雀異黃酮,其結(jié)果與用HPLC法測定的順序一致。6批藥材中的金雀異黃酮含量均少于2 μg·g-1,而以往的研究使用HPLC法測定黃芪藥材中成分的含量,由于HPLC法靈敏度低,金雀異黃酮的峰形不易被發(fā)現(xiàn),這也解釋了為何至今未見金雀異黃酮在黃芪藥材中報道的現(xiàn)象。

從表6中可發(fā)現(xiàn),即使是同一對照品在6批不同的黃芪藥材中的含量也會有較大的差異,這可能與黃芪的生長環(huán)境、生長年限以及儲藏時間等因素有關。

3.4UPLC與HPLC比較

與HPLC比較,UPLC法分析時間更短、靈敏度更高。同時測定黃芪中5種黃酮類成分,UPLC法完成一次樣品運行時間只需8 min,而HPLC法需要45 min。使用UPLC法的流速為0.3 mL·min-1,而HPLC的流速為1 mL·min-1,結(jié)果比較得出,UPLC法使用的溶劑更少,該方法更綠色和環(huán)保。

4　結(jié)語

在教學實施過程中,學生在傾聽、動口、動手等溝通討論研究的過程中,又各自分享了不同的親歷感受,這種經(jīng)驗的分享有助于學生對事物認識的深化,也有助于學生立場與觀點的重新定位與補充。對教師而言,讓整個的課堂活動成為學生自己的事情,讓他們自己去查閱相關資料、小組成員共同設計方案,由指導教師修訂方案,最后由學生獨立完成。學生通過對比、換位、揣摩、嘗試,去體會、感受,讓他們自己去交流,去總結(jié),去運用。這種建立在充分自主活動基礎上的學習,能夠極大地調(diào)動學生已有的知識背景,在活動中形成新的知識體驗,并最終產(chǎn)生學習的“意義”。

通過對本項目的實施,使學生掌握超高效液相色譜儀的理論知識和實踐運用。通過回流提取、超聲提取和索氏提取法進行比較,使學生熟悉中藥制劑分析提取的幾種樣品處理方法的操作和使用。建立多種指標成分含量測定的方法學考察實驗,包括色譜條件選擇、線性關系、穩(wěn)定性考察、精密度試驗、重復性試驗、準確度試驗、樣品測定,可以使學生了解中藥制劑分析的一般流程,同時掌握UPLC法和HPLC測定中藥中指標成分的方法以及它們的差異。

通過該體驗式教學,給學生提供最大的自由空間,提高了學生的創(chuàng)新能力,使他們能夠充分發(fā)揮自身的實踐能力,學習和使用現(xiàn)代技術(shù)手段、了解和應用當前新技術(shù),牢固掌握所學的理論知識。

References)

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Research and practice on experimential teaching reform for Pharmacy Analysis of Traditional Chinese Medicine course

Liu Xiaohua1, Hou Zuoxian2, Zhang Mengtin1, Wang Ying1, Feng Shilan1

(1. School of Pharmacy,Lanzhou University, Lanzhou 730000, China;2. Department of Assets and Laboratory Management, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

In order to cultivate students' practical ability, experimental design ability and combination ability of theory and practice, and enable the students to have the opportunity to experience the operation of the advanced large-scale instruments on their own, the experiential teaching is applied to Pharmacy Analysis of Traditional Chinese Medicine course. Taking Radix Astragaliis as the research object, a method of determining the content of multi-index constituents by UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography) is adopted. Undergraduate and graduate students are encouraged to complete the experiment independently, and their enthusiasm and initiative in using the large-scale instruments are promoted.The combination of teaching with research is well completed, the research and teaching are stimulated, and the purpose for promoting research by teaching and stimulating teaching by research is realized.

Pharmacy Analysis of Traditional Chinese Medicine; UPLC; experimental type teaching

10.16791/j.cnki.sjg.2016.10.050

2016-04-13修改日期：2016-05-26

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(lzujbky-2015-59)；蘭州大學2016年教學改革項目；蘭州大學2016年實驗技術(shù)創(chuàng)新基金項目

劉小花(1976—),女,甘肅蘭州,博士,高級實驗師,研究藥物分析學.E-mail：liuxiaoh@lzu.edu.cn

R917

A

1002-4956(2016)10-0199-05