張樹琛　王　杉　朱鳳霞　時(shí)琰麗　李　東　魯炳懷

(民航總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100123)

?

· 臨床研究 ·

B群鏈球菌顯色培養(yǎng)基在孕產(chǎn)婦B群鏈球菌篩查中的性能評(píng)價(jià)

張樹琛王杉朱鳳霞時(shí)琰麗李東魯炳懷*

(民航總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100123)

目的評(píng)價(jià)B群鏈球菌(groupBstreptococcus, GBS)顯色培養(yǎng)基在孕產(chǎn)婦中篩查GBS的敏感性、特異性和選擇性能。方法收集孕產(chǎn)婦肛門/陰道拭子標(biāo)本共312例，已知菌株標(biāo)本9例，分別直接接種或增菌后接種于血平皿和GBS顯色培養(yǎng)基，記錄鑒定結(jié)果。以篩查出的GBS總陽(yáng)性數(shù)為參考，分別比較直接接種和增菌接種時(shí)，顯色培養(yǎng)基篩查GBS的敏感性和特異性。結(jié)果顯色培養(yǎng)基對(duì)GBS的檢出率、敏感性和特異性優(yōu)于常規(guī)血平皿。標(biāo)本增菌后接種法孵育24 h得到的陽(yáng)性率為7.05%(22/312)高于直接接種法(6.41%，20/312)，對(duì)GBS篩查的敏感性高于直接接種法(95.65%vs86.96%)，特異性一致(99.65%)。結(jié)論顯色培養(yǎng)基對(duì)GBS有良好的檢出率，判斷方法直觀簡(jiǎn)便，對(duì)非目標(biāo)菌群有良好的抑制作用。

B群鏈球菌；顯色培養(yǎng)基；孕產(chǎn)婦

無(wú)乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)又稱B群鏈球菌 (groupBstreptococcus, GBS)，是一種條件致病菌，孕婦感染后可造成菌血癥、無(wú)癥狀菌尿癥、羊膜炎及傷口感染等，在新生兒人群可引起肺炎、敗血癥與腦膜炎等[1-2]。該菌可定植于10%～30%女性的陰道和腸道，無(wú)臨床癥狀，這類女性分娩的新生兒感染該菌的風(fēng)險(xiǎn)概率較高[3]。一般而言，如果母體產(chǎn)道存在GBS，新生兒將會(huì)有50.0%的概率攜帶GBS，其中有2%會(huì)出現(xiàn)新生兒感染。因此在孕婦生殖道中準(zhǔn)確可靠的篩查出GBS，并在分娩前給予有效抗生素，是預(yù)防侵襲性新生兒GBS感染的關(guān)鍵。GBS顯色培養(yǎng)基(chromogenic medium chromID Strepto B agar，STRB)是一種選擇性顯色培養(yǎng)基，GBS代謝產(chǎn)物作用于培養(yǎng)基，呈特征性淺粉色-紅色菌落，可有效篩查出GBS[4]。本研究擬通過比較STRB與傳統(tǒng)血平皿(blood agar plate，BAP)鑒定GBS的檢出效果，以便為快速準(zhǔn)確鑒定GBS提供參考。

1　材料和方法

1.1樣本制備

收集2013年4月～2013年7月期間民航總醫(yī)院產(chǎn)科門診的312例孕婦樣本，包括肛門/陰道標(biāo)本303例，以及已知GBS菌株9例。將拭子樣本在2 mL無(wú)菌0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中混勻制備混懸液。已知菌株在BAP上(35±2)℃有氧條件下孵育18～24 h后挑取單克隆菌落在0.5 mL的無(wú)菌0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中混勻制備混懸液。

1.2儀器與試劑

BAP(批號(hào): 43041-86)和STRB(批號(hào): 43461-86)由梅里埃(上海)生物制品有限公司提供，GBS選擇性增菌肉湯(批號(hào): 42116)為Todd-Hewitt肉湯(由Oxoid公司提供)，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌鑒定卡(批號(hào): 21342)和全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(VITEK 2)購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

1.3質(zhì)控菌株

用GBS增菌肉湯預(yù)培養(yǎng)GBSNCTC8190和大腸桿菌ATCC?25922，STRB預(yù)培養(yǎng)GBS NCTC8190、大腸桿菌ATCC?25922、金黃色葡萄球菌ATCC?6538和白色念珠菌ATCC?10231，分別觀察其生長(zhǎng)情況。

1.4檢測(cè)方法與結(jié)果鑒定

1.4.1直接接種

吸取50 μL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液混懸液分別4區(qū)劃線接種于BAP和STRB，于(35±2)℃有氧避光條件下孵育18～24 h。BAP上可疑菌落用革蘭染色和觸酶試驗(yàn)進(jìn)行初步鑒定是否為GBS，對(duì)革蘭染色陽(yáng)性和觸酶陰性的菌落用VITEK 2儀器鑒定。STRB直接選取GBS淺粉到紅色典型菌落，用VITEK 2鑒定儀與CAMP試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。如果為陰性繼續(xù)孵育到48 h用同樣方法鑒定。

1.4.2增菌后接種

吸取50 μL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液混懸液于GBS增菌肉湯中增菌，(35±2)℃有氧條件下培養(yǎng)18～24 h，若肉湯渾濁，分別吸取50 μL的GBS增菌肉湯4區(qū)劃線接種至BAP和STRB，于(35±2)℃有氧避光條件下培養(yǎng)；若肉湯澄清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取50 μL的GBS增菌肉湯，轉(zhuǎn)種方法同上。鑒定方法同本文1.4.1節(jié)所述。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用例(百分?jǐn)?shù))表示，組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)(理論頻數(shù)T<1時(shí)采用Fisher’s精確檢驗(yàn))，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

通過在BAP和STRB上直接接種或增菌后接種，已知9例GBS菌株全部檢出，檢出率為100%。孕產(chǎn)婦標(biāo)本共篩查出24例GBS，陽(yáng)性率為7.69%(24/312)。STRB上培養(yǎng)出的典型GBS為圓形、透亮的淺粉色到紅色的菌落(圖1A與B)，培養(yǎng)24 h后菌落約2～3 mm，培養(yǎng)48 h后菌落顏色為深紅到紫色。非GBS的菌落呈現(xiàn)出藍(lán)色或灰色(圖1C與D)。

分析結(jié)果表明，樣本經(jīng)直接接種法培養(yǎng)24 h后，BAP和STRB篩查GBS的陽(yáng)性率均為6.41%(20/312)，增菌接種法培養(yǎng)24 h后，BAP和STRB篩查GBS的陽(yáng)性率均為7.05%(22/312)，培養(yǎng)48 h后，陽(yáng)性率為7.37%(23/312)。增菌接種法BAP和STRB篩查GBS的敏感性為95.65%，高于直接接種法(86.96%)、特異性均為99.65%(表1)。直接接種法和增菌接種法對(duì)于GBS的篩查陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=265.015，P<0.05)。

經(jīng)直接接種和增菌后接種后的樣本中大部分非目標(biāo)菌群在STRB上得到了良好抑制，直接接種法孵育時(shí)間24 h，有61.1%的臨床標(biāo)本沒有非目標(biāo)菌群生長(zhǎng)，延長(zhǎng)孵育時(shí)間至48 h，60%的臨床標(biāo)本無(wú)非目標(biāo)菌群生長(zhǎng)。增菌接種法在孵育24 h和48 h后，也分別有43.5%和39.2%的標(biāo)本中非目標(biāo)菌群被完全抑制(表2)。行乘列表顯示孵育24 h后，直接接種法和增菌接種法的非目標(biāo)菌群生長(zhǎng)密度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.471，P<0.05)；孵育48 h后，直接接種法和增菌接種法的非目標(biāo)菌群生長(zhǎng)密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.714，P<0.05)。

圖1　STRB中GBS菌落和非GBS菌落

A: typicalgroupBstreptococcus(GBS) colonies after 24 h (pink to red); B: GBS colonies after 48 h (deep red); C:streptococcusgallolyticussubsp. pasteurianus colonies (blue); D:enterococcusfaecalis(blue).

表1　直接接種和增菌接種法BAP與STRB比較

表2　直接接種和增菌接種法STRB選擇性能比較

3　討論

早在20世紀(jì)30年代早期就有研究[5]用血清學(xué)方法鑒定出了GBS。最初，并未認(rèn)為這些微生物能夠引起人類傳染，而相信它只是牛乳腺炎的主要病原體。但是1938年報(bào)告了由GBS引起的嚴(yán)重人類感染[6]，其后逐漸認(rèn)清了該菌為人類的重要病原菌[7]。GBS為兼性厭氧的革蘭陽(yáng)性鏈球菌，有莢膜，在血平皿上可以產(chǎn)生典型β溶血環(huán)，也有少量菌株不溶血(4.0%～8.0%)。大多數(shù)菌株可以抵抗桿菌肽，環(huán)磷酸腺苷試驗(yàn)陽(yáng)性，馬尿酸鹽試驗(yàn)陽(yáng)性[8]。Dunne等[9]認(rèn)為GBS是新生兒感染的重要致病菌之一，在孕婦中能夠可靠的篩查鑒定出GBS是預(yù)防侵襲性新生兒感染的關(guān)鍵。

目前臨床上多采用傳統(tǒng)常規(guī)的CAMP法來(lái)檢測(cè)GBS，這雖然是一種特異性診斷試驗(yàn)，但試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，操作步驟繁瑣，容易受到部分β-溶血鏈球菌(如假豕鏈球菌等)干擾，還有其他很多因素影響[10]。STRB是一種選擇性顯色培養(yǎng)基，由不同種類的蛋白胨、3種顯色底物和抗生素組成。這些成分能夠通過培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出典型淺粉色-紅色菌落來(lái)篩查GBS，而多種細(xì)菌和酵母菌多數(shù)不在這種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，或不產(chǎn)生典型菌落。本研究中首先比較了它與傳統(tǒng)血平皿的篩查方法，檢出率與敏感性特異性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在此基礎(chǔ)上通過Todd-Hewitt肉湯增菌后接種，GBS的檢出率要高于直接接種法(7.05 %vs6.41%)。這可能是因?yàn)門odd-Hewitt肉湯中加入了萘啶酸和多黏菌素B，抑制了陰性桿菌(如大腸埃希菌)的生長(zhǎng)等，但是腸球菌不能完全被肉湯抑制，在顯色培養(yǎng)基上會(huì)呈現(xiàn)出灰-藍(lán)色菌落，與GBS的典型粉紅色菌落不同。在增菌后孵育48 h對(duì)GBS的檢出率也要高于24 h(7.37%vs7.05%)。增菌后接種以及增加培養(yǎng)時(shí)間，檢出率均有所提高，與此同時(shí)對(duì)非目標(biāo)菌群的完全抑制率也會(huì)有所下降(表3)，非目標(biāo)菌群的表型集中表現(xiàn)在藍(lán)色，藍(lán)-灰，藍(lán)-紫和淡綠色等菌落?？傮w而言，STRB對(duì)40%以上的樣本都可以完全抑制非目標(biāo)菌群的生長(zhǎng)，選擇性能較好，使結(jié)果易于判斷。GBS顯色培養(yǎng)基與傳統(tǒng)方法相比，檢出率并沒有降低，還通過培養(yǎng)顯色省去了GBS鑒定步驟，操作簡(jiǎn)便，節(jié)約了培養(yǎng)時(shí)間，增菌延時(shí)培養(yǎng)后檢出率提高，適于在工作中進(jìn)行推廣。

國(guó)內(nèi)對(duì)孕產(chǎn)婦人群生殖道/直腸定植GBS的情況研究報(bào)道較少，所報(bào)道的感染率低于歐美國(guó)家與非洲國(guó)家孕產(chǎn)婦定植率，但與其他一些東亞國(guó)家數(shù)據(jù)相近，如日本，8.2%；韓國(guó)，8.0%；菲律賓，7.5%[11]。孕晚期婦女生殖道/直腸GBS定植率差異較大，可能是因?yàn)槠涠ㄖ才c種族、地區(qū)差異、飲食情況不同有關(guān)。GBS定植率檢出與多種因素有關(guān)，如臨床重視程度及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平。近年來(lái)，在免疫力低下的成年人中GBS也呈上升趨勢(shì)，特別是老年人或有嚴(yán)重潛在疾病感染者[12]；同時(shí)，GBS的檢出率受到多種因素的影響，例如取材部位、檢查時(shí)間、檢測(cè)方法等，應(yīng)盡量減少GBS感染對(duì)母嬰造成的危害[13-15]。所以，我們必須加強(qiáng)臨床對(duì)GBS的培養(yǎng)檢測(cè)。

綜上所述，STRB對(duì)于臨床肛門/陰道標(biāo)本的GBS有良好的檢出率，對(duì)非目標(biāo)菌群有良好的抑制作用。對(duì)GBS的篩查使用Todd-Hewitt肉湯增菌后培養(yǎng)可以減少漏檢率。

[1]Craven R R, Weber C J, Jennemann R A et al. Evaluation of a chromogenic agar for detection of group B Streptococcus in pregnant women[J]. J Clin Microbiol,2010, 48(9):3370-3371.

[2]鮑蘇青，劉小媚，王青. 孕婦生殖道B族鏈球菌感染對(duì)母嬰預(yù)后影響的臨床研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2015,(2): 430-432.

[3]Academy of American Pediatrics. Committee on infectious diseases and committee on fetus and newborn, revised guidelines for prevention of early-onset group B Streptococcal (GBS) infection [J]. Pediatrics, 1997, 99(3):489-496.

[4]Poisson D M, Evrard M L, Freneaux C, et al. Evaluation of CHROMagarTM StrepB agar, an aerobic chromogenic medium for prepartum vaginal-rectal group B Streptococcus screening[J]. J Microbiol Methods, 2011,84(3): 490-491.

[5]Boyer K M, Gadzala C A, Kelly P D, et al. Selective intrapartun chemo prophylaxis of neonatal group B strep tococcal early onset disease Ⅱ. Predictive value of prenatal cultures[J]. J Infect Dis, 1983, 148(5):802-809.

[6]沈定樹，周雪燕. 無(wú)乳鏈球菌的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)微生物學(xué)雜志，2008,10(5)：518-520.

[7]段清. B族溶血性鏈球菌感染與妊娠[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志，2008，37(3)：470-473.

[8]曲頁(yè)敏，馬淑青，李彬彬. 圍產(chǎn)期B族鏈球菌感染及預(yù)防的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2014，26(11)：1356-1358.

[9]Dunne Jr WM. Comparison of selective broth medium plus neomycin-nalidixic acid agar and selective broth medium plus Columbia colistin-nalidixic acid agar for detection of group B streptococcal colonization in women[J]. J Clin Microbiol，1999，37(11): 3705-3706.

[10]張麗琴，肖長(zhǎng)久，李世云. 陰道分泌物的細(xì)菌分離鑒定及耐藥性分析[J]. 實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，30(4)：389-391.

[11]Ippolito D L, James W A, Tinnemore D, et al. Group B streptococcus serotype prevalence in reproductive-age women at a tertiary care military medical center relative to global serotype distribution[J]. BMC Infect Dis, 2010, 10: 336.

[12]Tazi A, Réglier-Poupet H, Dautezac F, et al. Comparative evaluation of Strepto B ID chromogenic medium and Granada media for the detection of group B Streptococcus from vaginal samples of pregnant women[J]. J Microbiol Methods, 2008; 73(3):263-265.

[13]Koenig J M, Keenan W J. Group B streptococcus and early-onset sepsis in the era of maternal prophylaxis[J]. Pediatr Clin North Am,2009,56(3):689-708.

[14]Verani J R, McGee L, Schrag S J. Division of bacterial diseases, national center for immunization and respiratory diseases, centers for disease control and prevention (CDC)[J]. MMWR Recomm Rep, 2010,59(RR-10):1-36.

[15]王艷海. 正常生育期婦女宮頸、陰道分泌物和血清中的CA125表達(dá)[J]. 中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2013,16(1):11-13.

編輯慕萌

， E-mail：zs25041@126.com

Evaluation of the performance of chromogenic agar in the screening group B streptococcus from pregnant women

Zhang Shuchen, Wang Shan, Zhu Fengxia, Shi Yanli, Li Dong, Lu Binghuai*

(DepartmentofLaboratoryMedicine,CivilAviationGeneralHospital,Beijing100123,China)

ObjectiveTo evaluate the sensitivity, specificity and selective capability of chromogenic agar in the screeninggroupBstreptococcus(GBS) in the pregnant women. MethodsA total of 312 rectum/vaginal swabs, collected from pregnant women, as well as 9 known GBS strains, were inoculated on the blood agar plates (BAP) and chromogenic medium chromID Strepto B agar (STRB) directly and after the selective enrichment, respectively. The screening results of the above-mentioned methods were compared. ResultsThe STRB showed the excellent performance for GBS detection and outperformed BAP. The selective enrichment is an essential step to screen the GBS isolates due to its higher sensitivity(95.65%vs86.96%)while both methods have the similar specificity. ConclusionSTRB demonstrated good detection rate of GBS for its direct identification and effective inhibition of non-targeted bacteria.

groupBstreptococcus; chromogenic agar; pregnant women

北京市科委首都臨床特色應(yīng)用研究(Z141107002514036)。This study was supported by Beijing Municipal Science &Technology Commission of China (Z141107002514036).

時(shí)間：2016-10-1610∶55

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1055.016.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.023]

R 446.5

2016-03-03)