張 莉 張 磊 侯 丹 張素芳 張含國

(林木遺傳育種國家重點實驗室東北林業(yè)大學，哈爾濱 150040)

雜種落葉松(興10×日13)再生體系的建立及優(yōu)化

張 莉 張 磊 侯 丹 張素芳 張含國*

(林木遺傳育種國家重點實驗室東北林業(yè)大學，哈爾濱 150040)

以雜種落葉松(興10×日13)成熟合子胚為外植體，通過不同培養(yǎng)基與激素的組合進行實驗，最終形成完整落葉松植株，根據(jù)試驗結(jié)果建立并優(yōu)化了雜種落葉松成熟合子胚誘導植株再生的體系。結(jié)果表明：BM培養(yǎng)基有利于雜種落葉松不定芽的誘導，誘導率達60.7%，且在BM+1.5 mg·L-1TDZ條件下誘導率最高且為67.73%；BM培養(yǎng)基能促進不定芽增殖，增殖系數(shù)達4.48，且在BM+1.0 mg·L-1TDZ條件下增殖系數(shù)最高且為5.23；不定芽在1/2BM+0.5 mg·L-1TDZ伸長比率最高且為205.72%，同時，在1/2BM培養(yǎng)基中添加2 g·L-1的活性炭也能促進伸長；當不定芽在BM+0.05 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA的條件下培養(yǎng)時，抽莖率最高，為73.96%；不定芽在1/2BM+0.5 mg·L-1IBA+1.0 mg·L-1NAA條件下誘導生根的生根率最高，為29.85%。

雜種落葉松；成熟合子胚；不定芽；組織培養(yǎng)

落葉松(Larch)為松科(Pinaceae)落葉松屬(Pinus)的落葉喬木，是我國東北、內(nèi)蒙古林區(qū)以及華北、西南的高山針葉林的主要森林組成樹種，是東北地區(qū)主要三大針葉用材林樹種之一，以速生、抗逆性強著稱，其木材重而堅實，抗壓及抗彎曲的強度大，而且耐腐朽，木材工藝價值較高，因此被大量用于建筑業(yè)、裝潢業(yè)、造紙業(yè)[1]。同時，由于落葉松樹勢高大挺拔，冠形美觀，根系十分發(fā)達，抗煙能力強。所以，又是一個優(yōu)良的園林綠化樹種。雜種落葉松興10×日13(L.gmelinii10×L.kaempferi13)是落葉松屬中一個非常重要的速生樹種，一般具有雙親的優(yōu)良特征。

通過常規(guī)育種技術進行新品種選育存在時間長、見效慢，后代性狀不能夠定向改良等局限性。通過轉(zhuǎn)基因方法將目的基因直接導入受體系統(tǒng)并進行表達，可極大地縮短其育種周期，而建立高效的再生體系是轉(zhuǎn)基因育種的前提條件之一。吳克賢等用長白落葉松的成熟胚、花芽和腋芽、幼嫩莖段作為外植體誘導出不定芽，但不定芽誘導分化率均較低，最高只有8.16%[2]。王偉達等用長白落葉松的成熟胚為外植體也誘導出不定芽，但是誘導率都不是太高，再加上繼代過程中部分死亡最終難以應用于實際生產(chǎn)與實踐[3]。目前在國內(nèi)雜種落葉松遺傳轉(zhuǎn)化的研究報道甚少，通過轉(zhuǎn)基因育種的方法對選育的優(yōu)良雜種落葉松進行性狀的定向改良可以獲得具有多個優(yōu)良目標性狀的新品系，所以雜種落葉松再生體系的建立及優(yōu)化可以為后期的研究奠定良好的基礎。

本文以雜種落葉松成熟合子胚為外植體，通過調(diào)節(jié)誘導愈傷組織[4]，然后誘導不定芽及其繼續(xù)增殖，抽莖生根形成完整植株的基本培養(yǎng)基和激素配比，主要分析了不定芽誘導、增殖，抽莖、生根的體系的影響及不定芽伸長階段激素配比與活性炭的作用，確定并獲得較高分化率的不定芽，進而得到能夠移栽到土壤中成活的生根組培苗的擴繁體系，對于雜種落葉松的的無性繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化研究具有廣泛的應用意義。

1 試驗材料與方法

以采自黑龍江省牡丹江市林口縣青山種子園的雜種落葉松(興10×日13)成熟種子胚作為試驗材料。

1.1 不定芽的誘導

1.1.1 基本培養(yǎng)基的篩選

不定芽誘導選用1/2MS、MS、1/2BM和BM四種培養(yǎng)基，分別添加TDZ 1.5 mg·L-1，各培養(yǎng)基上接3～5個外植體，且重復6～7次。3～4周統(tǒng)計并計算不定芽的誘導率。

1.1.2 激素組合及濃度的篩選

BM培養(yǎng)基上分別添加TDZ為1.0、1.5、2.0 mg·L-1，NAA為0、0.1、0.2 mg·L-1，共9個組合。每個組合上接種30個不定芽，并重復3次(以下同)，3～4周統(tǒng)計并計算不定芽的誘導率。

1.2 不定芽的增殖

1.2.1 基本培養(yǎng)基的篩選

不定芽增殖選用1/2MS、MS、1/2BM和BM四種基本培養(yǎng)基，分別添加TDZ 1.0 mg·L-1，20 d后統(tǒng)計并計算不定芽的增殖系數(shù)。

1.2.2不同濃度的6-BA+NAA及TDZ+NAA組合的篩選

BM培養(yǎng)基上，分別添加6-BA為0.5、0.8、1.0 mg·L-1，NAA為0、0.05、0.1 mg·L-1，共9個組合；分別添加TDZ為0.5、1.0、1.5 mg·L-1，NAA為0、0.05、0.1 mg·L-1，共9個組合。20 d后統(tǒng)計并計算不定芽的增殖系數(shù)。

1.3 不定芽的伸長

1.3.1 不同濃度的TDZ與NAA組合的篩選

1/2BM培養(yǎng)基上，分別添加TDZ為0.1、0.5、1.0 mg·L-1，NAA為0、0.02、0.04 mg·L-1，共9個組合。30 d后用游標卡尺測量、統(tǒng)計并計算不定芽的伸長比率。

1.3.2 不同濃度活性炭的篩選

1/2BM培養(yǎng)基上，設置TDZ為0.5 mg·L-1，分別添加活性炭0、1、2、3、4 g·L-1。30 d后用游標卡尺測量、統(tǒng)計并計算不定芽的伸長比率。

1.4 不定芽的抽莖

1.4.1 基本培養(yǎng)基的篩選

在雜種落葉松不定芽抽莖過程中分別以BM、1/2BM、MS、1/2MS為培養(yǎng)基，添加30 g·L-1的蔗糖，不添加任何激素，每種處理接種10瓶，每瓶接種3～5個，重復3次，采用單因素對比試驗，30 d后觀察不定芽生長狀況，統(tǒng)計不定芽抽莖率，以不定芽抽莖率均值為試驗指標，選出不定芽抽莖的最適培養(yǎng)基。

1.4.2 激素組合及濃度的篩選

將伸長到一定程度的帶有愈傷的不定芽轉(zhuǎn)至添加0、0.05、0.2、1.0 mg·L-16-BA，0、0.05、0.2、1.0 mg·L-1NAA的原培養(yǎng)基中進行抽莖培養(yǎng)，3周后統(tǒng)計抽莖數(shù)及其比率。

1.5 不定芽的生根

將抽莖的不定芽從愈傷上切下，接種到生根培養(yǎng)基上進行不定芽生根誘導。生根培養(yǎng)基以MS、1/2MS、BM、1/2BM、DCR、1/2DCR為培養(yǎng)基，添加0、0.5、1.0、2.0 mg·L-1IBA，0、0.5、1.0、2.0 mg·L-1NAA，附加20 g·L-1的蔗糖，2 g·L-1的活性炭，每種培養(yǎng)基上接種數(shù)不少于30個不定芽，重復3次，培養(yǎng)2周后用相同培養(yǎng)基繼代一次，30 d后統(tǒng)計生根情況。

以上培養(yǎng)基中均附加蔗糖30 g·L-1(生根培養(yǎng)基除外)、瓊脂6.5 g·L-1、L-谷氨酰胺450 mg·L-1、水解酪蛋白500 mg·L-1及肌醇1 g·L-1，培養(yǎng)基pH值用KOH和HCl調(diào)至5.8，121℃滅菌20 min，谷氨酰胺經(jīng)過濾滅菌后在培養(yǎng)基溫度降至50℃以下加入。培養(yǎng)條件：光照培養(yǎng)，溫度為24±1℃，光暗周期為16 h/8 h，光強度35 μmol·m-2·s-1左右。

1.6 再生植株的移栽

當誘導出的根長至2.0～4.0 cm時即可進行移栽，取出幼苗，洗凈根部黏附的瓊脂，將其移栽到疏松、排水性和透氣性良好的基質(zhì)中(草炭土∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1)。剛移栽入盆的小苗，應經(jīng)過2～3天的短期遮陰。塑料盆頂部覆蓋透明塑料薄膜用以保持較高的濕度，培養(yǎng)室溫度保持在24±1℃，光照時間16 h·d-1，光照強度35 μmol·m-2·s-1。放置2周后將塑料薄膜拿掉。移栽3個月后調(diào)查成活率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

1.7.1 誘導率公式

a1=b1/c1×100%

(1)

式中：a1為不定芽誘導率%；b1為產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)；c1為接種外植體的總數(shù)。

1.7.2 增殖系數(shù)公式

a2=b2/c2

(2)

式中：a2為不定芽增殖系數(shù)；b2為轉(zhuǎn)接后不定芽總數(shù)；c2為轉(zhuǎn)接前不定芽總數(shù)。

1.7.3 伸長比率公式

a3=(b3-c3)/c3×100%

(3)

式中：a3為不定芽伸長比率/%；b3為接種30 d時不定芽長度(mm)；c3為接種時不定芽長度(mm)。

1.7.4 抽莖率公式

抽莖率=(抽莖不定芽數(shù)/接種不定芽數(shù))×100%

(4)

1.7.5 生根率公式

生根率=(生根不定芽數(shù)/接種抽莖不定芽數(shù))×100%

(5)

將試驗結(jié)果經(jīng)過反正弦轉(zhuǎn)化后，再使用EXCEL和SPSS16.0軟件進行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽的誘導

2.1.1 不同培養(yǎng)基對不定芽誘導的影響

四種培養(yǎng)基對不定芽誘導的結(jié)果見表1。由表1可得，不定芽的誘導率為BM>1/2MS>1/2BM>MS。在BM培養(yǎng)基上，愈傷組織表面有綠色的、顆粒狀芽原基產(chǎn)生(圖Ⅰ:1)，且不定芽的誘導率為60.7%，標準差s值最小為0.104 5；1/2MS培養(yǎng)基上，愈傷組織表面有黃綠色凸起的芽原基產(chǎn)生(圖Ⅰ:2)，且不定芽的誘導率為55.0%，標準差s值為0.304 1；1/2BM和MS培養(yǎng)基上的誘導率皆低。因此，BM培養(yǎng)基最適用于雜種落葉松不定芽的誘導。

表1不同培養(yǎng)基對外植體不定芽誘導的影響

Table1Influenceofdifferentmediumoninductionofadventitiousbuds

培養(yǎng)基Culturemedium1/2MSMS1/2BMBMc1b1c1b1c1b1c1b11444041422424041423424141424434142435423240326533040327303132a1均值Mean(%)55．0ab19．4c22．6bc60．7a

注：無共享字母的均值之間具有顯著差異，下同。

Note:A significant difference among meanvalue of no shared alphabet,the same as below.

2.1.2 不同濃度的激素組合對不定芽誘導的影響

不同濃度的TDZ+NAA組合對不定芽誘導的結(jié)果見表2。由表2可得，單獨添加TDZ 1.5 mg·L-1時，誘導率最高為67.73%，且標準差s值為1.106，從外部形態(tài)看不定芽長勢也較好(圖Ⅰ:3)，這說明1.5 mg·L-1TDZ誘導效果較為穩(wěn)定。從處理1～6可以看出，單獨使用TDZ比TDZ+NAA組合對不定芽的誘導效果好，且當TDZ與NAA組合使用時隨NAA濃度的增加不定芽誘導率降低。從處理9可以看出，較高濃度的TDZ單獨使用不定芽誘導率又有所下降，但高濃度的TDZ與低濃度的NAA組合使用不定芽的誘導率增大?？傮w上來看，TDZ與NAA組合使用時的標準差s皆比較小，說明TDZ與NAA組合使用時對不定芽的誘導效果較為穩(wěn)定，而單獨使用TDZ進行誘導時要比兩者組合使用時更佳，這與Lin等[5]研究單獨使用細胞分裂素對興安落葉松不定芽的誘導效果較好結(jié)論相符。

2.2 不定芽的增殖

2.2.1 基本培養(yǎng)基對不定芽增殖的影響

不同培養(yǎng)基對不定芽增殖的結(jié)果見表3。在BM與MS培養(yǎng)基上的不定芽生長旺盛，芽點大，綠色，基生于針葉叢(圖Ⅰ:4)；經(jīng)方差分析，這四種培養(yǎng)基對不定芽增殖影響的差異不顯著，但BM處理的均值最大為4.48，標準差s最小為0.096，這說明BM培養(yǎng)基對不定芽增殖的效果更好更穩(wěn)定。而1/2 MS及1/2 BM培養(yǎng)基在不定芽增殖時，不僅增殖系數(shù)相對較小，且不定芽的生長狀況不好。因此，選BM培養(yǎng)基作為不定芽增殖時的最佳培養(yǎng)基。

2.2.2 不同濃度的激素組合對不定芽增殖的影響

不同濃度的激素組合對不定芽增殖的結(jié)果見表4。由表4可得，處理1～9為6-BA與NAA的組合，這兩者組合使用時增殖系數(shù)的均值較低且大都在1.00～2.00；處理10～18為TDZ與NAA的組合，這兩者組合使用時增殖系數(shù)的均值較高且大都在2.50～5.20。這說明TDZ與NAA的組合使用對不定芽增殖的效果好于6-BA與NAA的組合。在處理10～18中，增殖系數(shù)相對高的3個均值分別為5.23、4.01和3.16，對應的激素組合及濃度依次為1.0、0.5和1.5 mg·L-1TDZ。當TDZ與NAA組合使用時，隨著NAA濃度的增大，增殖系數(shù)變小，此時的NAA可能對不定芽的增殖產(chǎn)生了抑制作用。本試驗結(jié)果表明，1.0 mg·L-1TDZ對不定芽增殖的效果最佳，生長較好(圖Ⅰ:6)。

表2不同激素對外植體不定芽誘導的影響

Table2Influenceofdifferenthormoneoninductionofadventitiousbuds

處理TreatmentTDZ(mg·L-1)NAA(mg·L-1)不定芽誘導率a1Inductionfrequencyofadventitiousbuda1(%)ⅠⅡⅢ均值Mean標準差s11．0055．654．356．855．57b1．25021．00．137．535．139．737．43de2．30131．00．231．327．535．231．33e3．85041．5066．768．967．667．73a1．10651．50．150．046．447．848．07c1．81561．50．247．844．345．645．90c1．76972．0045．540．143．943．17cd2．77482．00．138．137．035．236．78e1．46492．00．243．844．741．943．47cd1．429

表3 不同培養(yǎng)基對不定芽增殖的影響

表4 不同激素對不定芽增殖的影響

2.3 不定芽的伸長

2.3.1不同濃度的激素組合對不定芽伸長生長的影響

不同濃度的激素組合對雜種落葉松不定芽伸長生長的影響結(jié)果見表5。從表5中9個處理的結(jié)果可以看出，當3個濃度梯度(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)的TDZ單獨使用時對不定芽的伸長影響都好于TDZ與NAA組合使用，且當TDZ濃度一定時，隨NAA濃度的增加不定芽的伸長效果降低。當TDZ 0.1 mg·L-1、NAA 0.04 mg·L-1時，不定芽伸長效果最差，伸長比率為11.15%，生長慢(圖Ⅰ:8)；當TDZ 0.5 mg·L-1、NAA 0 mg·L-1時，對不定芽的伸長效果最佳，伸長比率為205.72%，生長較快(圖Ⅰ:7)。從處理1、4和7的結(jié)果可以看出，單獨使用TDZ時，低濃度的TDZ，對不定芽伸長的促進作用不強，隨TDZ濃度的增高，促進作用逐漸增強，當進一步提高TDZ濃度時，這種促進作用反而降低。綜上所述，0.5 mg·L-1TDZ單獨處理對不定芽的伸長效果最佳。

表5不同激素對不定芽伸長的影響

Table5Influenceofdifferenthormoneonelongationofadventitiousbuds

處理TreatmentTDZ(mg·L-1)NAA(mg·L-1)b3均值Mean(mm)c3均值Mean(mm)a3(%)10．1011．138．2534．9120．10．029．608．0419．4030．10．048．477．6211．1540．5025．658．39205．7250．50．0218．247．43145．4960．50．0415．707．9298．2371．0021．338．05164．9781．00．0222．527．87186．1591．00．0414．417．5391．37

2.3.2不同濃度的活性炭對不定芽伸長生長的影響

不同濃度活性炭對不定芽伸長生長的影響結(jié)果見表6。由表6可以看出，在一定范圍內(nèi)隨活性炭含量的增加，不定芽的伸長比率增大，當活性炭為2 g·L-1時，達到最大值255.37%；隨著活性炭含量繼續(xù)增大，不定芽的伸長比率降低。因此，影響不定芽伸長生長的活性炭的最佳含量為2 g·L-1。

2.4 不定芽的抽莖

2.4.1 基本培養(yǎng)基對不定芽抽莖的影響

在針葉樹組織培養(yǎng)中不定芽能否抽莖是關鍵的一步，芽能否抽莖直接關系到以后試管苗的生根狀況，本試驗選用BM、1/2BM、MS、1/2MS四種基本培養(yǎng)基，均不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑，蔗糖濃度為30 g·L-1，30 d后觀察統(tǒng)計不定芽抽莖率，試驗結(jié)果見表7。

表6不同濃度的活性炭對不定芽伸長生長的影響

Table6Influenceofdifferentactivatedcarbondensitiesonelongationofadventitiousbuds

活性炭含量Activatedcarboncontent(g·L-1)a3(%)0205．721220．442255．373180．924163．86

表7基本培養(yǎng)基對不定芽抽莖的影響

Table7Influenceofminimalmediumonpumpingstemsofadventitiousbuds

培養(yǎng)基類型CulturemediumN不定芽抽莖率均值Pumpingstemmeanofadventitiousbuds(%)分組Grouping1/2BM331．37ABM322．25AB1/2MS318．28BMS314．02B

從表7可以看出，基本培養(yǎng)基對不定芽抽莖的影響：1/2BM>BM>1/2MS>MS，在1/2BM培養(yǎng)基上不定芽抽芽率最高，為31.37%，在MS培養(yǎng)基上不定芽抽芽率最低，為14.02%。經(jīng)方差分析表明，不同基本培養(yǎng)基對不定芽的抽莖存在極顯著性差異，當基本培養(yǎng)基為1/2BM時，更有利于芽抽莖。進一步進行多重比較可以得出1/2BM與BM之間差異不顯著，而與1/2MS、MS之間差異極顯著，BM、1/2MS、MS兩兩之間差異不顯著。因此，1/2BM為不定芽抽莖較適宜的基本培養(yǎng)基。

2.4.2 不同濃度的激素組合對不定芽抽莖的影響

不同濃度的激素組合對不定芽抽莖的影響見表8。由表8可得，當1/2BM+0.05 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA時，不定芽抽莖率最高為73.96%，從外部形態(tài)看不定芽發(fā)綠、抽出的莖較為粗壯(圖Ⅰ:9)，不加任何激素時不定芽抽莖率最低，為4.77%，長勢也一般(圖Ⅰ:10)。從表8還可以看出，當細胞分裂素和生長素組合使用時，生長素的濃度高于細胞分裂素濃度不定芽抽莖率較高，反之，則會降低。若只添加細胞分裂素或生長素，不定芽抽莖率也很低，只有二者組合使用抽莖率才較高。由此可見，激素組合及其配比關系對不定芽抽莖產(chǎn)生一定的影響作用。

表8不同激素對不定芽抽莖的影響

Table8Influenceofdifferenthormoneonpumpingstemsofadventitiousbuds

處理Treatment6?BA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)不定芽抽莖率Pumpingstemofadventitiousbuds(%)1004．77200．0511．84300．217．74401．011．3550．05018．9560．050．0531．2570．050．273．9680．051．047．9290．2021．61100．20．058．57110．20．234．09120．21．053．44131．0015．01141．00．057．55151．00．27．13161．01．039．87

2.5 不定芽的生根

2.5.1 培養(yǎng)基和生長素對不定芽生根的影響

不同培養(yǎng)基和生長素對不定芽生根的影響結(jié)果見表9～11。由表9～11可知：BM、MS、DCR培養(yǎng)基都不能誘導不定芽生根，可見培養(yǎng)基中大量元素的質(zhì)量濃度對雜種落葉松不定芽的生根有一定的影響，而1/2BM、1/2MS、1/2DCR培養(yǎng)基中都有不定芽生根現(xiàn)象，可見將培養(yǎng)基中大量元素的質(zhì)量濃度減半有利于雜種落葉松不定芽的生根。在1/2BM、1/2MS、1/2DCR培養(yǎng)基中單獨加入適量濃度的NAA，可誘導不定芽生根，而單獨加入不同質(zhì)量濃度的IBA則不能誘導不定芽生根，IBA和NAA組合使用比單獨添加某一種生長素誘導率高，當NAA/IBA=2∶1時，不定芽在三種培養(yǎng)基中的生根率都最高，1/2BM+0.5 mg·L-1IBA+1.0 mg·L-1NAA對不定芽生根的誘導率為29.85%，1/2MS+0.5 mg·L-1IBA+1.0 mg·L-1NAA對不定芽生根的誘導率為24.41%，1/2DCR+0.5 mg·L-1IBA+1.0 mg·L-1NAA對不定芽生根的誘導率為22.14%，培養(yǎng)基中只添加IBA而無NAA不能誘導不定芽生根，可見誘導生根的前期用適量的生長素NAA刺激不定芽，對不定芽的生根有促進作用。

表9在BM、1/2BM添加IBA、NAA對不定芽生根的影響

Table9InfluenceofthemediumBMand1/2BMwiththehormonesIBAandNAAonrootingofadventitiousbuds

培養(yǎng)基CulturemediumIBA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)生根率Rootingrate(%)BM00000．5001．0002．000．5000．50．500．51．000．52．001．0001．00．501．01．001．02．002．0002．00．502．01．002．02．00培養(yǎng)基CulturemediumIBA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)生根率Rootingrate(%)1/2BM00000．58．3401．09．2002．06．250．5000．50．516．420．51．029．850．52．019．551．0001．00．511．911．01．019．131．02．023．122．0002．00．510．842．01．012．742．02．013．99

表10在MS、1/2MS上添加IBA、NAA對不定芽生根的影響

Table10MS、1/2MSandIBA、NAAonrootingofadventitiousbuds

培養(yǎng)基CulturemediumIBA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)生根率Rootingrate(%)MS00000．5001．0002．000．5000．50．500．51．000．52．001．0001．00．501．01．001．02．002．0002．00．502．01．002．02．00培養(yǎng)基CulturemediumIBA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)生根率Rootingrate(%)1/2MS00000．57．0801．08．1202．05．210．5000．50．514．820．51．024．410．52．018．401．0001．00．511．251．01．017．701．02．020．242．0002．00．59．172．01．011．912．02．012．50

表11在DCR、1/2DCR上添加IBA、NAA對不定芽生根的影響

Table11InfluenceofthemediumDCRand1/2DCRwiththehormonesIBAandNAAonrootingofadventitiousbuds

培養(yǎng)基CulturemediumIBA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)生根率Rootingrate(%)DCR00000．5001．0002．000．5000．50．500．51．000．52．001．0001．00．501．01．001．02．002．0002．00．502．01．002．02．00培養(yǎng)基CulturemediumIBA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)生根率Rootingrate(%)1/2DCR00000．56．7001．07．7402．05．000．5000．50．513．990．51．022．140．52．017．501．0001．00．510．841．01．016．671．02．018．132．0002．00．58．342．01．011．252．02．011．67

2.5.2 蔗糖質(zhì)量濃度對生根的影響

針葉樹在根的誘導中，通常需要進一步降低培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量濃度，本試驗以1/2BM+0.5 mg·L-1IBA+1.0 mg·L-1NAA為培養(yǎng)基，分別附加5、10、20、30、40 g·L-1的蔗糖，將高1～2 cm的不定芽接入培養(yǎng)基中進行根的誘導，30 d后統(tǒng)計不定芽的生根情況(圖1)。由圖1可以看出：培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度對不定芽的生根產(chǎn)生一定的影響，當蔗糖質(zhì)量濃度為20 g·L-1時，不定芽生根誘導率最高，達25.00%，誘導形成的不定根數(shù)為2～4條(圖Ⅱ:1)，最長的不定根達4.0～5.0 cm左右；當蔗糖質(zhì)量濃度大于20 g·L-1時，隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增大，不定芽生根誘導率又降低?？梢姡诓欢ㄑ空T導生根時，適當?shù)慕档团囵B(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量濃度有利于雜種落葉松不定根的誘導，但質(zhì)量濃度過低對根的誘導產(chǎn)生抑制作用。圖Ⅱ:2為雜種落葉松在離體培養(yǎng)條件下獲得的再生小植株。

圖1 不同質(zhì)量濃度的蔗糖對不定芽生根誘導的影響Fig.1 Influence of different concentrations of sucrose on rooting of adventitious buds

2.6 再生植株的移栽

由于剛移栽的組培苗比較幼嫩，針葉的光合作用和根系的吸收能力較弱，需在移植之前對組培苗進行提高其適應能力的鍛煉(通常為一周左右為宜)，使植株生長粗壯，增強小苗體質(zhì)以提高移苗成活率。初期應該保持較高的空氣濕度(20 d左右)，在保證空氣濕度足夠大的同時，盡量確保移栽基質(zhì)良好的透氣狀況。1個月左右重新伸出新的頂芽，則組培苗成活。本試驗共移栽48株成活30株，成活率為62.5%，成活植株多數(shù)生長旺盛，表現(xiàn)為針葉嫩綠，莖桿粗壯(圖Ⅱ:3～4)，部分植株長勢較弱。

3 討論

本文在不定芽誘導中，單獨使用TDZ誘導雜種落葉松不定芽時效果較好，也曾有人研究表明，TDZ對芽的誘導具有一定的效果[6～7]。任如意等研究表明，TDZ作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，有很強的細胞分裂素活性，可以在芽的誘導中起一定的作用[8]。Mante等人用5～12.5 μm的TDZ誘導李子子葉、櫻桃子葉及桃子子葉[9]，F(xiàn)iola等用5 μm的TDZ誘導懸鉤子子葉[10]，均誘導出不定芽；歐洲落葉松、挪威云杉、蘇格蘭松[11]、美國榆樹、歐洲楸樹、黑洋槐[12]、梨[13]的組織培養(yǎng)證明了低濃度的TDZ能通過抑制頂端優(yōu)勢的發(fā)生，從而誘導不定芽和側(cè)芽萌發(fā)；TDZ也被單獨使用在誘導黃芩外植體產(chǎn)生愈傷組織中[14]；目前研究表明TDZ能引起類似細胞分裂素作用，活性強于6-BA[15]，這種高活性的分裂素通常用來離體培養(yǎng)的建立和有難度物種的增殖，有效的提高愈傷組織、不定芽或者胚的形成[16]。

在本試驗中發(fā)現(xiàn)，BM培養(yǎng)基對不定芽的增殖效果最好，不定芽增殖系數(shù)也最高，且不定芽生長旺盛，嫩綠色，芽點較大，有效芽多。這可能是由于BM培養(yǎng)基中無機鹽含量和有機物含量對于落葉松不定芽的增殖比較適宜，再加上此培養(yǎng)基中加有含量較高的肌醇，也促進了不定芽的分化；MS培養(yǎng)基的增殖效果次之，不定芽生長也較快，但與BM培養(yǎng)基中的不定芽相比較細小些；在1/2BM和1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的不定芽生長狀況較差，不定芽細小且尖端黃褐色，出現(xiàn)失綠癥狀，這可能是由于二者培養(yǎng)基中鐵鹽含量降低影響了葉綠色的形成[17]。因此可知，基本培養(yǎng)基中無機鹽的種類及濃度，以及有機物的種類及含量，對不定芽增殖有較大影響。本試驗所用的各種TDZ濃度下不定芽的增殖效果較好，與6-BA相比有明顯的優(yōu)勢，這與何俊蓉、Bonga[18～19]的研究結(jié)果不同。Bonga等人的試驗表明各種TDZ濃度下增殖的芽苗，其增殖效果一般，與6-BA相比并沒有明顯的優(yōu)勢，這可能是由于在不定芽的增殖培養(yǎng)階段，不同的植物對不同的細胞分裂素的敏感程度不同，因此，造成不定芽增殖所需的最適細胞分裂素種類有所不同；也有人研究表明，低濃度TDZ或許僅僅促進芽的增殖，而高濃度的TDZ可能既促進芽增殖又提高芽的再生能力[20～21]；極低的TDZ濃度能較好的誘導尤加樹(E.grandis×E.tereticornis)芽的增殖，而較高的TDZ濃度會產(chǎn)生含水較好的嫩莖[22]。

松屬樹種器官發(fā)生的不同階段對培養(yǎng)基中附加成分會有不同要求。一般而言，為使已分化的不定芽伸長生長，要將芽連同原組織轉(zhuǎn)移到無激素的培養(yǎng)基上或含低濃度激素的培養(yǎng)基上[23]。本試驗中將TDZ含量降到0.5 mg·L-1時，伸長效果較為明顯。在一定程度上，TDZ可促進針葉的伸長生長，而且增加了單株針葉的數(shù)目，但造成植株纖細，這是由于TDZ具有生長素和細胞分裂素雙重作用的特殊功能[24]。而這種過于纖細的植株不利于以后落葉松的生根誘導。為了得到健壯植株、克服生根難問題，還有待于進一步研究探討。本研究得出，在1/2BM培養(yǎng)基中附加適量濃度的活性炭能顯著促進雜種落葉松不定芽的伸長，這與方利娟等的研究相符[25]。

對于大多數(shù)針葉樹種而言，其組培苗生根比較困難，并已成為某些針葉樹種成功快繁的主要障礙。影響雜種落葉松不定芽生根的因素很多，如基因型、基本培養(yǎng)基、植物激素等。本文對不定芽的生根進行了初步探討，研究了MS、1/2MS、BM、1/2BM、DCR、1/2DCR培養(yǎng)基對不定芽生根誘導的影響，結(jié)果表明，1/2MS、1/2BM、1/2DCR培養(yǎng)基都能誘導出不定芽生根，MS、BM、DCR培養(yǎng)基中無不定芽生根現(xiàn)象，這說明低鹽濃度的培養(yǎng)基有利于雜種落葉松不定芽的生根。植物激素的種類及其濃度對器官發(fā)生具有調(diào)控作用，本試驗結(jié)果表明，單獨加入適量濃度的NAA，可誘導不定芽生根，而單獨加入不同質(zhì)量濃度的IBA則不能誘導不定芽生根，IBA和NAA組合使用比單獨添加某一種生長素誘導率高，培養(yǎng)基中只添加IBA無NAA不能誘導不定芽生根，可見誘導生根的前期用適量的生長素NAA刺激不定芽，對不定芽的生根有促進作用，而這一結(jié)論與施翔對雜交松的研究中發(fā)現(xiàn)：IBA更適合雜交松不定根的誘導，NAA的存在則會阻礙根的形成這一結(jié)論相反[26]。本試驗中不定芽生根誘導率最佳組合為：1/2BM+0.5 mg·L-1IBA+1.0 mg·L-1NAA，其誘導率為30%左右?；诓欢ㄑ可实瓦@一問題還有待于進一步研究。

組培苗長期在弱光、恒溫、高濕的環(huán)境下生長，其形態(tài)、解剖以及生理特性和大田生長的植株不同，為適應移栽后的較低濕度以及較高的光強，因此本試驗在對幼苗移栽前先進行了煉苗。本試驗雜種落葉松移栽成活率為62.5%，成活植株多數(shù)生長旺盛，表現(xiàn)為針葉嫩綠，莖桿粗壯。

1.Lewandoski A,Burczyk J,Mejnartowicz L.Genetic structure and the mating system in an old stand of Polish larch[J].Silvae Genet,1991,40:75-79.

2.吳克賢,李偉,徐妙珍,等.長白落葉松組織培養(yǎng)的研究[J].林業(yè)科學,1996,32(2):125-132.

3.王偉達,李成浩,張含國,等.長白落葉松愈傷組織誘導與不定芽分化[J].東北林業(yè)大學學報,2008,36(2):6-7.

4.張莉,張磊,張素芳,等.雜種落葉松愈傷組織誘導培養(yǎng)基的建立和優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2014,42(32):11243-11246.

5.Lin X F,Zhang W B,Takano H,et al.Efficient plant regeneration and micropropagation from callus derived from mature zygotic embryo ofLarixgmelinii[J].Plant Biotechnology,2004,21(2):159-163.

6.連霞,馬鋒旺,陳登文,等.TDZ對仙客來不同外植體再生的影響[J].西北農(nóng)林科技大學學報:自然科學版,2006,34(4):39-42.

7.胡鈉梅,韓素英,梁國魯,等.TDZ誘導中間錦雞兒植株再生[J].北方園藝,2009(8):204-205.

8.任如意,王書臻,司徒琳莉,等.噻重氮苯基脲對文冠果愈傷組織誘導與分化的影響[J].北方園藝,2011(06):127-129.

9.Mantes,Scorza R,Cordts J M.TDZ:a potent cytokinin for woody plant tissue culture[J].Plant Cell Tiss Org Cult,1989,19:1-11.

10.Fioal J A,Hassan M A,Swaita H J,et al.Melatonin in feverfew and other medicinal plants[J].Plant Cell Tiss Org Cult,1990,20:223-228.

11.Chalupa,in vitro propagation ofLarix,Picea,Pinus,Quercus,Fagusand other species using adeninetype cytokinins and thidiazron,commun inst for cech,1985,14:65-90.

12.Chalupa,Effect of benzylaminopurine and thidiazuron on in vitro shoot proliferation ofTiliacordataMill.,SorbusaucupariaL. andRobiniapseudoccaciaL.[J].Boil Plant,1987,29:425-429.

13.Chevreau E,Skirvin R M,Abu-Qaoud H A,Korban SS,Sullivan jg (1989) Adventitous shoot regeneration from leaf tissue of three pear(Pyrussp.) cultivars.Plant cell rep7: 688-691.

14.Ledbetter Donna,I Preece John E.Thidiazuron stimulates adventitious shoot production fromHydrangeaquercifoliaBartr leaf explants[J].Scientia horticulturae,2004,101(7):121-126.

15.Huetteman C A,Preece J E.Thidiazuron:a potent cytokinin for woody plant tissue culture[J].Plant Cell Tiss Org Cult,1993,33:105.

16.Hutchinson M J,Saxena P K.Role of purine metabolism in thidiazuron-induced somatic embryogenesis of geranium(Pelargonium×hortorumBailey) hypocotyl culture[J].Physiol Plant,1996,98(3):517.

17.何俊蓉,吳潔,袁寧,等.彩色馬蹄蓮組培快繁的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學報,2008,21(3):775-778.

18.Bonga,J M.Pond S E.Adventitious shoot formation in cultures of 30 year-oldL.decidua,L.teptolepis,L.eurolepisandL.laruinatrees[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,1991,26(1):45-51.

19.Patel,K.R.Kim,H.and Thorpe,T.A.Plantlet formation in pitch pine(PinusrigidaMill) by Tissue culture methods[J].Forest Ecology and Management,1986,15:147-160.

20.Chapupa V.Biol.Plant(Praha),1988,30:414-421.

21.Van Nieunkerk S P,Zimmerman R H.Ford haml[J].Hortscience,1986,21:516-518.

22.Marcia marria de lima.Effect of Thidiazuron on in vitro shoot multiplication of Eucalyptus grandisXeucalyptustereticornis[J].Scientia forestalis,1998,53:49-56.

23.邢世巖.松屬樹種細胞、組織和器官培養(yǎng)名錄[J].植物生理學通訊,1990,1:75-79.

24.徐曉峰,黃學林.TDZ一種有效的植物生長調(diào)節(jié)劑[J].植物學通報,2003,20(2):227-237.

25.方利娟.雜交松組織培養(yǎng)技術研究[D].南寧:廣西大學,2006.

26.施翔.雜交松組織培養(yǎng)技術研究[D].南京:南京林業(yè)大學,2005.

圖版Ⅰ 1. 25 d時BM上誘導出的芽原基；2. 25 d時1/2MS上誘導出的芽原基；3. BM培養(yǎng)基上TDZ1.5 mg·L-1時誘導出的不定芽；4. BM上增殖的不定芽；5. MS上增殖的不定芽；6. BM培養(yǎng)基上TDZ1.0 mg·L-1時增殖的不定芽；7. BM上添加0.5 mg·L-1TDZ伸長的不定芽；8. BM上添加0.1 mg·L-1TDZ+0.04 mg·L-1NAA伸長的不定芽；9. BM上添加0.05 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA抽莖的不定芽；10. BM上不添加任何激素抽莖的不定芽PlateⅠ 1. 25 d shoot primordium on BM medium; 2. 25 d shoot primordium on1/2MS medium; 3.The adventitious buds on the medium of BM with 1.5 mg·L-1TDZ; 4.The proliferation of adventitious buds on BM medium; 5.The proliferation of adventitious buds on MS medium; 6.The proliferation of adventitious buds on the medium of BM with 1.5 mg·L-1 TDZ; 7.The elongation of adventitious buds on the medium of BM with 0.5 mg·L-1 TDZ; 8.The elongation of adventitious buds on the medium of BM with 0.5 mg·L-1 TDZ and 0.04 mg·L-1NAA; 9.The pumping stems of adventitious buds on the medium of BM with 0.05 mg·L-1 6-BA and 0.2 mg·L-1 NAA; 10.The pumping stems of adventitious buds on the medium of BM with no hormone

圖版Ⅱ 1. 1/2BM上添加0.5 mg·L-1IBA+1.0 mg·L-1NAA不定芽誘導的出根苗；2.離體條件下的再生植株；3.移栽20 d時生長旺盛的再生植株；4.移栽35 d時成活的再生植株Plate Ⅱ 1.The rooting of adventitious buds on the medium of 1/2BM with 0.5 mg·L-1 IBA and 1.0 mg·L-1 NAA; 12.The regenerated plants in vitro condition; 13.Regenerated plants with vigorous growth after 20 d being transplanted; 14.Survival regeneration plant after 35 d being transplanted

EstablishmentandOptimizationofplantregenerationofHybridlarch(L.gmelinii10×L.kaempferi13)

ZHANG Li ZHANG Lei HOU Dan ZHANG Su-Fang ZHANG Han-Guo*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

With the mature zygotic embryos of hybrid larch(L.gmelinii10×L.kaempferi13), by combining different culture medium and hormone, we established and optimized hybrid larch mature zygotic embryos induction and plant regeneration. BM medium was suitable for adventitious bud induction of hybrid larch with the induction rate of 60.7%. Under the condition of combination BM and1.5 mg·L-1TDZ, induction rate was the highest, 67.73%. BM medium could promote the proliferation of adventitious buds with the value-added coefficient of 4.48, when it was cultured on BM+1.0 mg·L-1TDZ with the coefficient of 5.23. The active carbon could promote the elongation at the level of 2 g·L-1. When the adventitious buds were cultured under BM+0.05 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA, the pumping stems rate was the highest, up to 73.96%, and the highest rooting rate was 29.85% under 1/2BM+0.5 mg·L-1IBA+1.0 mg·L-1NAA.

hybrid larch;the mature zygotic embryos;adventitious buds;tissue culture

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2013AA102704)

張莉(1988—)，女，碩士研究生，主要從事落葉松分子育種的研究。

* 通信作者：E-mail:hanguozhang1@sina.com

2015-10-27

S791.22

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.018