羅 猛 胡嬌陽 宋卓悅 牟璠松* 于雪瑩 喬 琪阮 鑫 楊 璇 祖元?jiǎng)?/p>

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.林下經(jīng)濟(jì)資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱 150040)

山里紅總黃酮季節(jié)動(dòng)態(tài)及其與氣候因子相關(guān)性分析

羅 猛1,2胡嬌陽1,2宋卓悅1,2牟璠松1,2*于雪瑩1,2喬 琪1,2阮 鑫1,2楊 璇1,2祖元?jiǎng)?,2

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2.林下經(jīng)濟(jì)資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱 150040)

研究山里紅中總黃酮含量隨季節(jié)動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律，明確影響其總黃酮含量的氣候因子。采收2013年5～10月的山里紅，采用超聲輔助提取法從山里紅中提取總黃酮，三氯化鋁比色法檢測總黃酮的含量,并對山里紅葉總黃酮含量與氣候因子進(jìn)行相關(guān)性分析。山里紅不同部位總黃酮含量差異較大，9月份山里紅葉黃酮類成分的含量最高，其值為31.52 mg·g-1。統(tǒng)計(jì)九月份山里紅葉總黃酮含量與氣候因子之間相關(guān)性分析，結(jié)果表明總黃酮含量與溫度相關(guān)性顯著。綜合考慮，選擇9月份為山里紅葉的最佳采收期。該結(jié)果可為山里紅葉總黃酮的深入開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

山里紅；總黃酮；氣候因子；季節(jié)動(dòng)態(tài)；相關(guān)性

山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.var.Major N.E.Br.)屬薔薇科(Rosaceae)山楂屬(Crataegus)植物，是《中華人民共和國藥典》(2010版) 山楂項(xiàng)下的原藥材之一，主產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧、河北、河南和內(nèi)蒙古等地[1]。山里紅具有抗氧化、降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗菌等功效，可用于心血管、消化、內(nèi)分泌系統(tǒng)和病原微生物等疾病[2]。目前，已經(jīng)從山里紅中分離出170多種化學(xué)成分，其中包括酚類、黃烷及其聚合物、三萜類、糖類、含氮化合物、有機(jī)酸和一些微量元素等[3～5]。其中，原花青素和三萜類化合物主要存在于山里紅的果實(shí)中，而黃酮類主要存在于葉片中。黃酮是一種具有較強(qiáng)清除自由基和抗氧化能力的物質(zhì)，是廣泛存在于植物界的天然活性成分[6]。天然植物在生長和發(fā)育過程中降水量、溫度和光照時(shí)間等氣候因子對植物體內(nèi)的活性成分含量影響較大，尤其是總黃酮的含量[7～8]。由于山里紅葉作為一種可再生的資源，因此對山里紅葉中黃酮類成分進(jìn)行研究以及根據(jù)山里紅葉的季節(jié)動(dòng)態(tài)確定采收期顯得尤其重要。

三氯化鋁比色法和亞硝酸鈉—硝酸鋁—?dú)溲趸c比色法是測定黃酮類含量常用的方法，主要因?yàn)殇X離子會(huì)與黃酮類物質(zhì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，反應(yīng)后生成絡(luò)合物而顯色[9]。然后采用紫外分光光度計(jì)測定吸光度，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)品曲線作為參照，之后求得提取物的黃酮類含量。由于亞硝酸鈉—硝酸鋁—?dú)溲趸c比色法操作相對三氯化鋁比色法，對提取物濃度要求高。

本文擬采用超聲法提取山里紅不同部位中的總黃酮，應(yīng)用三氯化鋁法測定總黃酮的含量，并考察其抗氧化能力。采收生長期的山里紅，比較不同季節(jié)生長期中山里紅不同部位的總黃酮含量，明確哪些氣候因子起主導(dǎo)作用，其研究結(jié)果可為山里紅中總黃酮的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

山里紅的葉采于2013年5～10月，根、莖、果實(shí)于2013年9月中旬采自黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)，其中采收莖為直徑小于等于5 cm的嫩莖，采收葉為嫩莖上的葉片。樣品標(biāo)本存放在東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。樣品采收后，將每個(gè)部位分開，風(fēng)干處理至恒重，使用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，儲(chǔ)存以備用。

1.2 超聲提取方法

精密稱取10 g山里紅葉粉末放入錐形瓶中，加入150 mL 40%的乙醇溶液，在超聲反應(yīng)器(KQ-250DE,中國昆山超聲儀器有限公司)中提取30 min，溫度40℃，超聲功率為250 W。上述過程重復(fù)3次。過濾，合并上清液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35℃時(shí)減壓濃縮。山里紅的根、莖、果實(shí)的提取過程同山里紅葉一樣。浸膏在4℃下冷藏待測。

1.3 山里紅葉總黃酮含量的測定

配制濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，繪制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品曲線[10]。采用三氯化鋁比色法測定山里紅葉的總黃酮含量，取150 μL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液加入到96孔板，再加入150 μL 2%的三氯化鋁溶液混勻(空白組以150 μL的蒸餾水取代之)，后于室溫下靜置10 min。在410 nm波長處測定吸光值，其中三氯化鋁為顯色劑。以每克試樣中蘆丁之相對含量(mg·g-1RE)表示總黃酮的含量[11]。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，1個(gè)空白。繪制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品曲線為Y=2.077 7X-0.002 9，其中R2=0.999 7。

1.4 山里紅不同部位的抗氧化能力

山里紅葉的抗氧化活性是通過DPPH清除自由基能力來評估的，將不同濃度的樣品在50%的乙醇(100 μL)中溶解后加入50%的乙醇(1.4 mL)，然后加入0.004%的DPPH(1 mL)?；旌虾髣×艺鹗?，在室溫下避光放置30 min，在517 nm處測定吸光值，上述步驟重復(fù)3次。樣品的DPPH自由基的抗氧化能力以IC50表示。山里紅的根、莖、果實(shí)的測定過程同山里紅葉一樣。

1.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS22.0，采用Pearson相關(guān)系數(shù)對山里紅總黃酮含量與各氣候因子進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 山里紅不同部位總黃酮含量

樣品經(jīng)處理后，通過三氯化鋁比色法測定不同部位的山里紅樣品的總黃酮含量。從表1可以看出，在9月份，山里紅根部的總黃酮含量為18.44 mg·g-1，山里紅莖部的總黃酮含量為29.70 mg·g-1，山里紅葉中的總黃酮含量值為31.52 mg·g-1，也是四種部位中含量最高的，山里紅果實(shí)從6月開始結(jié)果，在9月的時(shí)候山里紅果實(shí)的總黃酮含量為24.81 mg·g-1。

表1山里紅根、莖、葉、果實(shí)的總黃酮含量

Table1TFCinC.pinnatifidaroots,twigs,leaves,fruits(mg·g-1)

部位Part總黃酮含量TFC(mg·g-1)根Root18．44±0．003莖Stem29．70±0．010葉Leaf31．52±0．012果實(shí)Fruit24．81±0．013

通過比較不同部位山里紅的總黃酮含量，我們可以發(fā)現(xiàn)在9月份時(shí)，山里紅的葉片中總黃酮含量最高，其次是山里紅的莖部、山里紅的果實(shí)，最后是山里紅的根部。山里紅莖部的總黃酮含量和山里紅葉的總黃酮含量相差不多，且同為可再生部位，但其生長緩慢，且過量采收影響植物的生長，因此可利用價(jià)值不及葉片高。同樣，山里紅根部也不適合當(dāng)做工業(yè)生產(chǎn)原料。山里紅的果實(shí)雖然比較適合采收，也是可再生部位，但常作為食用原料使用，且果實(shí)中的總黃酮含量低于葉片的總黃酮含量。因此，山里紅葉作為山里紅植物的可再生部位，在東北每年都會(huì)大量產(chǎn)生及脫落，適合大量采收并進(jìn)行深入研究開發(fā)。

2.2 山里紅葉總黃酮含量季節(jié)動(dòng)態(tài)

降水量、溫度和光照時(shí)間的變化對植物的光合作用以及相關(guān)的生理參數(shù)影響較大。植物的光合作用對光照的要求很高，需要有充足的陽光，植物的光合作用才能夠正常的進(jìn)行，因?yàn)楣庹帐枪夂献饔玫幕A(chǔ)[12～13]。而光合作用也在很大程度上會(huì)受到溫度和降水量的影響，溫度能夠影響植物生理活動(dòng)的快慢，光合作用的過程中發(fā)生的一些酶反應(yīng)，需要適當(dāng)?shù)臏囟炔拍苓M(jìn)行。而植物的蒸騰速率和光合速率等因素都會(huì)隨著降水量的增大而增加[14]。所以，生態(tài)因素會(huì)影響山里紅中的活性成分的含量，尤其是總黃酮的含量。所以本文通過比較不同時(shí)期的山里紅葉的總黃酮含量，來確定最佳采收時(shí)間。不同采樣期的山里紅葉中總黃酮含量變化(圖1)。

圖1 山里紅葉中總黃酮的含量變化Fig.1 Seasonal variations on TFC in C.pinnatifida leaves

從5月份時(shí)山里紅葉總黃酮含量為17.92 mg·g-1開始，一直持續(xù)增長，到6月份總黃酮含量為22.38 mg·g-1，之后在7、8月份趨于穩(wěn)定，總黃酮含量分別為27.54、28.59 mg·g-1，在9月份總黃酮含量到達(dá)最高點(diǎn)，值為31.52 mg·g-1。在10月份葉子脫落前，山里紅葉的總黃酮含量為25.89 mg·g-1。可見，山里紅葉在9月份時(shí)總黃酮含量比較高。

2.3 氣候因子的對比分析

氣候?qū)W上通常以每5日的平均氣溫作為季節(jié)的劃分標(biāo)準(zhǔn)：平均氣溫高于22℃的時(shí)期為夏季，低于10℃則為冬季，介于二者之間的為春季和秋季。黑龍江省哈爾濱市位于亞歐大陸東部的中高緯度，在北緯44°04′～46°40′，東經(jīng)125°41′～130°13′。所以根據(jù)這個(gè)季節(jié)劃分的標(biāo)準(zhǔn)，從4月中下旬開始是哈爾濱的春天，氣溫慢慢回升，到6月份開始逐漸進(jìn)入夏天，一直持續(xù)到8月末然后轉(zhuǎn)入秋季，隨后從12月到來年的4月是冬季[15]。從4月中下旬進(jìn)入春季開始，山里紅植株開始發(fā)芽，植物開始復(fù)蘇，一直持續(xù)到10月份葉子和果實(shí)全部脫落。所以本研究考察了5～10月的季節(jié)動(dòng)態(tài)，來評價(jià)植物的最佳采收期。

2004～2013年從5～10月哈爾濱的月平均溫度，月平均降水量和月平均光照時(shí)間，如表2所示，因?yàn)椴墒盏氖?013年的山里紅樣品，所以比較了2013年和2004～2013年生態(tài)因子的變化。從這些變化中可以發(fā)現(xiàn)，2013年生態(tài)因子的變化趨勢和2004～2013十年間整體的變化趨勢是相吻合。2013年的月平均溫度在7、8月份的時(shí)候比較高，十年內(nèi)的月平均溫度也是在7、8月比較高。2013年的月平均降水量從5月開始增長迅速，到7月份時(shí)達(dá)到最大值，八月開始持續(xù)下降，在九月到達(dá)一個(gè)最低值，然后十月份降水量開始增多。而2004～2013這十年間的月平均降水量從5月開始增長迅速，到7月份時(shí)達(dá)到最大值，之后一直下降。2013年的月平均光照時(shí)間從5～10月沒有太顯著地變化，七月份略高于其它月份；2004～2013這十年間的月平均光照時(shí)間也是如此，只是月平均值高于2013年。

2.4 山里紅總黃酮含量與氣候因子相關(guān)性分析

從圖2可看出，氣候因子是相互影響、相互制約、共同作用的，山里紅葉中總黃酮含量與氣候因子之間具有一定的相關(guān)性。溫度與山里紅葉總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)為0.862，降水與莖中總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)為0.855，光照時(shí)間與各部位的黃酮含量變化不顯著。因此，溫度對山里紅葉的富集具有顯著的影響(P<0.5)。

表22004～2013年5～10月哈爾濱的月平均溫度、降水量和光照時(shí)間

Table2Averageoftemperature,precipitationanddaytimefromMaytoOctober2004-2013inHarbin

年Year月Month溫度Temperature(℃)降水量Precipitation(mm)光照時(shí)間Daytime(h)201351756．381562162．2415723104．391582291．961391422．11210634．05102004～2013514．835．68815621．175．53615．9722．694．84215．9821．659．76814．8915．239．09513．8106．62515．36511．8

圖2 山里紅總黃酮含量與各氣候因子的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of TFC in C.pinnatifida and climatic factors

從4月中下旬開始是哈爾濱的春天，春天新葉萌發(fā)的前后，初級代謝和次生代謝變得活躍，葉子開始發(fā)芽、生長。5月份山里紅葉片剛發(fā)育，光合作用強(qiáng)度比較弱，黃酮類化合物合成較少。從5月開始，隨著葉片的不斷生長發(fā)育，植物的光合作用持續(xù)增強(qiáng)，根部不斷向其他部位輸送養(yǎng)分，營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸、積累和轉(zhuǎn)化的能力增強(qiáng)。在這段期間，山里紅植物經(jīng)過春天的復(fù)蘇，夏天的積累，黃酮類成分的含量一直在持續(xù)增長，并且在9月份時(shí)到達(dá)了最高點(diǎn)，到達(dá)了山里紅葉的成熟期。夏天溫度不斷升高，這些因素都加速了黃酮類物質(zhì)的生物合成，植物通過增加黃酮類化合物的生物合成來保護(hù)自己[16]。隨后到10月份，溫度開始下降，葉子開始逐漸脫落，植物開始衰老，細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡，營養(yǎng)物質(zhì)被輸送到植物的根部，以保障植物能夠度過漫長的冬季休眠期[17]。而果實(shí)到達(dá)成熟期，營養(yǎng)成分主要被富集在果實(shí)部分，不利于葉片中黃酮類物質(zhì)的生物合成，葉片開始衰老，所以山里紅葉中的總黃酮含量也開始下降，受溫度氣候的影響山里紅葉在9月份時(shí)總黃酮含量最高。

2.5 山里紅總黃酮對DPPH自由基的抑制率

DPPH自由基比較穩(wěn)定，已被廣泛用于評估抗氧化劑自由基清除能力，黃酮類化合物作為供電子劑，表現(xiàn)出明顯的清除自由基的能力[18]。因此，山里紅不同部位提取物的抗氧化活性通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了評估。結(jié)果如圖3所示，山里紅的根，莖，葉，果實(shí)部位對DPPH自由基均有一定的清除能力，其中根和莖提取物的清除能力最強(qiáng)，其次是葉，但是由于根和莖是不可再生資源，所以可選擇山里紅葉作為天然活性抗氧化劑的來源。

圖3 山里紅不同部位的DPPH自由基抑制率Fig.3 Different parts of C.pinnatifida DPPH scavenging ability

3 結(jié)論

采收2013年9月的山里紅根、莖、葉和果實(shí)，考察不同采收期山里紅不同部位總黃酮的季節(jié)動(dòng)態(tài),結(jié)果表明，9月份葉中總黃酮含量最高(31.52 mg·g-1)，莖和果實(shí)次之(29.7和24.81 mg·g-1)，根最低(18.44 mg·g-1)。統(tǒng)計(jì)2013年和2004～2013年山里紅葉采收期內(nèi)的氣候因子，包括月平均溫度、月平均降水量和月平均光照時(shí)間，可以看出2013年的氣候因子和十年間的平均值趨勢相似，都在7、8月份較高。通過對9月山里紅葉總黃酮含量與氣候因子之間的相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)總黃酮產(chǎn)量與溫度的相關(guān)性顯著。DPPH清除自由基實(shí)驗(yàn)表明，9月的山里紅葉可作為天然抗氧化的藥用植物材料。綜合考慮，選擇9月份為山里紅葉的最佳采收期。該研究結(jié)果為山里紅葉總黃酮的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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SeasonalVariationofTotalFlavonoidsfromCrataeguspinnatifidaandCorrelationAnalysisofClimaticFactors

LUO Meng1,2HU Jiao-Yang1,2SONG Zhuo-Yue1,2MU Fan-Song1,2*YU Xue-Ying1,2QIAO Qi1,2RUAN Xin1,2YANG Xuan1,2ZU Yuan-Gang1,2

(1.Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Ministry of Education,Northeast Forestry University,Harbin 150040；2.The Development and Utilization Collaborative Innovation Center of Forest Economic Resources,Harbin 150040)

We determined the contents of total flavonoids fromCrataeguspinnatifida(C.pinnatifida) according to seasonal dynamics to find out the climate dominant climatic factors which influence the total flavonoids content(TFC) ofC.pinnatifida. We studied theC.pinnatifidafrom May to October 2013, and used ultrasound-assisted extraction(UAE) to extract TFC fromC.pinnatifida, and determined TFC by aluminum chloride colorimetric method. We analyzed the correlation between the TFC and climatic factors. TFC in different parts ofC.pinnatifidahad significant difference. TFC fromC.pinnatifidaleaves increase continuously and reach the highest point in September, with the value of 31.52 mg·g-1. A positive correlation was between the content of total flavonoid and temperature. September was the best harvest time forC.pinnatifidaleaves. Our result provides a theoretical basis for development and utilization of total flavonoids inC.pinnatifida.

Crataeguspinnatifida;total flavonoids;climatic factors;seasonal variation;correlation

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(2572015EA04,2572014CA08)；黑龍江省博士后科研啟動(dòng)金(LBH-Q13003)；國家自然科學(xué)基金(21403032)

羅猛(1979—)，男，副研究員，主要從事植物活性成分研究。

* 通信作者：E-mail: fansong8867@nefu.edu.cn

2015-10-20

Q949.751.8

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.023