賈園園 張春蕊 王玉成 楊傳平 王 超

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

剛毛檉柳Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與表達(dá)分析

賈園園 張春蕊 王玉成 楊傳平 王 超*

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

通過(guò)對(duì)剛毛檉柳(Tamarixhispida)轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定獲得一個(gè)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,命名為ThSOS1。ThSOS1基因cDNA全長(zhǎng)3 917 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)3 498 bp，編碼1 165個(gè)氨基酸，編碼蛋白相對(duì)分子質(zhì)量128.8 kDa，理論等電點(diǎn)(PI)為6.42。疏水性分析預(yù)測(cè)ThSOS1基因編碼蛋白N端具有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，C端具有一個(gè)較長(zhǎng)的親水尾部。ThSOS1氨基酸序列與長(zhǎng)葉紅砂、藜麥、鹽地堿蓬等植物的SOS1序列同源性較高，分別可達(dá)92%，73%，72%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明ThSOS1為質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于不同分支。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析顯示，該基因受高鹽、干旱誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，暗示ThSOS1可能在剛毛檉柳抗旱耐鹽過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

剛毛檉柳；Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；脅迫響應(yīng)；基因表達(dá)

土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的重要因素，鹽害能造成植物體離子失衡和滲透脅迫，是植物最重要的非生物脅迫之一[1]。其中的離子毒害主要是指高濃度的Na+對(duì)植物的毒害作用[2]。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物耐鹽的關(guān)鍵因子[3]，它利用質(zhì)膜或液泡膜H+-ATPase和H+-PPase建立的跨膜質(zhì)子梯度為驅(qū)動(dòng)力，將細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的Na+從質(zhì)膜向胞外排放或?qū)a+富集在液泡內(nèi)區(qū)隔化，使細(xì)胞質(zhì)維持著較低的Na+水平，避免了過(guò)多的Na+對(duì)細(xì)胞的毒害作用，同時(shí)也維持了細(xì)胞的滲透平衡[4～5]。

植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要分為兩類：質(zhì)膜型和液泡膜型。質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與植物的Na+外排，液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能是將Na+運(yùn)入液泡區(qū)隔化以維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)正常的Na+濃度。植物質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白首次于1976年在大麥中發(fā)現(xiàn)[6]。1985年Blumwald和Poole在紅甜菜的根部貯藏組織中發(fā)現(xiàn)了液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[7]。到目前為止，已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[8]、水稻(Oryzasativa)[9]、番茄(Lycopersiconesculentum)[10]和油菜(Brassicanapus)[11]等多種植物中分離得到了Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。Shi等在擬南芥中克隆出了一個(gè)細(xì)胞質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SOS1，這個(gè)基因過(guò)量表達(dá)后能降低芽中的Na+含量，增強(qiáng)愈傷組織的耐鹽性[12]。隨后的研究又證實(shí)了SOS1基因過(guò)量表達(dá)，可以顯著提高擬南芥對(duì)鹽脅迫的耐性[13]。棉花(Gossypiumhirsutum)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因GhNHX1過(guò)量表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[14]。這些研究都表明Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物耐鹽過(guò)程中具有重要作用。

目前，對(duì)植物中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究主要集中在一些模式植物中，對(duì)木本植物的研究較少，對(duì)鹽生木本植物的研究更少。剛毛檉柳(Tamarixhispida)屬檉柳科(Tamaricaceae)檉柳屬(Tamarix)，灌木，作為優(yōu)良的防風(fēng)固沙植物，其耐干旱、鹽堿、貧瘠、風(fēng)蝕和沙埋[15]，廣泛分布于礫石戈壁、粘土、砂土、流沙及各種不同程度的鹽漬化土壤。這表明剛毛檉柳體內(nèi)有著一套非常有效的抗逆系統(tǒng)，是研究木本植物耐鹽分子機(jī)理、分離重要耐鹽功能基因的理想物種之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)剛毛檉柳轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，克隆獲得了一條Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ThSOS1)的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)該序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)分析了其在鹽和干旱脅迫下不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式，為進(jìn)一步了解ThSOS1在檉柳非生物脅迫應(yīng)答中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理方法

將剛毛檉柳的種子播種于V泥炭土∶V沙=2∶1的混合土壤中，在平均溫度24℃，光照時(shí)間14 h·d-1，相對(duì)濕度為70%～75%的溫室中培養(yǎng)。待幼苗生長(zhǎng)至苗高3～4 cm后，選取生長(zhǎng)正常且大小一致的幼苗分別用水(對(duì)照組)、0.4 mol·L-1的NaCl溶液和20%的PEG6000溶液澆灌，在脅迫處理3、6、9、12、24、48、72、96 h后，取剛毛檉柳的根部組織和地上部組織，用液氮速凍后保存在-80℃冰箱，用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析,每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2 ThSOS1基因的克隆與序列分析

通過(guò)對(duì)剛毛檉柳轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，根據(jù)Unigenes功能注釋結(jié)果查找獲得一條Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ThSOS1)，對(duì)其全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，目的條帶經(jīng)膠回收純化后，連接到pMD18-T載體上，進(jìn)一步測(cè)序確定所獲得的序列的準(zhǔn)確性。

用在線工具ORF Finder程序確定ThSOS1基因序列的開(kāi)放讀碼框(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html)；利用序列處理在線工具包(SMS)將其基因序列翻譯成氨基酸；利用BioEdit軟件進(jìn)行氨基酸序列的同源性分析；運(yùn)用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；用ProtParam程序進(jìn)行蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)的預(yù)測(cè)(http://www.ncbi.n1m.nih.gov/gorf.htm1)；利用Protscal程序進(jìn)行蛋白質(zhì)的疏水性預(yù)測(cè)分析(http://web.expasy.org/protscale/)；用SOPMA軟件預(yù)測(cè)ThSOS1的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用在線工具TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED-form.html)和TMHMM server 2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)ThSOS1的編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；利用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域的分析；應(yīng)用Psort軟件(http://psort.hgc.jp/form.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR表達(dá)分析

用CTAB法提取剛毛檉柳根部組織和地上部組織的總RNA，經(jīng)DNaseⅠ(Promega)消化除去DNA，用Prime ScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍，并作為定量RT-PCR的模板。

根據(jù)ThSOS1全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)定量引物，內(nèi)參基因分別是β-actin(FJ618517)、α-tubulin(FJ618518)、β-tubulin(FJ618519)，引物序列見(jiàn)表1。利用MJ OpticonTM2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad,Hercules,CA)對(duì)基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR使用的試劑盒是Trans Start Top Green qPCR Super Mix(Trans Gen)，反應(yīng)體系是：2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL,上游引物和下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，稀釋后的模板cDNA 2 μL，加滅菌去離子水補(bǔ)足體積至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性30 s；94℃變性12 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，79℃讀板1 s，45個(gè)循環(huán)。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溫度以0.5℃·s-1的速度從55℃升到99℃。每個(gè)樣品重復(fù)3次，用2-△△Ct方法進(jìn)行基因的相對(duì)定量分析[16]。

表1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 ThSOS1基因全長(zhǎng)cDNA的獲得及序列分析

通過(guò)對(duì)剛毛檉柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，根據(jù)基因功能注釋結(jié)果查找獲得一條編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列，對(duì)其進(jìn)行重新測(cè)序，最終獲得剛毛檉柳Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因全長(zhǎng)cDNA序列，命名為ThSOS1。將該基因序列用ORF founder程序進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)它的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)3 498 bp，編碼1 165個(gè)氨基酸。5′非編碼區(qū)(UTR)長(zhǎng)185 bp，3′非編碼區(qū)(UTR)長(zhǎng)234 bp(圖1)。

ProtParam程序預(yù)測(cè)ThSOS1編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量128.8 kDa，理論等電點(diǎn)(PI)為6.42。疏水性分析發(fā)現(xiàn)，ThSOS1的N末端部分有一個(gè)很強(qiáng)的疏水性結(jié)構(gòu)，而C末端的親水性較強(qiáng)。按照氨基酸分值越高疏水性越強(qiáng)，分值越低親水性越強(qiáng)的原則，發(fā)現(xiàn)整個(gè)肽鏈中疏水性氨基酸多于親水性氨基酸，整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為疏水性(圖2:A)，因此ThSOS1屬于疏水性蛋白，符合膜蛋白的特性。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明ThSOS1蛋白含有479個(gè)α-螺旋(占41.12%)、348個(gè)隨意卷曲(占29.87%)、234個(gè)延伸鏈(占20.09%)和104個(gè)β-轉(zhuǎn)角(占8.93%)，其中二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、隨意卷曲和延伸鏈交錯(cuò)構(gòu)成(圖2:C)?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明ThSOS1包含有10個(gè)完全跨過(guò)液泡膜的跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2:B)，這與已報(bào)道的動(dòng)植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜區(qū)域數(shù)(10～12)一致。經(jīng)SMART軟件分析，發(fā)現(xiàn)ThSOS1蛋白在第32～448個(gè)氨基酸位點(diǎn)處存在典型的“Na+/H+Exchanger”蛋白結(jié)構(gòu)域，E-值1.6e-64，表明ThSOS1屬于Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員。

2.2 ThSOS1蛋白的亞細(xì)胞定位分析

應(yīng)用Psort軟件(http://psort.hgc.jp/form.html)對(duì)ThSOS1蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示其可能定位于質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡和高爾基體(表2)。ThSOS1定位于質(zhì)膜的概率最高，為69.6%，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡和高爾基體的概率都相對(duì)較小，表明ThSOS1可能定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，在調(diào)控離子跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

表2 ThSOS1蛋白亞細(xì)胞定位

2.3 同源比對(duì)與系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建

將ThSOS1的氨基酸序列與其他植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示ThSOS1與長(zhǎng)葉紅砂RtSOS1(Reaumuriatrigyna，AGW30208.1)、藜麥CqSOS1B(Chenopodiumquinoa，ACN66494.1)、鹽地堿蓬SsSOS1(Suaedasalsa，AHJ14584.1)、冰葉日中花McSOS1(Mesembryanthemumcrystallinum，ABN04858.1)、菠菜SoSOS1(Spinaciaoleracea，CDL70805.1)和大葉補(bǔ)血草LgSOS1(Limoniumgmelinii，ACF05808.1)的氨基酸序列都具有較高同源性，與同一科的長(zhǎng)葉紅沙Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)tSOS1的同源性最高，達(dá)92%，和其他植物的質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也有較高的同源性，同源性在70%～73%(圖3)。

對(duì)不同植物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的遺傳關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4)，結(jié)果顯示ThSOS1與質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親緣關(guān)系較近，而與液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明ThSOS1為剛毛檉柳的一個(gè)質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

圖1 剛毛檉柳ThSOS1基因cDNA序列及其推測(cè)的氨基酸序列Fig.1 ThSOS1 nucleotide sequence and deduced amino acid sequence in T.hispida

圖2 剛毛檉柳ThSOS1蛋白的生物信息學(xué)分析 A.疏水性分析；B.跨膜結(jié)構(gòu)分析；C.二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Bioinformatics analysis of ThSOS1 protein in T.hispida A. Hydrophobicity analysis; B. Transmembrane structure prediction; C. Secondary structure prediction

2.4 ThSOS1基因在脅迫條件下的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步了解ThSOS1對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)情況，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)NaCl和PEG脅迫下檉柳ThSOS1的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。

在NaCl脅迫下，ThSOS1在根部和地上部組織中的表達(dá)模式相似。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，ThSOS1的相對(duì)表達(dá)量都逐漸上升，并在脅迫24 h后達(dá)到最高峰，48 h后逐漸下降。其中，ThSOS1在地上部組織中的相對(duì)表達(dá)量變化較大，在24 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量是正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的22倍。

與NaCl脅迫下的表達(dá)模式相似，PEG脅迫下ThSOS1在檉柳的根部和地上部都被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。其中，根中的相對(duì)表達(dá)量在脅迫12 h后達(dá)到一個(gè)小的峰值，之后略有下降；在脅迫48 h時(shí)又逐漸增加，并在72 h時(shí)表達(dá)量上升到最高水平。ThSOS1在地上部的表達(dá)模式與根部相似，在脅迫9 h達(dá)到一個(gè)小高峰，之后下降，24 h迅速上升，在48 h達(dá)到峰值。另外，從圖2中還可以明顯看出高鹽和干旱脅迫下ThSOS1在檉柳的根部和地上部均是上調(diào)表達(dá)，且在地上部的相對(duì)表達(dá)量顯著高于根。這些結(jié)果表明了ThSOS1可能在剛毛檉柳的耐鹽抗旱機(jī)制中具有重要作用，并且主要在葉和莖中發(fā)揮功能。

3 討論

植物質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⒓?xì)胞質(zhì)中過(guò)多的Na+排出胞外,從而減輕Na+對(duì)細(xì)胞代謝活動(dòng)及細(xì)胞器的破壞,使植物更好地適應(yīng)鹽漬生境[17～18]。因此，質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物耐鹽性方面具有重要作用。已有研究表明，絕大多數(shù)植物質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為3 410～3 500 bp，編碼1 129～1 169個(gè)氨基酸殘基，推測(cè)分子量均為127 kDa左右[19～21]。本研究首次從剛毛檉柳中克隆到了Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ThSOS1，預(yù)測(cè)分析表明其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)3 498 bp，編碼1 165個(gè)氨基酸，分子量為128.8 kDa，氨基酸序列包含典型的“Na+/H+Exchanger”結(jié)構(gòu)域，ThSOS1符合Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員的序列特征。亞細(xì)胞定位分析顯示，ThSOS1蛋白定位于質(zhì)膜的概率最大，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析也發(fā)現(xiàn)ThSOS1與質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親緣關(guān)系最近，而與液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明ThSOS1為質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在剛毛檉柳的耐鹽反應(yīng)中介導(dǎo)Na+的外排來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明ThSOS1包含有10個(gè)完全跨膜結(jié)構(gòu)域，與已報(bào)道的動(dòng)植物和微生物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜區(qū)域數(shù)(10～12)一致，跨膜區(qū)氨基酸序列與其他植物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間存在很高的相似性,表明跨膜區(qū)是高度保守的。ThSOS1蛋白的C末端有一個(gè)較長(zhǎng)的親水性區(qū)域，使SOS1能夠與其它逆境相關(guān)調(diào)控因子發(fā)生互作,從而適應(yīng)鹽漬環(huán)境[22]。

圖3 剛毛檉柳ThSOS1與其他植物SOS1同源序列的比較Fig.3 Comparison of ThSOS1 in T.hispida with other plant SOS1 genes

圖4 幾種植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析 CqSOS1B.藜麥(ACN66494.1)；SoSOS1.菠菜(CDL70805.1)；SsSOS1.鹽地堿蓬(AHJ14584.1)；McSOS1.冰葉日中花(ABN04858.1)；SpSOS1.海馬齒(AFX68848.1)；RtSOS1.長(zhǎng)葉紅沙(AGW30208.1)；LgSOS1.大葉補(bǔ)血草(ACF05808.1)；AtNHX1.擬南芥(NP_198067.1)；SeNHX1.鹽角草(AAN08157.1)；ZxNHX1.霸王(ABU92562.1)；PeNHX1.胡楊(ABY86892.1)Fig.4 Phylogenetic tree analysis of Na+/H+ antiporters from various plant species CqSOS1B. Chenopodium quinoa(ACN66494.1)；SoSOS1. Spinacia oleracea(CDL70805.1)；SsSOS1. Suaeda salsa(AHJ14584.1)；McSOS1. Mesembryanthemum crystallinum(ABN04858.1)；SpSOS1. Sesuvium portulacastrum(AFX68848.1)；RtSOS1. Reaumuria trigyna(AGW30208.1)；LgSOS1. Limonium gmelinii(ACF05808.1)；AtNHX1. Arabidopsis thaliana(NP_198067.1)；SeNHX1. Salicornia europaea(AAN08157.1)；ZxNHX1. Zygophyllum xanthoxylum(ABU92562.1)；PeNHX1. Populus euphratica(ABY86892.1)

圖5 ThSOS1基因在不同脅迫下的表達(dá)模式分析Fig.5 Expression analysis of ThSOS1 gene under several abiotic stresses

不同脅迫處理下，植物中的SOS1基因的表達(dá)模式有所差異。Shi等發(fā)現(xiàn)擬南芥AtSOS1在鹽脅迫下表達(dá)量明顯提高，而在冷脅迫和外源ABA處理下表達(dá)卻沒(méi)有顯著變化[11]；與對(duì)照組相比，水稻OsNHA1受鹽脅迫誘導(dǎo)顯著表達(dá)，而干旱處理則沒(méi)有明顯變化[23]；NaCl脅迫處理下，小麥TaSOS1的表達(dá)水平顯著增加,但PEG處理無(wú)誘導(dǎo)作用[24]。Song等研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫可以誘導(dǎo)大島野路菊CcSOS1上調(diào)表達(dá)，干旱、低溫和ABA處理也對(duì)CcSOS1的表達(dá)產(chǎn)生了不同程度的影響[25]。本研究中，在NaCl和PEG脅迫處理后，ThSOS1基因在檉柳的根部和地上部的表達(dá)量均明顯增加，特別是在地上部組織中，ThSOS1基因在脅迫12 h后持續(xù)保持高豐度的表達(dá)。ThSOS1基因能對(duì)干旱和高鹽脅迫做出響應(yīng)，表明其可能參與檉柳的抗旱耐鹽過(guò)程。ThSOS1在檉柳地上部的表達(dá)量明顯高于根部，推測(cè)其可能參與檉柳葉片中的Na+通過(guò)韌皮部向老葉的轉(zhuǎn)移，或者能夠促進(jìn)Na+從其葉片鹽腺中的分泌，但該基因在檉柳抗逆反應(yīng)中的具體功能及其參與抗逆的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。植物的耐鹽性是一個(gè)復(fù)雜數(shù)量性狀，是多基因相互作用的結(jié)果。然而有研究表明，轉(zhuǎn)單一的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因能夠明顯地提高作物的耐鹽能力。擬南芥AtSOS基因轉(zhuǎn)化擬南芥后使其過(guò)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)的Na+含量明顯降低，耐鹽能力也顯著增強(qiáng)[12]。Yue等發(fā)現(xiàn)擬南芥AtSOS1基因轉(zhuǎn)入番茄后，提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力[26]。將星星草基因PtNHA1轉(zhuǎn)入擬南芥中，PtNHA1過(guò)表達(dá)后能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，還能消除活性氧的毒害作用，提高抗氧化能力[27]。這些研究表明利用轉(zhuǎn)化SOS1基因提高植物的耐鹽能力，是利用基因工程方法培育耐鹽植物新品種的一種有效途徑[26～28]。迄今為止，對(duì)植物中質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究主要集中在草本植物中，對(duì)木本植物的研究較少。木本植物與草本植物在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特性上都有一定的區(qū)別[29]，木本植物體與草本植物的質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否具有相似功能尚不清楚。因此，了解ThSOS1的功能將為木本植物的耐鹽機(jī)理的研究提供有價(jià)值的參考，同時(shí)為林木抗逆育種提供有效的基因資源和理論依據(jù)。目前，ThSOS1的植物表達(dá)載體構(gòu)建正在進(jìn)行中，后續(xù)將對(duì)擬南芥和剛毛檉柳進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，對(duì)ThSOS1的功能及其活性調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。

1.Tester M,Davenport R.Na+tolerance and Na+transport in higher plants[J].Annals of Botany,2003,91(5):503-527.

2.楊月紅,孫慶艷,沈浩.植物的鹽害和抗鹽性[J].生物學(xué)教學(xué),2002,27(11):1-2.

3.Wang Q,Li X,Zhang H,et al.Overexpression of Na+/H+antiporter gene(nhaA) improves salt tolerance in soybean[J].Molecular Plant Breeding,2010,8(4):701-707.

4.Blumwald E,Aharon G S,Apse M P.Sodium transport in plant cells[J].Biochim Biophys Acta,2000,1465(1-2):140-151.

5.張樺,張富春,張雨良,等.新牧一號(hào)雜花苜蓿MvNHX1基因的表達(dá)分析和提高煙草耐鹽性的研究[J].植物研究, 2011,31(5):550-557.

6.Ratner A,Jacoby B.Effect of K+,its counter anion,and pH on sodium efflux from Barley roots[J].Exp Physiol,1976,148:425-433.

7.Blumwald E,Poole R.Na+/H+antiport in isolated tonoplast vesicles from storage tissue ofBetavulgaris[J].Plant Physiol,1985,78(1):163-167.

8.Apse M,Aharon G,Snedden W,et al.Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+antiporter inArabidopsis[J].Science,1999(285):1256-1258.

9.Martínez-Atienza J1,Jiang X,Garciadeblas B,et al.Conservation of the salt overly sensitive pathway in rice[J].Plant Physiol,2007,143(2):1001-12.

10.Zhang H,Blumwald E.Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit[J].Nature Biotechnology,2001,19:765-768.

11.Zhang H X,Hodson J N,Williams J P,et al.Engineering salt-tolerantBrassicaplants:characterization of yield and seed oil quality in transgenic plants with increased vacuolar sodium accumulation[J].Proc Natl Acad Sci,2001,98:12832-12836.

12.Shi H,Ishitani M,Kim C,et al.TheArabidopsisthalianasalt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na+/H+antiporter[J].Proc Natl Acad Sci,2000,97(12):6896-6901.

13.Shi H,Lee B,Wu S,et al.Overexpression of a plasma membrane Na+/H+antiporter gene improves salt tolerance inArabidopsisthaliana[J].Nature Biotechnology,2003,21(1):81-85.

14.Wu C A,Yang G D,Meng Q W.The cottonGhNHX1 gene encoding a novel putative tonoplast Na+/H+antiporter plays an important role in salt stress[J].Plant and Cell Physiol,2004,45:600-607.

15.楊維康,張道遠(yuǎn),張立運(yùn),等.新疆主要檉柳屬植物(TamarixL.)的生態(tài)類型劃分與生境相似性研究[J].干旱區(qū)地理,2004,27(2):186-192.

16.Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

17.Zhu J.Salt and drought stress signal transduction in plants[J].Annu Rev Plant Biol,2002,53:247-273.

18.Munns R,Tester M.Mechanisms of salinity tolerance[J].Annu Rev Plant Biol,2008,59:651-681.

19.馬清,包愛(ài)科,伍國(guó)強(qiáng),等.質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與植物耐鹽性[J].植物學(xué)報(bào),2011,46(2):206-215.

20.Pardo J M,Quintero F J.Plants and sodium ions:keeping company with the enemy[J].Genome Biol,2002,3(6):1-4.

21.Cosentino C,Fischer-Schliebs E,Bertl A,et al.Na+/H+antiporters are differentially regulated in response to NaCl stress in leaves and roots ofMesembryanthemumcrystallinum[J].New Phytol,2010,186(3):669-680.

22.Zhu J.Genetic analysis of plant salt tolerance usingArabidopsis[J].Plant Physiol,2000,124:941-948.

23.Martinez-Atienza J,Jiang X,Garciadeblas B,et al.Conservation of the Salt Overly Sensitive Pathway in Rice[J].Plant Physiol,2007,143(2):1001-1012.

24.Xu H,Jiang X,Zhan K,et al.Functional characterization of a wheat plasma membrane Na+/H+antiporter in yeast[J].Arch Biochem Biophys,2008,473(1):8-15.

25.Song A,Lu J,Jiang J,et al.Isolation and characterisation ofChrysanthemumcrassumSOS1,encoding a putative plasma membrane Na+/H+antiporter[J].Plant Biol,2012,14:706-713.

26.Yue Y,Zhang M,Zhang J,et al.SOS1 gene overexpression increased salt tolerance in transgenic tobacco by maintaining a higher K+/Na+ratio[J].J Plant Physiol,2012,169(3):255-261.

27.Wang X,Yang R,Wang B,et al.Functional characterization of a plasma membrane Na+/H+antiporter from alkali grass(Puccinelliatenuiflora)[J].Mol Biol Rep,2011,38(7):4813-4822.

28.鄭琳琳,張慧榮,賀龍梅,等.唐古特白刺質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與表達(dá)分析[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2013,22(4):179-186.

29.宋鑫,董京祥,李開(kāi)隆,等.檉柳中一種新型硫氧還蛋白H基因的克隆與鑒定[J].植物研究,2015,35(3):340-346.

CloningandExpressionAnalysisofaPlasmaMembraneNa+/H+AntiporterGeneinTamarixhispida

JIA Yuan-Yuan ZHANG Chun-Rui WANG Yu-Cheng YANG Chuan-Ping WANG Chao*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

A full length cDNA of a Na+/H+antiporter gene (namedThSOS1) gene was isolated from the transcriptome cDNA librarys ofTamarixhispida.ThSOS1 was 3 917 bp in length, including an open reading frame of 3 498 bp which was predicted to encode a polypeptide of 1 165 amino acids. The estimated molecular weight and isoelectric point of the putative protein were 128.8 kDa and 6.42, respectively. By hydrophobic cluster analysis,ThSOS1 contained 10 potential transmembrane domains within the N- terminal protion and a long hydrophilic cytoplasmic tail in the C-terminal protion. By multiple sequence alignment,ThSOS1 show 92%, 73%, and 72% identities in amino acid sequence to plasma membrane Na+/H+antiporter genes fromReaumuriatrigyna,ChenopodiumquinoaandSuaedasalsa. By phylogenetic analysis,ThSOS1 was more related to the plasma membrane-type Na+/H+antiporter and clustered distantly with the vacuolar-typed Na+/H+antiporter. By quantitative real-time PCR assay, the mRNA levels ofThSOS1 was significantly up-regulated inT.hispidaunder NaCl and PEG treatments. Therefore,ThSOS1 might play an important role in salt and drought tolerance ofT.hispida.

Tamarixhispida;Na+/H+antiporter;stress responses;gene expression

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31300571)；教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(20130062120012)

賈園園(1988—)，女，碩士研究生，主要從事林木抗逆機(jī)理研究。

* 通信作者：E-mail:wzyrgm@163.com

2015-11-13

S793.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.010