鄭堅(jiān)強(qiáng),侯建光,2,時(shí)錦錦,趙　楠,彭新榜,司俊玲

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450002；2.河南仰韶酒業(yè)有限公司,河南澠池 472400)

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降解β-胡蘿卜素雙加氧酶的分離純化及其部分酶學(xué)性質(zhì)

鄭堅(jiān)強(qiáng)1,侯建光1,2,時(shí)錦錦1,趙楠1,彭新榜1,司俊玲1

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450002；2.河南仰韶酒業(yè)有限公司,河南澠池 472400)

研究了西方許旺酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生雙加氧酶的分離純化及其酶學(xué)特性,并利用該酶降解β-胡蘿卜素生成香味物質(zhì)。通過搖瓶發(fā)酵,并對(duì)粗酶液進(jìn)行硫酸銨梯度沉淀、半透膜透析、DEAE-Sepharose離子交換和Sephadax G-100凝膠過濾等處理,得到轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素生成香氣物質(zhì)的雙加氧酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,西方許旺酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的雙加氧酶被純化了36.43倍,酶活力回收率為21.0%,分子量為55.0 ku。酶的最適溫度為40 ℃,最適pH為8.5；金屬離子對(duì)降解β-胡蘿卜素雙加氧酶活力的影響為:Fe2+>Mg2+>K+>Na+>Mn2+>Cu2+>Ca2+>Zn2+>Ag+。Fe2+和Mg2+能明顯增強(qiáng)酶活力,而Zn2+和Ag+能抑制酶活力；SDS和胃酶抑素對(duì)酶活力有顯著抑制作用。降解β-胡蘿卜素雙加氧酶的Km=8.24×10-4mol/L,Vmax=2.16×10-4mol/(min·mg)。

西方許旺酵母,雙加氧酶,分離純化,酶學(xué)性質(zhì)

類胡蘿卜素是鏈狀或環(huán)狀含有8個(gè)異戊間二烯單位、四萜烯類頭尾連接而成的多異戊間二烯化合物,是一類不溶于水的色素,存在于植物和有光合作用的細(xì)菌中,在光合作用過程中起輔助色素的作用,其中β-胡蘿卜素和番茄紅素是常見的類胡蘿卜素[1-2]。類胡蘿卜素經(jīng)過降解可以產(chǎn)生β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和β-環(huán)檸檬醛等化合物,這些化合物具有花香和果香的風(fēng)味[3-5],閾值低,呈現(xiàn)花香味的β-紫羅酮和β-大馬酮的特征閾值在水中分別為0.007 g/L和0.009 g/L[6],是潛在高效的風(fēng)味化合物[7-9],因此,在香精香料行業(yè)引起了極大的關(guān)注。其中,β-紫羅蘭酮香料的添加可增加食品的風(fēng)味；β-大馬酮,β-二氫大馬酮和β-紫羅蘭酮等化合物對(duì)玫瑰精油中的香味起主要作用。目前,在香精香料的行業(yè),研究熱點(diǎn)是通過真菌等微生物以及添加酶使類胡蘿卜素降解,利用生物技術(shù)生產(chǎn)這類揮發(fā)性化合物[10]。

近幾年,已經(jīng)開展了降解類胡蘿卜素生成香氣物質(zhì)的雙加氧酶相關(guān)研究。文獻(xiàn)中提取制備方案不同,得到的雙加氧酶產(chǎn)物各異。Peter Fleischmanna等[11]通過裂解楊桃皮胡蘿卜素得到了分子量為12～98 ku較純的酶。Zorn H等[6]發(fā)現(xiàn)食用菌類Pleurotus eryngii上有降解β-胡蘿卜素生成單一、倍半、三倍和四萜烯等產(chǎn)物的過氧化物酶。Manuela S等[12]對(duì)擔(dān)子菌Marasmiusscorodonius(大蒜蘑菇)進(jìn)行培養(yǎng),分離純化得到了高效降解β-胡蘿卜素的胞外酶MsP1和MsP2。Thomas B等[13]研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉中植物抗毒素中的類胡蘿卜素裂解氧化酶能夠斷裂類胡蘿卜素中Cα-Cβ的雙鍵,并對(duì)該氧化酶進(jìn)行了純化和定性分析。雙加氧酶來源廣泛,其中由微生物產(chǎn)生的氧化酶(雙加氧酶)可裂解β-胡蘿卜素生成β-紫羅蘭酮等香味物質(zhì)化合物。不同微生物產(chǎn)生的雙加氧酶的組成不同,造成雙加氧酶對(duì)底物作用的效果不一,導(dǎo)致酶解效率不同,致使香味物質(zhì)產(chǎn)量差別大。因此,只有得到純酶,才能研究酶解類胡蘿卜素生成香味物質(zhì)降解機(jī)制、分析雙加氧酶分子結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)以一株具有潛在應(yīng)用價(jià)值的西方許旺酵母菌(Schwanniomycesoccidentalis)為研究對(duì)象,對(duì)其發(fā)酵粗酶液進(jìn)行硫酸銨梯度沉淀、半透膜透析、DEAE-Sepharose離子交換和Sephadax G-100凝膠過濾等處理,以得到轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素生成香氣物質(zhì)的雙加氧酶,同時(shí)對(duì)雙加氧酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,為該酶在香精香料工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)行前期探索工作。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

西方許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；DEAE SePharose FastFlowAmersham Bioseienees公司；Sephadax G-100Amersham Bioseienees公司；BCA、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白上海生物化學(xué)研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；發(fā)酵培養(yǎng)基10 g/L葡萄糖、11 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、瓊脂粉20 g/L、0.2 g/L FeSO4、0.45 g/L MgSO4·7H2O、3.0 g/L NaNO3、0.5 g/L KCl,121 ℃,滅菌20 min。

AKTA FPLC層析系統(tǒng)DEAE Sepharose Fast Flow離子交換,GE Healthcare公司；Sephadax G-100凝膠過濾柱GE Healthcare公司；TU-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器深圳天南海北有限公司；MicroCL17型冷凍高速離心機(jī)美國熱電公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Gel Doe 1000型凝膠成像儀美國Bio-RAD公司；Veriti 96-Well Thermal Cycler型熒光定量PCR儀美國Applied Systems公司；LyoLab3000型凍干機(jī)Thermo Fisher Heto公司；超低溫冰箱SANYO公司；HH-B11-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；PHS-3C型精密酸度計(jì)上海大普儀器有限公司；HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；電泳儀Alllersham Bioseienees公司；電泳槽Amersham Bioseienees公司等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵液的制備將西方許旺酵母菌(Schwanniomycesoccidentalis)在培養(yǎng)基中活化兩次(避光,28 ℃,培養(yǎng)48 h),使菌體生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,接入150 mL液體種子培養(yǎng)基中,28 ℃振蕩培養(yǎng)72 h,按5%的接種量接入盛有5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)5 d(避光,28 ℃,160 r/min)。反應(yīng)結(jié)束后,使用布氏漏斗過濾發(fā)酵液,離心(10000 r/min,20 min)取上清液,濾紙過濾,收集濾液。

1.2.2硫酸銨分級(jí)沉淀過濾后的發(fā)酵液,在1000 r/min下離心10 min后得粗酶液,向粗酶液中分別加硫酸銨粉末至濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%。4 ℃下靜置過夜后,在10000 r/min,4 ℃條件下離心20 min,取上清液測(cè)定酶活力,以酶活力為指標(biāo)來確定硫酸銨的飽和濃度。

1.2.3透析將鹽析所得的粗酶加入預(yù)先處理好的透析袋中,粗酶液占透析袋的2/3,空氣排凈,兩端封閉,放入磷酸緩沖溶液(pH7.4)中在4 ℃下透析,每隔6 h更換緩沖溶液一次,透析24～48 h,同時(shí)檢測(cè)脫鹽情況,直至外界溶液的pH、電導(dǎo)率與平衡緩沖液一致為止。

1.2.4DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析

1.2.4.1DEAE Sepharose Fast Flow離子交換洗脫pH的選擇在pH3～10范圍內(nèi)，采用Pharmacia的Test-tube實(shí)驗(yàn)法初步確定等電點(diǎn)未知蛋白質(zhì)進(jìn)行陰離子交換所選擇的緩沖體系pH。吸取3 mL經(jīng)該低溫透析脫鹽的酶液于相應(yīng)pH的緩沖液中,作用15 min后,分別吸取上清液測(cè)定酶活力。

1.2.4.2DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析首先DEAE-Sepharose-F.F.離子交換柱(1.0 cm×20 cm)用含有0.5 mol/L NaCl緩沖溶液平衡,以3.0 mL/min的速度洗脫3個(gè)柱體積,直至流出液的pH與緩沖液相同。然后將經(jīng)過透析后的酶液上樣于預(yù)裝好的DEAE-Sepharose-F.F.離子交換柱,然后在4 ℃溫度下,用0.5 mol/L的NaCl鹽溶液以2.0 mL/min流速進(jìn)行線性洗脫。自動(dòng)分步收集儀每3 mL收集一管洗脫液,同時(shí)采用考馬斯亮蘭法在280 nm和450 nm處分別檢測(cè)每管洗脫液的蛋白含量及酶活力,并收集具有酶活力的組分。將收集的酶液透析后4 ℃保存?zhèn)溆肹14]。

1.2.5Sephadax G-100凝膠過濾離子交換得到的組分經(jīng)離心(10000 r/min)20 min后,上樣到預(yù)先用0.2 mol/L NaCl、pH6.5的0.04 mol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液平衡的Sephadax G-100層析柱(1.6 cm×70 cm)上,用同樣的緩沖液洗脫,洗脫流速為1.0 mL/min,按3 mL/管收集。同時(shí)檢測(cè)每管洗脫液的蛋白含量及酶活力,并收集具有酶活力的組分,于4 ℃保存。

1.2.6酶活力測(cè)定取5 mL酶液(提前在37 ℃水浴中保溫)并加入500 μLβ-胡蘿卜素儲(chǔ)備液,加入光程1 cm的玻璃比色皿中,以未加β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液的粗酶液作對(duì)照,立刻在450 nm處測(cè)其吸光值,測(cè)完后立即在37 ℃避光水浴,每隔1 min測(cè)定一次吸光度。酶活力單位定義:在37 ℃,pH6.5,每分鐘降解1 μmolβ-胡蘿卜素所需的酶量為一個(gè)單位。

降解率=(原有β-胡蘿卜素含量-現(xiàn)有β-胡蘿卜素含量)/原有β-胡蘿卜素含量

酶活力=(C0-Ct)×(5.0+0.5)/5.0×t

其中:C0-初始β-胡蘿卜素含量(μmol/L)；Ct-t min后β-胡蘿卜素含量(μmol/L)；t-為時(shí)間(min)。

1.2.7蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用考馬斯亮蘭法檢測(cè)[15]。

1.2.8SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳酶純度的鑒定:采用SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法進(jìn)行[16]。

降解β-胡蘿卜素雙加氧酶分子量的測(cè)定:采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)降解β-胡蘿卜素雙加氧酶分子量。將樣品及已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。以分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn),5%濃縮膠,電壓80 V下電泳約30 min后,樣品進(jìn)入分離膠,于12.5%分離膠中120 V電壓下電泳約3 h。電泳完畢后,經(jīng)染色、脫色,掃描得圖片,根據(jù)純酶樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的SDS-PAGE電泳圖測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移率Rf值,得出純酶的分子量大小[17]。

1.2.9降解β-胡蘿卜素雙加氧酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.9.1溫度對(duì)降解β-胡蘿卜素雙加氧酶活力的影響量取1 mL 0.01%的β-類胡蘿卜素溶液于試管中,加入0.5 mL緩沖液搖勻,在25～60 ℃的恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min,再加入稀釋酶液各1 mL,反應(yīng)60 min,測(cè)定酶活力。將稀釋酶液置于30～60 ℃不同溫度下的恒溫水浴鍋中,每隔60 min,立即測(cè)定殘余酶活力。

1.2.9.2pH對(duì)降解β-胡蘿卜素雙加氧酶活力的影響配制緩沖液有NaHPO4-檸檬酸緩沖液(pH2.6～7.6)、硼砂-硼酸緩沖液(pH7.4～8.0)和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH8.6～10.6)。將濃縮后純酶液分別用0.05 mol/L的不同緩沖液稀釋,置于4 ℃保存60 min,測(cè)定酶活力,分析pH對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的影響。將酶分別在不同pH的緩沖液中,4 ℃下放置5 h,取1 mL酶液加入1 mLβ-類胡蘿卜素溶液,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH,測(cè)定酶活力。

1.2.9.3金屬離子對(duì)降解β-胡蘿卜素雙加氧酶活力的影響在最適溫度40 ℃,最適pH8.5,反應(yīng)15 min,β-類胡蘿卜素底物濃度1.0×10-4g/L的反應(yīng)體系中,分別加入終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L的Fe2+、Mg2+、K+、Na+、Mn2+、Cu2+、Ca2+、Zn2+和Ag+9種金屬鹽離子,于4 ℃下,混合后放置60 min,測(cè)定不同離子對(duì)酶活力的影響?？瞻讓?duì)照組為加同等體積蒸餾水的雙加氧酶液,以空白組酶活力為100%,研究金屬離子對(duì)相對(duì)酶活力的影響。

1.2.9.4蛋白抑制劑對(duì)降解β-胡蘿卜素雙加氧酶的酶活力影響將乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、碘乙酰胺、PMSH以及胃酶抑素等蛋白抑制劑分別以1 mmol/L和5 mmol/L的濃度(除胃酶抑素濃度為0.0025、0.001 mmol/L)與純化蛋白酶混合,4 ℃放置60 min,測(cè)定剩余酶活力。加同等體積蒸餾水的雙加氧酶酶液為對(duì)照,根據(jù)酶的活性,研究蛋白抑制劑對(duì)酶活力的影響。

1.2.9.5降解β-類胡蘿卜素的雙加氧酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)經(jīng)反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn),調(diào)節(jié)反應(yīng)底物β-類胡蘿卜素的濃度為0.3×10-4～6×10-4g/L,按1.2.6方法測(cè)定酶活力。根據(jù)Lineweaver-Burk作圖法,求出酶的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0軟件處理；Duncan’s多重比較。處理是在相同濃度下進(jìn)行差異顯著性比較。

2　結(jié)果與討論

2.1粗酶硫酸銨分級(jí)沉淀

硫酸銨分級(jí)沉淀降解β-類胡蘿卜素雙加氧酶粗酶變化情況,如圖1所示。

圖1　硫酸銨沉淀上清液酶活力及蛋白質(zhì)相對(duì)含量變化曲線Fig.1　Effect of ammonium sulphate content on the dioxygenase activity and proteincontent of filtrate after precipitation

由圖1可見,在硫酸銨濃度為20%～50%時(shí),降解β-胡蘿卜素雙加氧酶沉淀較慢,這一飽和范圍內(nèi)酶蛋白損失不大；在硫酸銨濃度為60%～90%時(shí),β-胡蘿卜素裂解雙加氧酶沉淀迅速,可以認(rèn)為此時(shí)已基本完全沉淀。硫酸銨濃度為50%時(shí),上清液中β-胡蘿卜素雙加氧酶酶活力為0.78U/mL；而濃度為60%時(shí),酶活力為0.42 U/mL,繼續(xù)提高硫酸銨濃度到70%時(shí),上清液中酶活力為0.31 U/mL,而繼續(xù)提高硫酸銨濃度達(dá)90%時(shí),上清液中酶活力為0.13 U/mL,明顯低于硫酸銨濃度60%時(shí)上清液的酶活力。因此,實(shí)驗(yàn)選用60%濃度硫酸銨進(jìn)行沉淀。

2.2DEAE Sepharose Fast Flow離子交換洗脫液pH的選擇

采用不同pH離子交換洗脫液進(jìn)行洗脫,確定離子交換的最佳pH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2　降解β-胡蘿卜素雙加氧酶DEAE Sepharose F.F.離子交換洗脫液pH確定Fig.2　pH selection of elution bufferfor dioxygenase on DEAE Sepharose F.F.

通過控制洗脫緩沖液的pH大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),而使目的蛋白帶上陰離子,再通過增加離子強(qiáng)度的方法將其洗脫下來,達(dá)到陰離子交換的目的。從圖2可以看出,上清液酶活力呈逐漸下降趨勢(shì),pH≥6.5時(shí),上清液中只含有少量的降解β-胡蘿卜素雙加氧酶,大部分酶蛋白因帶上陰離子被DEAE Sepharose F.F.凝膠所吸附。故選擇pH6.5的緩沖體系作為裂解β-胡蘿卜素雙加氧酶純化所用的洗脫液。

2.3DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析

將硫酸銨分級(jí)沉淀后的酶液,經(jīng)過透析后,取酶液5 mL上樣,采用DEAE Sephaorse F.F.層析柱對(duì)降解β-類胡蘿卜素雙加氧酶酶液進(jìn)行分離,結(jié)果如圖3所示。

圖3　降解β-胡蘿卜素雙加氧酶的DEAE-Sepharose-F.F層析圖Fig.3　Chromatogram of dioxygenasefrom Schwanniomyces occidentalis on the DEAE-Sepharose F.F column

表1　降解β-胡蘿卜素雙加氧酶各部分的純化結(jié)果

由圖3中可看出,在整個(gè)洗脫階段出現(xiàn)了兩個(gè)大小不等的蛋白質(zhì)峰。檢測(cè)洗脫液各管的酶活力,結(jié)果顯示第4到10管酶活力較高,并收集第4到第10管洗脫組分,進(jìn)行下一步過濾提純。

2.4Sephadax G-100凝膠過濾層析

由圖4結(jié)果可知18～63管在280 nm處有蛋白峰。收集有酶活性的21～31號(hào)管,測(cè)定峰尖酶活力1.13 U/mL即為目的組分,收集22～25管洗脫液,再上進(jìn)行透析,于-50 ℃凍干成酶粉,做電泳檢測(cè)備用。

圖4　裂解β-胡蘿卜素雙加氧酶的Sephadax G-100凝膠色譜圖Fig.4　Chromatogram of dioxygenase from Schwanniomyces occidentalis on Sephadax G-100 column

經(jīng)DEAE-Sephaorse-F.F.層析純化的酶液通過葡聚糖凝膠層析柱,各個(gè)組分由于分子量不相同在凝膠柱上受到的阻滯作用不同,而在層析柱中以不同的速度移動(dòng),大分子蛋白質(zhì)及一些蛋白復(fù)合物則被阻擋在外。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同,利用分級(jí)分離而達(dá)到純化的目的。從圖4可以看出,在整個(gè)洗脫過程中,出現(xiàn)了一個(gè)明顯的蛋白峰,說明洗脫效果好,并進(jìn)一步說明,采用Sephadax G-100層析柱可除去經(jīng)DEAE-Sephaorse-F.F.層析純化的酶液中的大部分雜蛋白。

2.5雙加氧酶純化過程中總蛋白及酶活力的變化情況

從表1可以看出,在分離純化過程中雙加氧酶被純化了36.43倍,酶活力回收率為21.00%。在降解β-胡蘿卜素雙加氧酶的純化過程中,經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀以及DEAE-Sepharose F.F.柱層析和Sephadax G-100柱層析后的逐級(jí)分離后,雙加氧酶的酶液得到了純化,效果較好。

從表1看出,酶活力回收率(21.0%)較低,造成酶產(chǎn)率不高的原因是在各步分離純化的過程中,不可避免的有一部分酶活力的損失。此外酶是一種生物活性分子,酶液中蛋白組分多,相互之間可能發(fā)生作用也是造成不穩(wěn)定的因素。DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析純化過程中,有待進(jìn)一步研究沖洗溶質(zhì)緩沖溶液的pH,調(diào)節(jié)電荷間的相互作用,平衡雜蛋白離子與結(jié)合能力,使雜蛋白吸附在離子交換層析柱上；尤其是在Sephadax G-100凝膠過濾層析純化期間,在截留大分子雜質(zhì)的過程中,大分子也攜帶一部分酶截留在層析柱中網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上,從而造成酶蛋白的損失。在層析純化的過程中,應(yīng)將檢測(cè)有活性的酶液管全部收集,最大限度減少酶蛋白的損失,但是這樣操作,會(huì)造成雜蛋白含量增加,導(dǎo)致酶蛋白純化難度增加。

2.6SDS-PAGE電泳結(jié)果

從圖5的SDS-PAGE電泳可以看出,經(jīng)過純化后,得到的降解β-類胡蘿卜素雙加氧酶的電泳圖譜,電泳結(jié)果表明純化后的樣品只有一條帶,達(dá)到電泳純水平。根據(jù)純酶與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移率Rf值的對(duì)比可知,降解β-胡蘿卜素雙加氧酶的分子質(zhì)量約為55.0 ku。Peter Fleischmanna等從楊桃皮上分離并經(jīng)純化得到的降解胡蘿卜素酶的分子量為50.0 ku[11]。由于降解菌株和實(shí)驗(yàn)材料不同,得到的降解β-胡蘿卜素雙加氧酶的分子量有所不同。

圖5　降解β-胡蘿卜素雙加氧酶SDS-PAGEFig.5　SDS-PAGE of dioxygenase purifiedfrom of Schwanniomyces occidentalis

2.7降解β-胡蘿卜素雙加氧酶酶學(xué)特性

2.7.1溫度對(duì)降解β-胡蘿卜素雙加氧酶的影響溫度對(duì)降解β-胡蘿卜素雙加氧酶結(jié)果,見圖6所示。

圖6　酶的最適溫度Fig.6　Optimum temperature of the enzyme

從圖6可知,在25～40 ℃范圍內(nèi),雙加氧酶酶活力隨溫度升高而增加；而在40～60 ℃,酶活力隨溫度升高則迅速減小。由此可確定在實(shí)驗(yàn)研究范圍內(nèi),雙加氧酶的最適溫度為40 ℃,此時(shí)酶活力為0.86 U/mL。當(dāng)溫度大于40 ℃,酶活力迅速下降,50 ℃以上時(shí),酶活力下降不明顯。

2.7.2pH對(duì)降解β-胡蘿卜素雙加氧酶的影響酶的活性部位與底物的接近和結(jié)合情況,是通過酶液pH影響酶蛋白的構(gòu)象,以及酶與底物的電荷性質(zhì)而達(dá)到的。酶作為一種兩性電解質(zhì),在不同的pH條件下其分子的活性基團(tuán)會(huì)以不同的解離狀態(tài)存在,通常只有一種解離狀態(tài)最適合酶促反應(yīng)進(jìn)行。從圖7可知,裂解β-胡蘿卜素雙加氧酶在pH8.0～9.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定,酶活力為0.98 U/mL,當(dāng)pH低于8.0時(shí)或高于9.0時(shí),酶活力迅速降低。從圖7得知雙加氧酶最適pH為8.5。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與從Averrhoa carambola水果表皮中分離純化的降解類胡蘿卜素雙加氧酶的最佳pH8.5結(jié)論一致[11]。

圖7　酶的最適pH Fig.7　Optimum pH of the enzyme

2.7.3金屬離子對(duì)降解β-胡蘿卜素雙加氧酶的影響由表2可知,降解β-胡蘿卜素雙加氧酶對(duì)金屬離子很敏感。Fe2+對(duì)重組酶的活性有輕度的激活作用,濃度為5 mmol/L時(shí),酶活力可提高29%左右,1 mmol/L時(shí),提高15%；Mg2+、K+、Na+、Mn2+和Cu2+對(duì)酶均有激活作用,其中Mg2+、K+和Na+使酶活力提高15%。而Zn2+和Ag+對(duì)酶有抑制作用,Ag+的抑制作用最強(qiáng)烈,使酶活力降低15%。

表2　金屬離子對(duì)酶活力的影響

2.7.4抑制劑對(duì)降解β-胡蘿卜素雙加氧酶的影響從表3中可以看出,在濃度為5.0 mmol/L時(shí),碘乙酰胺對(duì)酶活力沒有顯著影響；而PMSH、EDTA和SDS對(duì)酶活力有顯著抑制作用,且抑制作用依次增強(qiáng)。在濃度為1.0 mmol/L時(shí),PMSH和EDTA對(duì)酶活力沒有顯著影響；碘乙酰胺和SDS對(duì)酶活力有顯著抑制作用,且抑制作用依次。胃酶抑素?zé)o論何種濃度,都對(duì)酶活力有顯著抑制作用。胃酶抑素明顯抑制純化酶的活性,表現(xiàn)化純化的酸性蛋白酶活性中心含有天冬氨酸殘基,屬天冬氨酸蛋白酶類。

表3　蛋白抑制劑對(duì)純化的重組酶活力影響

注:同列不同字母代表差異顯著(p<0.05)。

2.7.5酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程實(shí)驗(yàn)中,在37 ℃條件下,測(cè)定雙加氧酶酶活力。按照Lineweaver-Burk作圖法,經(jīng)計(jì)算,得到降解β-類胡蘿卜素雙加氧酶的Km=8.24×10-4mol/L,Vmax=2.16×10-4mol/(min·mg)。

圖8　雙加氧酶的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.8　Enzyme kinetics data of dioxygenase

3　結(jié)論

降解β-胡蘿卜素雙加氧酶粗酶液經(jīng)過濾,硫酸銨分級(jí)沉淀,DEAE-Sepharose F.F.柱層析和Sephadax G-100柱層析后純化后,雙加氧酶被純化了36.43倍,酶活力回收率為21.00%,并得到了電泳純的雙加氧酶。該酶分子量為55.0 ku左右,最適溫度為40 ℃,最適pH為8.5。該雙加氧酶的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明,Fe2+和Mg2+能增強(qiáng)酶活性,而Zn2+和Ag+能抑制酶活性；在5.0 mmol/L下,碘乙酰胺對(duì)純化的重組酶活力沒有顯著影響,而PMSH、EDTA和SDS對(duì)純化的重組酶活力有顯著抑制作用。在1.0 mmol/L下,PMSH和EDTA對(duì)酶活力沒有顯著影響；碘乙酰胺和SDS對(duì)酶活力有顯著抑制作用。胃酶抑素在考察濃度范圍內(nèi),均對(duì)酶活力有顯著抑制作用。本研究為雙加氧酶的工業(yè)應(yīng)用,進(jìn)行了初步探索,積累了相關(guān)研究基礎(chǔ)。

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Purification and characterization of dioxygenase fromSchwanniomycesoccidentalisto biodegradeβ-carotene

ZHENG Jian-qiang1,HOU Jian-guang1,2,SHI Jin-jin1,ZHAO Nan1,PENG Xin-bang1,SI Jun-ling1

(1.School of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China;2.Henan Yangshao Liquor Limited Company,Mianchi 472400,China)

The purification and enzymological characteristics of dioxygenase were studied and the enzyme was used to digest theβ-carotene to produce flavor materials. The dioxygenase was produced by liquid fermentation,ammonium sulphate precipitation,membrane dialysis,DEAE-Sepharose fast flow ion exchange chromatography and gel filtration chromatography(G-100). The results were concluded that the purity of the dioxygenase produced bySchwanniomycesoccidentaliswas increased for 36.43 times,the recovery of the enzymatic activity was 21% and its molecular mass was 55.0 ku. The optimal temperature and pH for the purified dioxygenase were 40℃ and 8.5 repectively. The effect of metal ions on dioxygenase activity was with the following order: Fe2+>Mg2+>K+>Na+>Mn2+>Cu2+>Ca2+>Zn2+>Ag+.Fe2+and Mg2+had a strongpositive effect on the enzyme,however Zn2+and Ag+had a negative influence on the enzyme. The purified dioxygenase was inhibited by SDS and pepstatin. Dynamic studies demonstrated that the Kmand Vmaxof the enzyme was 8.24×10-4mol/L and 2.16×10-4mol/(min·mg)respectively.

Schwanniomycesoccidentalis;dioxygenase;isolation and purification；enzymological characteristics

2015-12-22

鄭堅(jiān)強(qiáng)(1976-),男,博士,副教授,主要從事食品生物技術(shù)方面的研究,E-mail:jqzheng76@126.com。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31571778)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目計(jì)劃(15A550007)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0195-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.030