劉占軍,崔成龍,2,李志威,耿旭芳,趙琳琳,趙　寧

(1.華北理工大學(xué),河北唐山 063009;2.中國藥科大學(xué),江蘇南京 211198)

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負(fù)載蝦青素淀粉納米粒的表征與穩(wěn)定性能研究

劉占軍1,崔成龍1,2,李志威1,耿旭芳1,趙琳琳1,趙寧1

(1.華北理工大學(xué),河北唐山 063009;2.中國藥科大學(xué),江蘇南京 211198)

為了提高蝦青素的穩(wěn)定性,制備了淀粉接枝聚甲基丙烯酸甲酯納米粒,然后采用透析法,將蝦青素與納米?；旌现瞥晌r青素納米粒。測定了淀粉及接枝共聚物的紅外光譜、納米粒的平均粒徑、粒徑分布、納米粒形態(tài),并以蝦青素的丙酮溶液作為比較,對蝦青素納米粒的穩(wěn)定性進(jìn)行了測定。結(jié)果表明,蝦青素納米粒的平均粒徑為(208.1±26.4) nm,分散系數(shù)為0.284±0.035;4 h光照后,蝦青素納米粒保留率為26.34%;30 ℃和50 ℃恒溫避光下,貯存8 d時蝦青素納米粒的保留率分別為91.81%和83.44%;在pH=1、3、5、7、9或11條件下,蝦青素納米粒的保留率平均值為86.18%。

蝦青素,納米粒,淀粉,聚甲基丙烯酸甲酯

人們越來越認(rèn)識到食品與人類健康的密切關(guān)系,各種保健食品及食品添加劑正以迅猛之勢發(fā)展。近年來,人們對蝦青素的重視程度越來越高。蝦青素(Astaxanthin),是一種類胡蘿卜素,具有很強(qiáng)的抗氧化活性,具有多種保健功能,如增強(qiáng)免疫反應(yīng),預(yù)防癌癥、心血管疾病,延緩白內(nèi)障發(fā)展、黃斑退化,抵抗炎癥和幽門螺桿菌感染[1-2],所以,蝦青素廣泛應(yīng)用于食品、飲料和醫(yī)藥等領(lǐng)域[3]。但是,由于其生物利用度低,水溶性差,性質(zhì)不穩(wěn)定,易受光、氧、溫度、pH等外界因素的影響而發(fā)生變化,使其應(yīng)用受到了一定的限制[4]。

淀粉因來源豐富、價格低廉、可再生、可完全被生物降解[5],被廣泛用作食品及食品添加劑,但制備成納米粒[6]用于添加劑的文獻(xiàn)并不多見。將淀粉與聚甲基丙烯酸甲酯接枝得到納米粒,負(fù)載蝦青素,可以提高其穩(wěn)定性,延長保存時間,擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。蝦青素納米粒具有較小的粒徑和表面積,增加溶解度和穩(wěn)定性,而提高生物利用度,易于在廣泛的產(chǎn)品中應(yīng)用。

紅外光譜法是化合物的結(jié)構(gòu)分析及定性判斷的基本方法,可以推測化合物的結(jié)構(gòu)、類別、基團(tuán)組成等信息[7]。利用透射電子顯微鏡(TEM)表征材料的形貌、成分、晶體結(jié)構(gòu)等,具有直觀、分辨率高、放大倍率寬等特點(diǎn),尤其對于納米粒等超細(xì)微粒更是不可缺少的測量手段[8]。激光粒度測量方法的理論依據(jù)是Fraunhofer衍射理論和完全的米氏光散射理論。該測量方法具有實際分辨率高,檢測速度快,智能化程度較高,輸出結(jié)果是連續(xù)的粒徑分布,使用方便,重復(fù)性好[9]。

本文采用二羥基二過碘酸合鎳(IV)鉀為引發(fā)劑[10],制備淀粉接枝聚甲基丙烯酸甲酯納米粒,用于負(fù)載蝦青素,對負(fù)載蝦青素淀粉納米粒進(jìn)行了紅外光譜、透射電子顯微鏡、激光粒度等表征,并以蝦青素的丙酮溶液作為比較,對蝦青素納米粒的穩(wěn)定性進(jìn)行評價。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蝦青素(含量≥95%)Sigma公司;可溶性淀粉分析純,天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;引發(fā)劑二羥基二過碘酸合鎳(IV)鉀本課題組實驗室自制;甲基丙烯酸甲酯(≥99.5%)分析純,天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,重蒸后使用;丙酮(≥99.5%)分析純,天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,重蒸后使用;二甲基亞砜(DMSO)分析純,用氫化鈣加熱回流,然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下減壓蒸餾[11]。

Brookhaven 90Plus激光粒度/Zeta電位分析儀美國Brookhaven公司;H600透射電子顯微鏡日本Hitachi公司;1100型高效液相色譜儀(四元梯度泵,手動進(jìn)樣,Angilent工作站)美國Angilent公司;BK30低溫高速離心機(jī)德國Sigma公司;FTIR-8400傅里葉變換紅外光譜儀日本Shimadzu公司;AE240十萬分之一電子天平瑞士Mettler公司;KQ-100超聲波清洗機(jī)昆山超聲儀器廠;LS-3000光照實驗儀北京天星科儀科技公司;集熱式磁力攪拌器(水浴油浴兩用鍋)力辰儀器科技有限公司;MD10透析袋截留相對分子量14000,北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1淀粉接枝共聚物的制備制備方法參照文獻(xiàn)[12]略改進(jìn),一個500 mL的三頸燒瓶,配備溫度計、磁力攪拌器和通氮?dú)庋b置,在水浴中進(jìn)行溫度控制。先加入淀粉2.88 g,170 mL蒸餾水,在攪拌下加熱到90 ℃保持30 min,然后冷卻到35 ℃,并用N2吹泡30 min,以去除體系中的氧氣。加入甲基丙烯酸甲酯1 mL后滴加2 mL引發(fā)劑,反應(yīng)在35 ℃條件下持續(xù)5 h,確保反應(yīng)完全。得到的產(chǎn)物反復(fù)用去離子水洗3次除去未反應(yīng)的淀粉,將干燥后的產(chǎn)物放入索氏提取器中,用丙酮室溫條件下提取48 h,以完全除去其中的均聚物聚甲基丙烯酸甲酯。真空冷凍干燥后的產(chǎn)物備用。

1.2.2空白納米粒的制備用透析法制備淀粉納米粒[13]。精密稱取接枝聚合物2.3 mg溶解在1.65 mL DMSO中,持續(xù)攪拌,使之溶解,加入透析膜,用去離子水進(jìn)行透析。透析介質(zhì)在開始后3 h,每小時換一次,之后每5 h更換一次,共透析24 h。得到的納米粒溶液,滴加0.1%三聚磷酸鈉溶液0.25 mL,保持15 min,以使納米粒穩(wěn)定,真空冷凍干燥,備用。

1.2.3蝦青素納米粒的制備[13]精密稱取淀粉納米粒23 mg溶解在16.5 mL DMSO中,持續(xù)攪拌,使之溶解。將蝦青素0.17 mg溶于4 mL丙酮中,混合后加入透析膜,用去離子水進(jìn)行透析。透析介質(zhì)前3 h,每小時換一次,之后每5 h更換一次,共透析24 h,得到蝦青素納米粒溶液。

1.2.4納米粒的紅外光譜采用溴化鉀壓片法制備樣品,室溫掃描測定,掃描范圍400～4000 cm-1。

1.2.5納米粒的粒徑分布室溫條件下,將空白納米粒和蝦青素納米粒的混懸液,分別加入去離子水稀釋10倍,置激光粒度分析儀中測定納米粒的粒徑,測定條件:散射角為90°,測定溫度為室溫。

1.2.6透射電子顯微鏡(TEM)取少量納米?；鞈乙旱沃龄佊刑寄さ你~網(wǎng)上,靜置5 min后滴加2%磷鎢酸染色,自然晾干后,于透射電子顯微鏡下觀察納米粒形態(tài)。

1.2.7蝦青素的測定蝦青素的含量測定按文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行:0.5 mL的樣品加入到2 mL(50∶50 v/v)二氯甲烷和甲醇的混合液。密閉條件下攪拌15 min,之后在室溫下離心5 min(800×g)。此提取程序重復(fù)2次,合并提取液,然后用濾膜過濾(4 mm,0.45 μm),取上清液進(jìn)樣測定。色譜條件:色譜柱:Extend-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:甲醇∶二氯甲烷∶乙腈∶水(85∶5∶5∶5);檢測波長480 nm;流速1.0 mL/min;柱溫為室溫;進(jìn)樣量為20 μL,以蝦青素濃度c為橫坐標(biāo),峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程A=156.38c-41.72,r=0.9998,線性范圍0.6～19 μg/mL。

1.2.8光照條件下蝦青素納米粒的穩(wěn)定性參照文獻(xiàn)方法[15]并進(jìn)行改進(jìn),取10 mL蝦青素納米粒溶液及蝦青素丙酮溶液,濃度均為20 μg/mL,分別置于具塞比色管中,置于LS-3000光照實驗儀,在室溫條件下測定,調(diào)節(jié)照度為4000 LX,分別在20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、240 min,進(jìn)行取樣,按1.2.7方法測定,每個樣品平行3次。

1.2.9溫度對蝦青素納米粒穩(wěn)定性的影響[15]將蝦青素的丙酮溶液及蝦青素納米粒溶液10 mL分裝于具塞比色管中,分別置于30 ℃和50 ℃溫度下避光水浴,分別在1、2、3、4、5、6、7、8 d取樣,按1.2.7方法測吸光值。每個樣品平行3次。

1.2.10pH對蝦青素納米粒穩(wěn)定性的影響將6份蝦青素的丙酮溶液及蝦青素納米粒溶液10 mL分裝于具塞比色管中,調(diào)節(jié)其pH分別為1、3、5、7、9、11,室溫避光靜置24 h,按1.2.7方法測吸光值。每個樣品平行3次。

1.2.11穩(wěn)定性評價用蝦青素保留率表示納米粒的穩(wěn)定性,蝦青素保留率(%)=實驗條件下蝦青素的含量/實驗開始時蝦青素的含量。

1.2.12數(shù)據(jù)處理采用Orogin8.5及IBM SPSS 20數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,運(yùn)用Duncan檢驗進(jìn)行顯著性分析(p<0.05)。

2　結(jié)果與分析

2.1紅外光譜

淀粉、聚甲基丙烯酸甲酯和淀粉接枝共聚物的紅外光譜如圖1。聚甲基丙烯酸甲酯和淀粉接枝共聚物的譜圖上,在1200～1000 cm-1范圍都有一個寬峰,在淀粉的詳圖上沒有。-C=O的特征振動吸收峰1726 cm-1可以明顯地在聚甲基丙烯酸甲酯和淀粉接枝共聚物的紅外光譜中觀察到。在約3411 cm-1處的寬峰,為淀粉上葡萄糖單元的羥基伸縮振動吸收峰。在845和755 cm-1是CH2-CH2的伸縮振動吸收峰。另外2994 cm-1和2949 cm-1處兩個小峰是-OCH3和-CH兩脂肪族基團(tuán)吸收峰。在淀粉接枝共聚物的譜圖上出現(xiàn)的上述新出現(xiàn)的吸收峰說明產(chǎn)物為接枝共聚物。[10]

圖1　紅外光譜Fig.1　FTIR of starch and starch copolymer注:A:淀粉,B:聚甲基丙烯酸甲酯,C:淀粉接枝共聚物。

2.2納米粒形態(tài)

納米粒的透射電鏡照片見圖2、圖3,表明制得的空白納米粒呈現(xiàn)球形或類球形,形態(tài)比較均勻圓整,大小基本均一,應(yīng)用軟件Image J進(jìn)行計算,得平均粒徑為(121.5±16.8) nm;蝦青素納米粒的形態(tài)基本規(guī)整,呈球形,均勻程度要差,粒徑大小差別較大,平均粒徑為(208.1±26.4) nm,主要因為在負(fù)載蝦青素的過程中,每個空白納米粒與蝦青素的接觸機(jī)會不同,導(dǎo)致負(fù)載量不同,出現(xiàn)粒徑上的差異[16]。另外從圖3上可以看到電鏡照片的背景有灰色斑塊,是由溶液在銅網(wǎng)碳膜上干燥后造成,含有游離蝦青素及淀粉降解產(chǎn)物[17]。

圖2　空白納米粒的透射電鏡圖(80000×)Fig.2　Transmission electron micrographs of nanoparticles(80000×)

圖3　蝦青素納米粒的透射電鏡圖(60000×)Fig.3　Transmission electron micrographs of nanoparticles(60000×)

2.3納米粒的粒徑分布

激光粒度分析儀測得分布圖見圖4、圖5,空白納米粒,平均粒徑為(161.8±21.8) nm,分散系數(shù)為0.112±0.016,可見分布大多集中在平均粒徑附近,極少部分比較小粒徑的納米粒使分散程度變大;蝦青素納米粒的平均粒徑為(296.7±29.6) nm,分散系數(shù)為0.284±0.035,分布圖上816 nm附近出現(xiàn)的小峰,可能是由于納米粒低程度聚集或是不均勻形成,導(dǎo)致分散程度加大,這和透射電鏡照片看到的情況相符合。納米粒負(fù)載后分布變寬,在其它的載體也是普遍存在的。另外,粒徑分布圖比電鏡照片得到的尺寸更大,是由于不同的測定條件導(dǎo)致的[18]。

圖4　空白納米粒的粒徑分布Fig.4　The size distributions of blank nanoparticles

圖5　蝦青素納米粒的粒徑分布Fig.5　The size distributions of nanoparticles

2.4光照條件下蝦青素納米粒的穩(wěn)定性

由圖6可見,在光射條件下,蝦青素溶液受光照影響較大,大量發(fā)生反應(yīng)而降解,隨時間的延長,含量逐步下降,在4 h后樣品中的蝦青素保留率低至16.66%。主要原因是蝦青素在光直射條件下,分子很容易被激發(fā),發(fā)生脫氫反應(yīng),生成類胡蘿卜自由基陽離子,而自由其生成后很容易誘發(fā)其他的蝦青素分子發(fā)生降解[19]。納米粒中蝦青素保留率的變化趨勢與在丙酮溶液中相同,時間越長,分解的蝦青素越多,但程度比蝦青素丙酮溶液低,4 h后蝦青素保留率為26.34%,提高了58.1%。這主要由于納米粒具有表面與界面效應(yīng),具有吸收光子能量及吸收部分自由基的特性,減弱了光化學(xué)反應(yīng)[20]。

圖6　光照對穩(wěn)定性的影響Fig.6　Effect of light on the stability

2.5溫度對蝦青素穩(wěn)定性的影響

圖7為蝦青素的丙酮溶液和蝦青素納米粒的避光條件下的耐熱曲線。由圖7可知,隨著貯藏時間的延長,蝦青素丙酮溶液中含量逐漸下降,30 ℃和50 ℃恒溫避光下,貯存8 d時蝦青素保留率分別為87.55%和75.35%;溫度越高,含量越低,表明溫度對蝦青素的穩(wěn)定性影響較大,溫度增加促進(jìn)蝦青素的分解[21]。蝦青素受熱分解是一個復(fù)雜的過程,但有兩個主要的反應(yīng):異構(gòu)化和氧化[22],溫度升高使其異構(gòu)化和氧化加劇。在相同的條件下納米粒中的蝦青素貯存8 d時保留率分別為91.81%和83.44%,分別比丙酮溶液的保留率提高了4.87%和10.7%。其穩(wěn)定性得到顯著改善(p<0.05),主要是納米粒所具有的納米效應(yīng),使蝦青素得到了有效的保護(hù)[21]。

圖7　溫度對穩(wěn)定性的影響Fig.7　Effect of temperature on the stability

2.6pH對蝦青素穩(wěn)定性的影響

圖8為蝦青素的丙酮溶液和蝦青素納米粒的避光條件下的pH曲線。由圖8可見,蝦青素的丙酮溶液和蝦青素納米粒溶液,都顯示出在較低的pH條件下更穩(wěn)定,但由于酸度過大,穩(wěn)定性有下降的趨勢。這是由于在過于酸性或堿性條件下,容易導(dǎo)致蝦青素分子中雙鍵異構(gòu)化,而使蝦青素功能基團(tuán)失效[23]。在各pH條件下蝦青素負(fù)載于納米粒,保留率平均值為86.18%,穩(wěn)定性雖有提高,但保留率僅平均提高5.86%,主要是因為在溶液中,H+和OH-會向納米粒內(nèi)擴(kuò)散,擴(kuò)散平衡后,對于納米粒內(nèi)的蝦青素的影響與在丙酮溶液中蝦青素基本相同。

圖8　pH對穩(wěn)定性的影響Fig.8　Effect of pH on the stability

3　結(jié)論

紅外光譜表明,利用二羥基二過碘酸合鎳(IV)鉀為引發(fā)劑,制備得到的產(chǎn)物為淀粉接枝聚甲基丙烯酸甲酯,該方法具有反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn),同樣適用于其它的天然高分子材料用于制備納米粒。

空白納米粒及蝦青素納米粒的形態(tài)都基本規(guī)整,呈球形,粒徑分別為(121.5±16.8) nm和(208.1±26.4) nm,納米粒負(fù)載蝦青素后,粒度雖比空白納米粒大,但仍在納米級別;粒徑分散系數(shù)分別為0.112±0.016和0.284±0.035,蝦青素納米粒的分布也明顯變寬。

納米粒具有更大的比表面積,對包載其中的蝦青素具有保護(hù)作用,所以蝦青素納米粒在各種條件下,都比蝦青素丙酮溶液穩(wěn)定。尤其在光照條件下最為明顯,4 h光照后,蝦青素納米粒保留率26.34%,比蝦青素丙酮溶液的保留率16.66%提高了58.1%;30 ℃和50 ℃恒溫避光下,貯存8 d時蝦青素納米粒的保留率91.81%和83.44%,比丙酮溶液保留率87.55%和75.35%,分別提高了4.87%和10.7%;在不同的pH條件下,保留率平均提高了5.86%。

淀粉資源豐富,成本低,有利于開發(fā)制備蝦青素相關(guān)產(chǎn)品,延長其存貯時間及提高產(chǎn)品的質(zhì)量,具有較好的應(yīng)用前景。

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Characterization and stability of the starch nanoparticles loaded with astaxanthin

LIU Zhan-jun1,CUI Cheng-long1,2,LI Zhi-wei1,GENG Xu-fang1,ZHAO Lin-lin1,ZHAO Ning1

(1.North China University of Science and Technology,Tangshan 063009,China;2.China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China)

In order to improve the stability of astaxanthin,the starch-graft-poly(methyl methacrylate)nanoparticles were synthesized,and then nanoparticles loaded with astaxanthin were prepared by the dialysis method. IR spectra of the starch and the graft copolymer,the average particle size,particle size distribution,and morphology of the nanoparticles loaded with astaxanthin were measured. The stability of nanoparticles loaded with astaxanthin was determined with an acetone solution of astaxanthin as a comparison. The results showed that the average particle size and polydispersity indexof staxanthin nanoparticles were(208.1±26.4) nm and 0.284±0.035 respectively. The astaxanthin retention rate of nanoparticles was 26.34% after 4 h under artificial lighting.It was 91.81% and 83.44% after storage 8 days at 30 ℃ and 50 ℃ respectively,in the dark under same temperature conditions.It was 86.18% on average at pH1,3,5,7,9 or 11 conditions.

astaxanthin;nanoparticles;starch;poly methyl methacrylate(PMMA)

2016-02-22

劉占軍(1967-)，男，博士，副教授，研究方向：藥用輔料制備及天然高分子材料改性，E-mail：liuzhanjun815@163.com。

河北省自然科學(xué)基金(H2013209192)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)16-0084-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.008