陳冬陽，楊明明，高 翔,2，張龍龍，郭江岸，李 萬

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.陜西省小麥新品種培育工程研究中心，陜西楊凌 712100)

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普通小麥幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá)分析

陳冬陽1，楊明明1，高 翔1,2，張龍龍1，郭江岸1，李 萬1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.陜西省小麥新品種培育工程研究中心，陜西楊凌 712100)

幾丁質(zhì)酶是植物重要的防衛(wèi)因子之一，與植物抗病性密切相關(guān)。為深入了解幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)及功能，先利用引物ChiF/ChiR從10份具有不同抗病性的小麥中克隆出幾丁質(zhì)酶基因后對其進(jìn)行序列分析及原核表達(dá)分析，再利用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析小麥根、莖和葉不同組織中幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)情況，并選取在小麥根、莖和葉中表達(dá)量最高的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行真菌性病害的抗性反應(yīng)試驗(yàn)。結(jié)果表明，從10份具有不同抗病性的小麥中克隆得到5條長度約960 bp的幾丁質(zhì)酶基因序列，其中1條序列與已公布的 Chi-3基因序列(序列登錄號為KJ507387)一致，其余序列命名為 Cht1～Cht4(GenBank登錄號為KR049247～KR049250)。序列分析表明，克隆所得序列無內(nèi)含子，編碼的幾丁質(zhì)酶屬于ClassⅠb類型，也屬于糖苷水解酶第19家族，是胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。SDS-PAGE分析表明，重組質(zhì)粒pE-Chi能在BL21(DE3)中表達(dá)一個33 kDa左右的特異蛋白。qRT-PCR分析表明，這5種幾丁質(zhì)酶基因在小麥根、莖和葉中均有表達(dá)，但在不同器官中表達(dá)量差異較大，其中，葉中表達(dá)量最高，根中次之，莖中最低；同時(shí)，這5種幾丁質(zhì)酶基因在同一器官中表達(dá)量大小具體表現(xiàn)為 Cht4> Cht2> Cht3> Cht1> Chi-3。選取相對表達(dá)量最高的 Cht4基因驗(yàn)證其對真菌性病害的抗性反應(yīng)，結(jié)果表明，在條銹菌脅迫下， Cht4基因在抗病材料92R137中的表達(dá)量顯著高于感病材料銘賢169，并且均高于同等條件下接ddH2O的表達(dá)量。本研究擴(kuò)增到的幾丁質(zhì)酶基因在小麥中組成型表達(dá)，說明其參與了小麥的正常生長發(fā)育過程； Cht4基因的表達(dá)受條銹菌誘導(dǎo)，推測其可能參與了小麥葉部抗條銹菌的防御反應(yīng)。

小麥；幾丁質(zhì)酶；原核表達(dá)；組織表達(dá)；功能分析

由真菌引起的小麥病害嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。而幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)能夠水解菌絲生長初期細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，對真菌具有廣譜抗性[1-3]。目前，已在水稻、小麥、大麥和棉花等100多種植物中檢測到幾丁質(zhì)酶活性[4]。正常情況下，植物體內(nèi)幾丁質(zhì)酶的含量很低，甚至不表達(dá)，但當(dāng)受到病原菌侵染、病毒感染或其他非生物因素誘導(dǎo)時(shí)，植物體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶活性會迅速提高[5-6]。油菜[7]、菜豆[8]、擬南芥[9]、煙草[10]、棉花[11]和甘蔗[12]經(jīng)真菌誘導(dǎo)后，體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶大量表達(dá)，并且酶活性也有所提高[13]。體外抑菌實(shí)驗(yàn)證明，不同的幾丁質(zhì)酶經(jīng)過純化后對綠色木霉菌[14]、立枯絲核菌[15-16]、灰霉病菌[17]、葉霉病菌[18]、尖孢鐮刀菌[19]、赤霉菌[16]、黃萎菌[16]和赤星菌[16]等20多種病原真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長具有抑制作用。轉(zhuǎn)基因研究表明，成功表達(dá)異源幾丁質(zhì)酶基因的煙草[20]、油菜[20-21]、西瓜[22]、黑楊[23]、小麥[24-25]和水稻[26-27]對真菌的抗性明顯高于對照植物。說明幾丁質(zhì)酶基因是植物重要的防衛(wèi)基因，在植物生長發(fā)育、抗逆和防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3,28]。因此，利用幾丁質(zhì)酶基因培育抗病新品種是植物抗病性研究的熱點(diǎn)之一。但目前基因工程中可被利用的幾丁質(zhì)酶基因仍很稀少[6,29-30]，幾丁質(zhì)酶基因在不同小麥品種中是否存在突變，及該基因在不同組織中表達(dá)量尚不明確。本研究從不同小麥品種中克隆幾丁質(zhì)酶基因，并利用實(shí)時(shí)熒光定量的方法研究其在小麥根、莖、葉等不同部位的表達(dá)差異，以及受條銹菌誘導(dǎo)后的表達(dá)量變化，驗(yàn)證其對真菌性病害的抗性，以期發(fā)掘小麥中的有效抗條銹病基因，為小麥的抗病分子育種提供基礎(chǔ)材料。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試材料共計(jì)10份，包括陜627、陜715、西農(nóng)528、西農(nóng)538、西農(nóng)556、西農(nóng)558、西農(nóng)583、小偃22、銘賢169(感條銹病)和92R137(抗條銹病)，除銘賢169和92R137種子由西北農(nóng)林科技大學(xué)韓德俊課題組提供外，其他材料均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2幾丁質(zhì)酶基因的克隆

所有供試材料播種于直徑10 cm的花盆中，24 ℃下光照16 h/黑暗8 h培養(yǎng)2周，收集葉片，利用微量CTAB法[31]提取基因組DNA。根據(jù)NCBI中已公布的中國春幾丁質(zhì)酶基因(KJ507385)的開放閱讀框，設(shè)計(jì)包含上游起始密碼子和下游終止密碼子的引物ChiF/ChiR(ChiF:5′-ATGAGAGGAGTTGTGGTGG-3′; ChiR:5′-CTATGCGAACGGCCTCT-3′)，并交由金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。以基因組DNA為模板，利用引物ChiF/ChiR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2×TaqMaster Mix(康為世紀(jì)公司)12.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，DNA模板100 ng，加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，61 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min?；厥漳康钠?，連接克隆載體pEASY-T1，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞Trans-T1，挑選陽性單克隆送金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序。

1.3生物信息學(xué)分析

利用NCBI中BLAST在線軟件進(jìn)行基因序列比對分析；利用NCBI中ORF Finder預(yù)測序列開放閱讀框；利用DNAMAN 7.0進(jìn)行基因序列翻譯及蛋白序列比對；利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用SignalP 4.1 Server預(yù)測氨基酸序列信號肽；利用ProtParam預(yù)測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；利用ProtScale分析蛋白質(zhì)親疏水性；利用Prosite預(yù)測氨基酸序列基序；利用NCBI中CDD在線預(yù)測氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域；利用NPS@網(wǎng)站預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL軟件預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

1.4幾丁質(zhì)酶基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

以1.2中得到的陽性單克隆為模板，利用ChiF1/ChiR(ChiF1:5′-GAGCAATGCGGCT CGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系同1.2?；厥漳康钠危B接表達(dá)載體pEASY-E1，構(gòu)建重組表達(dá)載體pE-Chi。轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞Trans-T1，挑選陽性單克隆，以ChiF1/T7 terminator primer為引物進(jìn)行正反向檢驗(yàn)并測序。將插入正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，37 ℃、200 r·min-1過夜培養(yǎng)，然后將菌液以1∶100的體積比重新接種新鮮LB培養(yǎng)基(含100 μg·mL-1Amp)，28 ℃、200 r·min-1震蕩培養(yǎng)至OD≈0.8時(shí)，取1 mL菌液作為對照，在剩余菌液中加入IPTG至終濃度1 mmol·L-1，繼續(xù)誘導(dǎo)12 h。收集表達(dá)蛋白，處理樣品并進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測。

1.5幾丁質(zhì)酶基因的熒光定量PCR分析

田間采集西農(nóng)538花后10 d的根、莖和葉，經(jīng)液氮快速冷凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。將銘賢169和92R137播種于直徑10 cm的花盆中，待其第一葉充分展開后，參照康振生課題組的方法進(jìn)行條銹病菌的接種[32]，分別采集接菌和ddH2O處理后0、6、12、24、48和72 h的小麥葉片，經(jīng)液氮快速冷凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用植物總RNA提取試劑盒(Bioteke公司)提取上述-80 ℃保存組織的總RNA。采用Nondrop2000及電泳檢測RNA的濃度及質(zhì)量。按照Roche公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，取1 μg總RNA進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照克隆得到的基因組序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)各基因特異的熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)引物(表1)，擴(kuò)增片段為75～200 bp，退火溫度設(shè)定在58～62 ℃。以上述各組織cDNA為模板，以小麥肌動蛋白基因β-actin(AB181991.1)為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系10 μL，包含F(xiàn)ast Start Essential DNA Green Master 5 μL，5 μmol·L-1混合引物1 μL，cDNA模板4 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán)；65～95 ℃緩慢上升，其中，每0.5 ℃讀取一次熒光信號，通過溶解曲線鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。采用2-ΔΔCt法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定基因的相對表達(dá)量[33]。

2　結(jié)果與分析

2.1小麥幾丁質(zhì)酶基因的克隆及核酸序列分析

分別以10個小麥品種的基因組DNA為模板，利用引物ChiF/ChiR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到約為1 000 bp的單一條帶，將目的條帶切膠回收、克隆和測序后，得到5條不同序列。

利用NCBI在線BLAST工具對所得序列進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果表明，所有序列與已公布的幾丁質(zhì)酶基因序列相似度較高，達(dá)99%以上，其中，1條序列與胡周波等[34]分離得到的 Chi-3基因序列(序列登錄號為KJ507387)完全相同，初步斷定本研究擴(kuò)增得到的序列均為幾丁質(zhì)酶基因。將4條新基因序列命名為 Cht1～ Cht4，并將其提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，得到的序列登錄號為 KR049247～KR049250。進(jìn)一步比對發(fā)現(xiàn)，這四條序列在185～225 bp之間有兩個堿基插入/缺失突變區(qū)(圖1)，這兩個區(qū)域的變化堿基數(shù)是三的整數(shù)倍，因此只能造成個別氨基酸的插入/缺失，不會造成移碼突變。除此之外的其他位點(diǎn)也存在多個堿基差異。

表1　qRT-PCR分析所用引物Table 1　Primers in qRT-PCR analysis

圖1　幾丁質(zhì)酶核酸序列主要差異區(qū)域Fig.1　Major differences in chitinase DNA sequences

2.2推導(dǎo)的蛋白序列分析

2.2.1理化性質(zhì)分析

ORF Finder在線預(yù)測可知，新擴(kuò)增到的4條序列均有完整的開放閱讀框，無內(nèi)含子。SignalP Server預(yù)測可知，4條蛋白序列均含有由前20個氨基酸組成的信號肽，并且屬于分泌蛋白。ProtParam預(yù)測可知，4個蛋白均屬于穩(wěn)定蛋白。ProtScale分析可知，除了信號肽及150～200位置的氨基酸外，疏水性區(qū)域和親水性區(qū)域分布比較均勻，但是親水性氨基酸含量高于疏水性氨基酸，因此4個蛋白屬于親水性蛋白。此外，根據(jù)酶切位點(diǎn)的不同，這4條幾丁質(zhì)酶屬于內(nèi)切酶，水解位點(diǎn)為同聚物內(nèi)部的β-1,4-糖苷鍵。

利用Prosite分析幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的模體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增得到的4條幾丁質(zhì)酶序列N端具有20個氨基酸組成的信號肽，富含8個半胱氨酸的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)(20～61 aa)、可變區(qū)和保守的催化區(qū)(VSFKTALWFWM)，缺少C端延伸區(qū)，編碼蛋白應(yīng)歸屬于ClassⅠb型幾丁質(zhì)酶；結(jié)合NCBI中CDD在線預(yù)測得到編碼蛋白屬于糖苷水解酶第19家族，因此，推測這4個編碼蛋白具有幾丁質(zhì)酶和溶菌酶的雙功能活性。

2.2.2結(jié)構(gòu)分析

利用NPS@網(wǎng)站預(yù)測幾丁質(zhì)酶蛋白序列中的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，無規(guī)則卷曲比例最高，達(dá)到62.50%左右；延伸鏈為19.69%左右；α-螺旋最少，約占17.81%；不含其他二級結(jié)構(gòu)。

在SWISS-MODEL網(wǎng)頁提交幾丁質(zhì)酶基因的氨基酸序列，在蛋白結(jié)構(gòu)庫中搜索比對模板，得到2dkv.1.A序列與KR049250氨基酸序列的21到320殘基一致性達(dá)74.07%，具備同源建模的條件。從而得到KR049250等4個幾丁質(zhì)酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型(圖2)，該蛋白由一個雙葉α+β折疊模體組成[35]。

圖2　幾丁質(zhì)酶蛋白序列的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2　3D structure prediction of chitinase protein sequence

2.3系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用DNAMAN 7.0進(jìn)行基因序列翻譯及氨基酸序列比對，結(jié)果(圖3)顯示，克隆得到的4條氨基酸序列相似度極高，主要依據(jù)2個位點(diǎn)出現(xiàn)的插入缺失進(jìn)行區(qū)分。此外，KR049250氨基酸序列與小麥(CAA53626.1)的同源性為96.57%，與黑麥(AAG53610.1)的同源性為47.04%，與水稻(AAM08773.1)、擬南芥(AAM14810.1)、苦瓜(AAM18075.1)、大蕁麻(P11218.3)和陸地棉(AAP80801.1)的同源性分別為12.35%、37.58%、10.89%、38.64%和30.79%。

用MEGA 5.0將獲得的4條蛋白序列與其他類型的幾丁質(zhì)酶蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果(圖4)顯示，本研究得到的蛋白與ClassⅠ型幾丁質(zhì)酶親緣關(guān)系最近，應(yīng)歸屬于此類；此外與ClassⅡ類幾丁質(zhì)酶親緣關(guān)系相對較近，但與其他種類的幾丁質(zhì)酶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

實(shí)線框示信號肽位置；圓點(diǎn)框示區(qū)分4個幾丁質(zhì)酶基因的位點(diǎn)；短線框示保守催化位點(diǎn)

Bold wireframe indicates signal peptide; Dot frame indicates the sites to distinguish 4 chitinases; Short-term frame indicates catalytic

圖3幾丁質(zhì)酶基因編碼氨基酸的序列比對分析

Fig.3Alignment of the deduced amino acid sequences of chitinase

“★”代表本研究中4條幾丁質(zhì)酶基因推導(dǎo)得到的蛋白

“★” indicates the deduced proteins of 4 chitinase genes obtained in this study

圖4幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

Fig.4Phylogenetic analysis of chitinase amino acid sequences

2.4小麥幾丁質(zhì)酶基因的原核表達(dá)

將去掉信號肽的核酸序列連接至載體pEASY-E1，構(gòu)建重組表達(dá)載體pE-Chi，并在感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)，28 ℃、200 r·min-1震蕩培養(yǎng)至OD≈0.8時(shí)加入IPTG至終濃度1 mmol·L-1，表達(dá)效率最高，得到分子量約為33 kDa大小的特征條帶，與推測得到的蛋白分子量大小一致，而作為對照未誘導(dǎo)的菌株未表達(dá)此蛋白，說明小麥幾丁質(zhì)酶基因在大腸桿菌中得到正確表達(dá)。

M：Blue Plus Protein Marker；1：未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒；2～5：誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒KR049247、KR049248、KR049249和KR049250

M:Blue Plus Protein Marker; 1:Protein of recombinant plasmid without induction; 2-5:Protein of recombinant plasmid KR049247,KR049248,KR049249 and KR049250 after induction

圖5誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

Fig.5SDS-PAGE analysis of protein expression

2.5小麥幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)特性分析

2.5.1小麥幾丁質(zhì)酶基因的組織表達(dá)特性

以小麥花后10 d的根、莖和葉cDNA為模板，利用qRT-PCR技術(shù)對 Cht1～Cht4和 Chi-3基因的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果(圖6、圖7)顯示，在以上3種組織中均能檢測到這5種基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但各基因在不同組織中的表達(dá)量存在較大差異，其中，葉中表達(dá)量最高，根中次之，莖中最低。同時(shí)也可發(fā)現(xiàn)，不同基因在同一組織中的表達(dá)量大小具有一定的規(guī)律，具體表現(xiàn)為 Cht4> Cht2> Cht3> Cht1> Chi-3。

M:D2000 DNA marker； a、b和c分別代表一次重復(fù)

M:D2000 DNA marker; a,b and c represent three replicates,respectively

圖6qRT-PCR產(chǎn)物檢測

Fig.6Detection of qRT-PCR products

圖7　小麥根(a)、莖(b)和葉(c)中幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)分析Fig.7　Expression analysis of chitinase in wheat′s root (a),stem (b) and leaf (c)

2.5.2小麥幾丁質(zhì)酶基因在條銹菌侵染后的表達(dá)特性

以感病品種接ddH2O后0 h的基因表達(dá)量為對照，研究在正常情況下表達(dá)量最高的 Cht4基因在條銹菌誘導(dǎo)下的表達(dá)量變化。結(jié)果(圖8)顯示，92R137(抗病品種)和銘賢169(感病品種)在接種ddH2O后葉片中的 Cht4基因表達(dá)量變化不大；而在條銹菌誘導(dǎo)條件下兩者的 Cht4基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，不過銘賢169中變化沒有92R137明顯。在銹菌處理后葉片中的 Cht4基因表達(dá)量迅速升高，6 h時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)92R137中 Cht4基因表達(dá)量是對照的12.5倍，而銘賢169中 Cht4基因的表達(dá)量僅是對照的6.33倍。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)量逐漸下降，至脅迫72 h后92R137和銘賢169葉片中 Cht4基因的表達(dá)量分別是對照的3.23倍和2.75倍，仍然維持較高水平。

3　討 論

隨著對幾丁質(zhì)酶生化性質(zhì)、作用機(jī)理及表達(dá)調(diào)控的深入研究，利用其培育抗病新品種成為植物抗真菌病害研究的熱點(diǎn)之一[6]。本研究在10個不同小麥品種中均克隆到幾丁質(zhì)酶基因，為進(jìn)一步分析小麥幾丁質(zhì)酶對病原真菌的抑制作用以及植物抗病基因工程提供了材料。對序列進(jìn)行分析表明，本研究得到的幾丁質(zhì)酶基因兼具溶菌酶活性，并且無內(nèi)含子。而有研究[36]表明，當(dāng)發(fā)生外界脅迫或mRNA剪切功能障礙時(shí)，對于幾丁質(zhì)酶基因不含內(nèi)含子或含內(nèi)含子很少的植物體仍能快速合成幾丁質(zhì)酶，不會影響其正常生理功能。

RCK:92R137接種ddH2O; RT:92R137接種條銹菌; SCK:銘賢169接種ddH2O; ST:銘賢169接種條銹菌

RCK:92R137 induced by ddH2O; RT:92R137 induced byPucciniastrilformis;SCK:Mingxian 169 induced by ddH2O; ST:Mingxian 169 induced byPucciniastrilformis

圖8條銹菌處理后 Cht4基因的表達(dá)分析

Fig.8Expression analysis of Cht4 gene induced byPucciniastrilformis

本研究獲得的幾丁質(zhì)酶具有幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)、可變交聯(lián)區(qū)和催化區(qū)，而不含C端延伸區(qū)，屬于ClassⅠb類型。亞細(xì)胞定位預(yù)測該幾丁質(zhì)酶將分泌于胞外，與已知的ClassⅠb類型幾丁質(zhì)酶分泌于胞外的研究[37-38]一致。很多病原菌初期侵染發(fā)生在寄主植物的細(xì)胞間隙，胞外的ClassⅡ類幾丁質(zhì)酶通過分解病原真菌的幾丁質(zhì)，產(chǎn)生信號分子，促成包括幾丁質(zhì)酶在內(nèi)的病程相關(guān)蛋白的大量表達(dá)[4]，但ClassⅡ類幾丁質(zhì)酶幾乎沒有抑菌作用，而抑菌效果最好的Ia類幾丁質(zhì)酶大部分定位于液泡[39]。因而本研究得到的幾丁質(zhì)酶既能夠迅速的對病原真菌的侵染做出反應(yīng)，又能充分發(fā)揮其抑菌作用，增強(qiáng)植物抗病性。此外，本研究中幾丁質(zhì)酶基因在大腸桿菌中的成功表達(dá)，有利于其體外活性的分析及蛋白結(jié)構(gòu)的研究，對幾丁質(zhì)酶在工業(yè)上的發(fā)展也有促進(jìn)作用[34]。

幾丁質(zhì)酶主要分布于植物的根、莖、葉、花、種子以及愈傷組織中[40-42]，但不同組織中的含量不同[4]。如番茄中1種幾丁質(zhì)酶在花柱中含量較高，而葉中含量很低[43]； Ghachi3和 Ghachi4基因在棉花的根、莖、葉、花和種子中均有表達(dá)，但在花和韌皮部中表達(dá)量較高，而在木質(zhì)部和子房中表達(dá)量較低[11]； ScChiⅦ1基因在甘蔗芽中表達(dá)量最高[12]。本研究中幾丁質(zhì)酶基因在根、莖、葉中均存在轉(zhuǎn)錄表達(dá)，說明這些基因?yàn)榻M成型表達(dá)，可能參與了小麥正常生長發(fā)育過程。所有基因均在葉中的表達(dá)量最高，根中其次，莖中最低，推測這些幾丁質(zhì)酶基因更多的參與對小麥葉部病害的防御反應(yīng)。不同組織中 Cht4基因的表達(dá)量均為最高，推測其在該組同工酶中發(fā)揮作用時(shí)貢獻(xiàn)最大。而對于是否是由于185～225 bp間的兩個堿基插入/缺失突變區(qū)，造成這幾種幾丁質(zhì)酶含量的顯著差異還需要進(jìn)一步探究。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 Wch1基因在中國春莖中表達(dá)，而在葉和根中未表達(dá)結(jié)果[44]不一致，可能是因?yàn)榭剐圆煌男←溒贩N中幾丁質(zhì)酶含量有所差異，并且植物體在接種條銹菌后會影響未經(jīng)接種部位幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)。

抗性不同的品種在受到病原真菌侵染后，抗病品種中幾丁質(zhì)酶含量高，而感病品種中表達(dá)量低或不表達(dá)[45-46]。不同抗性的小麥品種在受到葉銹菌[47]、腥黑穗病菌[48]、條銹菌[49]侵染后，抗病小麥中幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)活性明顯高于感病品種。本研究中， Cht4基因在不同抗性品種以及同一抗性品種不同時(shí)間的表達(dá)水平具有明顯差異。受條銹菌誘導(dǎo)后， Cht4基因在92R137和銘賢169中的表達(dá)量較對照都有所升高，推測該基因能夠受條銹菌誘導(dǎo)表達(dá)，是小麥抵抗條銹菌侵染的非特異性抗性基因。該結(jié)果與中國春近等基因系接種條銹菌后，不親和組合中小麥葉片 Wch1基因表達(dá)上調(diào)結(jié)果一致，可見，條銹病菌能誘導(dǎo)不同的幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)，間接證明了幾丁質(zhì)酶在抗條銹病中的作用。接種條銹病菌后， Cht4基因在銘賢169中的變化比92R137中緩慢、表達(dá)量低，可能是由于銘賢169啟動防御反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)比92R137慢，使得其體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶表達(dá)量相對較少，給病原真菌侵染提供可能，造成其表現(xiàn)為感病。此外，在本研究中 Cht4基因在92R137和銘賢169接種條銹菌后均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，并且反應(yīng)時(shí)間較 Wch1基因短，而 Wch1基因只在親和組合中受條銹菌誘導(dǎo)，推測 Cht4基因抑制病原菌生長更加有效。但是該幾丁質(zhì)酶基因在抗病機(jī)制中的貢獻(xiàn)究竟有多少尚不清楚，還有待于通過基因沉默、過表達(dá)等技術(shù)進(jìn)一步深入研究。

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Cloning and Expression Analysis of Chitinase Genes in Common Wheat (TriticumaestivumL.)

CHEN Dongyang1,YANG Mingming1,GAO Xiang1,2,ZHANG Longlong1,GUO Jiang’an1,LI Wan1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2.New Varieties Cultivation of Wheat Engineering Research Centre of Shaanxi Province,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Chitinase,an important defensive factor in plants,is closely related to plant disease resistance. In order to understand the expression and function of chitinase genes,by the using of primer ChiF/ChiR,chitinase genes were cloned by PCR from 10 wheat cultivars with different resistance to disease in this study. After that,these sequences were analyzed by different biology software,and were expressed inE.coli.The expression of these genes in root,stem and leaf were analyzed by quantitative real-time PCR. The highest expression of chitinase gene in these tissues was selected to test the resistance with fungal diseases. The result showed that 5 chitinase gene sequences (960±3 bp in length) were cloned from 10 wheat cultivars with different resistance to disease. Of them,one sequence is consistent with the published Chi-3 gene sequence with the accession number KJ507387,and the others were named Cht1 to Cht4 with the accession numbers of KR049247 to KR049250,respectively.Sequence analysis showed that the chitinase genes in this research have no intron,encoding chitinase belonging to ClassⅠb type. The chitinase are the members of glycoside hydrolase family 19,which are extracellular secreted protein and have lysozyme activity. The results of SDS-PAGE showed that the recombinant plasmid pE-Chicould express a 33 kDa protein after induction in BL21(DE3).The results of quantitative real-time PCR showed that these five kinds of chitinase genes were expressed in wheat roots,stems and leaves. However,the amount of expression in different organs are quite different. The content of each chitinase gene in this experiment is highest in leaf,followed by root,and is minimum in stem. Meanwhile,the expression of these five kinds of chitinase genes in the same tissue is ranked as: Cht4> Cht2> Cht3> Cht1> Chi-3. Therefore, Cht4 gene,which has the maximum content in the same organ,was selected to validate its resistance to fungal diseases. The results showed that under the stripe rust stress,the expression of Cht4 gene in 92R137 (resistant material) was significantly higher than in Mingxian 169 (susceptible material),and both of them were higher than control. In this study,the chitinase genes are constitutively expressed in wheat,indicating their participation in the regular growth and development of wheat. The expression of Cht4 gene is induced by stripe rust,suggesting that it may be involved in the defense reaction for stripe rust in wheat leaves.

Wheat; Chitinase; Prokaryotic expression; Gene expression; Function analysis

時(shí)間：2016-05-10

2015-12-10

2016-01-20

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA100501)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-3-2-47)

E-mail：chendongyang1990@163.com

高 翔(E-mail：gx@nwsuaf.edu.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)05-0539-10

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