李　雪,涂宗財,2,*,齊午城,王　輝,楊文華,田　明

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西南昌 330022)

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超聲波處理對β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)和抗原性的影響

李雪1,涂宗財1,2,*,齊午城1,王輝1,楊文華1,田明1

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西南昌 330022)

采用電泳、圓二色譜、熒光光譜及酶聯(lián)免疫吸附等方法,研究了超聲波處理對β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)結(jié)構(gòu)和抗原性的影響。結(jié)果表明:隨著超聲波功率的增大,β-Lg的分子量無顯著性變化,自由巰基含量下降,β-折疊含量和表面疏水性呈先升高后降低的趨勢,且均在400 W時達(dá)到最大值。這表明超聲波處理能迫使β-Lg結(jié)構(gòu)展開,破壞其高級結(jié)構(gòu)。與此同時,β-Lg的抗原性呈先升高后降低的趨勢,在400 W 25 min時達(dá)到最大,為2540.20 μg/mL,比未處理樣品增加了133%,這表明β-Lg結(jié)構(gòu)的展開可能會導(dǎo)致其過敏表位的暴露,因此,β-Lg抗原性的改變可能與其高級結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。

超聲波,β-乳球蛋白,酶聯(lián)免疫吸附法,結(jié)構(gòu),抗原性

食物過敏是世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的第六大人類健康問題,其中牛乳是國際糧農(nóng)組織認(rèn)定的八大主要食物過敏原之一[1]。牛乳過敏是嬰幼兒以及兒童最普遍的過敏反應(yīng),并且發(fā)病率高達(dá)7.5%[2]。目前,普遍認(rèn)為引起牛乳過敏的主要過敏原是β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)。β-Lg是牛乳清中的主要蛋白,約占牛乳清蛋白的50%,能與脂肪酸、視黃醇等疏水性配體結(jié)合,具有良好的功能特性,已被廣泛應(yīng)用于食品加工中[3]。然而,β-Lg可能會引起牛乳過敏人群的一系列臨床反應(yīng),如蕁麻疹、血管性水腫、哮喘、鼻炎、嘔吐、腸胃痙攣甚至過敏性休克等,嚴(yán)重影響了牛乳過敏人群對牛乳中營養(yǎng)成分的吸收,阻礙了過敏人群的生長發(fā)育,甚至危及過敏人群的生命安全。

針對這種現(xiàn)狀,目前國內(nèi)外學(xué)者已采用不同的加工方法對過敏原β-Lg的免疫原性進(jìn)行研究。Toheder等[4]研究了不同pH、溫度以及剪切速率對β-Lg抗原性的影響,結(jié)果表明β-Lg在pH5、120 ℃、剪切力為100～1000 s-1的條件下,抗原性最低,而在pH3的條件下加熱時,過敏原蛋白結(jié)構(gòu)展開,β-Lg抗原性增加。Zhong等[5]研究發(fā)現(xiàn)動態(tài)高壓微射流技術(shù)(0.1～160 MPa)會不同程度的增加β-Lg的抗原性,且其抗原性的變化與結(jié)構(gòu)的改變息息相關(guān)。Asghar等[6]研究了不同美拉德反應(yīng)條件對β-Lg免疫原性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖基化程度高的β-Lg其免疫原性顯著降低。以上研究表明不同的食品加工方法可能會產(chǎn)生新的過敏表位或者掩蓋原本的過敏表位,這對β-Lg和牛乳加工方法的探索具有重要的指導(dǎo)意義。

近年來,超聲波技術(shù)作為一種新型技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品無損檢測、乳液的乳化和均質(zhì)、輔助提取、殺菌、食品保鮮、食品凍結(jié)以及肉的嫩化等方面[7],而對過敏原蛋白免疫特性方面卻鮮有研究。由于超聲波能夠產(chǎn)生空穴效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)以及化學(xué)效應(yīng),因此對過敏原蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)也會產(chǎn)生影響[8],而過敏原蛋白空間結(jié)構(gòu)的變化可能會影響其免疫原性。因此本文以β-Lg為研究對象,探究不同超聲波處理?xiàng)l件對β-Lg空間結(jié)構(gòu)和抗原性的影響,并且研究β-Lg抗原性變化與其結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系,為脫敏牛乳的研制和低敏性牛乳產(chǎn)品的開發(fā)提供一條新思路。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

β-Lg(L3908)、魚皮明膠和羊抗兔酶標(biāo)二抗美國Sigma公司;兔抗β-Lg血清實(shí)驗(yàn)室自制;5,5′二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Gly)、乙二胺四乙酸(EDTA)、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMB.2HCl)和電泳Marker(14.4～97.4kDa)等索萊寶試劑有限公司。

電泳儀美國BIO-RAD公司;JY92-Ⅱ超聲波破碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司;F-7000熒光光譜儀日本日立公司;HF2000酶標(biāo)分析儀北京華安麥科生物技術(shù)有限公司;Bio-Logic MOS 450 CD圓二色譜儀法國Bio-Logic公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理用0.01 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer,PBS)配成2 mg/mL的β-Lg溶液,取25 mL上述溶液于燒杯中,放入JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎儀中(探頭直徑為6 mm)進(jìn)行超聲波處理。設(shè)置超聲功率分別為0、100、250、400、550 W,超聲時間為25 min。其間,脈沖工作3 s,休息8 s,整個超聲過程使用冰浴降溫,使樣品的溫度保持在4～10 ℃左右,超聲完畢后放入4 ℃冰箱,備用。

1.2.2分子量分析參照Zhang等[9]的方法,采用12%的分離膠,5%的濃縮膠,4×上樣緩沖液(含β-巰基乙醇),上樣量為8 μL,Mark為低分子質(zhì)量(14.4～97.4 ku)。實(shí)驗(yàn)初始電流為8 mA/板,進(jìn)入分離膠后,調(diào)整為16 mA/板,分離后取出,用考馬斯亮藍(lán)G250染色30 min,然后于7%的冰乙酸中進(jìn)行脫色,直至背景清晰。

1.2.3圓二色譜分析β-Lg的二級結(jié)構(gòu)采用Bio-Logic MOS 450圓二色譜儀進(jìn)行測定。用0.01 mol/L PBS(pH7.4)稀釋不同條件超聲波處理的β-Lg至0.2 mg/mL。參照Lucia等[10]的方法,測定條件:光徑0.1 cm樣品池,掃描速度100 nm/min,掃描范圍190～250 nm,帶寬1.0 nm。每個樣品測量三次,圓二色譜的測量值用橢圓率表示(θ;degree.cm2/dmol),最終結(jié)果通過圓二在線分析軟件dichroweb進(jìn)行分析(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml)。

1.2.4自由巰基含量的測定自由巰基的測定采用Ellman’s DTNB法[11]。取1.0 mL 樣品溶液與4.0 mL Tris-Gly 緩沖溶液(0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、5 mmol/L EDTA、pH8.0)混合,再加入50 μL 4 mg/mL的Ellman’s試劑,37 ℃ 15 min后于412 nm處測其吸光值。自由巰基含量的計算見公式:

式中:D為稀釋倍數(shù),C為樣品濃度(mg/mL)。

Ellman’s試劑的配制:4.0 mg DTNB溶于1.0 mL Tris-Gly緩沖液。

1.2.5表面疏水性測定采用ANS熒光探針法測定超聲波處理前后β-Lg的表面疏水性。將蛋白樣品用PBS(0.01 mol/L,pH7.4)分別稀釋成1、0.5和0.25 mg/mL,取4 mL稀釋后的蛋白樣品與20 μL 8 mmol/L的ANS磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH7.4)混合后,測定其熒光強(qiáng)度。測定條件:激發(fā)波長為370 nm,發(fā)射波長為400～600 nm,掃描速度為2400 nm/min,狹縫寬度均為10 nm,電壓為400V。以蛋白濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖,采用線性回歸分析進(jìn)行曲線擬合,曲線的斜率即為蛋白樣品的表面疏水性(H0)[12]。

1.2.6抗原性評估抗原性的測定采用間接競爭ELISA方法。在96酶標(biāo)板中每孔依次包被100 μL 2 μg/mL的β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品,4 ℃過夜。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的魚皮明膠作為封閉液,37 ℃溫浴1 h。依次加入50 μL不同濃度的β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品以及50 μL 15 μg/mL的不同條件超聲波處理的樣品,再加入50 μL兔抗β-Lg血清(1∶50000),37 ℃溫浴1 h。每孔加入100 μL羊抗兔酶標(biāo)二抗(1∶10000),37 ℃溫浴1 h,每步操作之后均用PBST溶液(含0.05%吐溫-20的pH7.4 0.01 mol/L的PBS液)洗板3次并扣干。用TMB底物顯色,37 ℃避光反應(yīng)15 min,最后用2 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng),于450 nm處測其吸光值[5]。以β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.5～64 μg/mL)的對數(shù)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可算出不同超聲波處理?xiàng)l件下β-Lg樣品的抗原性。

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin7.5軟件作圖,SPSS17.0軟件進(jìn)行顯著性分析(p<0.05)。

表1　超聲波處理對β-Lg二級結(jié)構(gòu)各組分含量的影響(%)

注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05,n=3);圖2～圖4同。

2　結(jié)果與討論

2.1分子量分析

過敏原蛋白經(jīng)過許多物理手段(如熱處理、輻射、高壓脈沖電場等)處理后,其分子量可能會發(fā)生改變[13-14]。β-Lg單體由162個氨基酸組成,分子量為18.4 ku,圖1為不同條件超聲波處理對β-Lg分子量的影響。根據(jù)圖1的標(biāo)準(zhǔn)蛋白電泳條帶可以看出,與未處理的β-Lg相比,經(jīng)不同超聲波處理?xiàng)l件的β-Lg樣品電泳條帶無明顯變化,說明超聲波處理(0～550 W,25 min)不會改變β-Lg的分子量。此研究結(jié)果與前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[15],超聲波處理不會導(dǎo)致β-Lg生成共價交聯(lián)的二聚體或多聚體。相似的研究結(jié)果在大豆分離蛋白的還原性SDS-PAGE電泳中也得到了證實(shí)[16]。

圖1　超聲波處理對β-Lg分子量的影響Fig.1　Effects of ultrasound treatment on the molecular weight of β-Lg

2.2圓二色譜分析

圓二色譜可以用來檢測過敏原蛋白的二級結(jié)構(gòu),分析超聲波對過敏原蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響。表1所示是通過Bio-Logic MOS 450圓二色譜儀測定的不同條件超聲波處理對β-Lg二級結(jié)構(gòu)各組分含量的影響。由表1可知,超聲波處理對β-Lg二級結(jié)構(gòu)的各組分含量有顯著影響,經(jīng)過超聲波處理的樣品其β-折疊含量均增加,無規(guī)則卷曲含量均減少,并且β-折疊的百分含量隨超聲波功率的增加呈先增加后降低的趨勢,而無規(guī)則卷曲則呈先降低后增加的趨勢。眾所周知,過敏原β-Lg是以β-折疊為主的高度結(jié)構(gòu)化的球蛋白,在其三維結(jié)構(gòu)中包含8個反平行的β-折疊結(jié)構(gòu)和一個α-螺旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)超聲波處理?xiàng)l件為400 W 25 min時,β-折疊含量達(dá)到最大,為38.96%±0.01%,然而當(dāng)處理強(qiáng)度進(jìn)一步增大時,β-折疊含量開始下降,無規(guī)則卷曲增加。這說明超聲波處理會改變過敏原蛋白的二級結(jié)構(gòu),并且β-折疊與無規(guī)則卷曲相互轉(zhuǎn)化。這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的二級結(jié)構(gòu)不僅取決于其氨基酸序列,還與蛋白質(zhì)不同基團(tuán)之間的相互作用力有關(guān),如氫鍵、靜電相互作用、范德華力等[16]。當(dāng)?shù)蛷?qiáng)度超聲波處理時,超聲波的空穴作用和機(jī)械作用使蛋白內(nèi)部的次級鍵斷裂[17],導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)展開,β-折疊含量增加,無規(guī)則卷曲減少。當(dāng)處理強(qiáng)度進(jìn)一步增大時,β-Lg內(nèi)部基團(tuán)之間相互靠近,β-折疊含量減少,無規(guī)則卷曲含量增加,使之前展開的蛋白結(jié)構(gòu)又變得致密。

2.3自由巰基含量分析

巰基基團(tuán)是蛋白質(zhì)中重要的功能性基團(tuán),能相互交聯(lián)形成二硫鍵,維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。每個β-Lg單體中都含有5個半胱氨酸殘基,兩個二硫鍵(Cys66～Cys160、Cys106～Cys199)和一個自由巰基(Cys121),其中游離的第121位半胱氨酸包埋在β-Lg分子內(nèi)部[18]。圖2是不同超聲處理功率對β-Lg自由巰基含量的影響。從圖2可以看出,經(jīng)過超聲波處理后β-Lg的自由巰基含量均有不同程度的降低?？赡茉蚴浅暡ㄗ饔眠^程中的氣泡破裂會產(chǎn)生高強(qiáng)度的震動波和剪切力造成了β-Lg結(jié)構(gòu)的改變,使得β-Lg發(fā)生去折疊,其內(nèi)部的自由巰基(Cys121)暴露到蛋白表面。同時,超聲波的空化效應(yīng)會使水分子分解成高活性的氫自由基和羥基自由基,并與暴露到蛋白表面的自由巰基反應(yīng),使β-Lg自由巰基含量減少。因此超聲波過程中產(chǎn)生的自由基和暴露的自由巰基作用導(dǎo)致了β-Lg自由巰基含量減少[19]。

圖2　超聲波處理對β-Lg自由巰基含量的影響Fig.2　Effects of ultrasound treatment on free sulfhydryl groups of β-Lg

2.4表面疏水性分析

蛋白質(zhì)的表面疏水性是蛋白質(zhì)表面與極性水溶液環(huán)境接觸的疏水基團(tuán)的參數(shù),是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的重要作用力之一,對蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的研究具有重要意義。過敏原β-Lg是由親水層包圍、具有疏水內(nèi)核的、擁有一定空間構(gòu)型的球形分子,其表面疏水性的大小是通過β-Lg表面的疏水性氨基酸與ANS形成的結(jié)合物的熒光強(qiáng)度來表示。圖3是不同超聲波處理?xiàng)l件對β-Lg表面疏水性的影響。從圖3可以看出,經(jīng)超聲波處理后,β-Lg的表面疏水性均增加,且隨超聲功率的增加呈先增加后降低的趨勢,并在400 W時達(dá)到最大,H0為1945。β-Lg有許多疏水性氨基酸且大部分被掩埋在分子內(nèi)部,然而由于超聲波的空穴效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)會導(dǎo)致過敏原蛋白內(nèi)部的疏水性區(qū)域外翻到蛋白分子表面,且與疏水性探針ANS結(jié)合,使其表面疏水性增加。隨著超聲波處理強(qiáng)度的進(jìn)一步增大,蛋白分子內(nèi)部的電荷分布發(fā)生改變,導(dǎo)致β-Lg內(nèi)部基團(tuán)相互靠近,β-Lg發(fā)生部分折疊,使分子表面的疏水性氨基酸重新掩埋到分子內(nèi)部。這說明超聲波這種溫和的處理技術(shù)對蛋白表面疏水性的改變是可逆的[20]。對比表1和圖3可以看出,β-Lg的β-折疊含量和表面疏水性均呈先增加后降低的趨勢,且均在400 W 25 min時達(dá)到最大,這進(jìn)一步的證明在超聲波處理過程中(0～550 W),β-Lg的結(jié)構(gòu)發(fā)生了先展開后折疊的變化。

圖3　超聲波處理對β-Lg表面疏水性的影響Fig.3　Effects of ultrasound treatment on the surface hydrophobicity of β-Lg

2.5抗原性分析

采用間接競爭ELISA法檢測超聲波處理對β-Lg抗原性的影響,結(jié)果如圖4所示。經(jīng)超聲波處理后,β-Lg的抗原性均有顯著增加,且在400 W 25 min時達(dá)到最大,為2540.20 μg/mL,比未處理樣品增加了133%。

在天然狀態(tài)下,過敏原蛋白有90%以上的表位為構(gòu)象性表位,而且有些線性表位是構(gòu)象性表位的組成部分,這說明過敏原蛋白的空間結(jié)構(gòu)與抗原性密切相關(guān)[21-22]。β-Lg的三維結(jié)構(gòu)是由8個反平行片層、一個α-螺旋和一個β-轉(zhuǎn)角組成,這10個片層組成了一個桶狀結(jié)構(gòu),這個桶狀結(jié)構(gòu)主要是靠疏水相互作用、二硫鍵以及氫鍵等次級鍵來穩(wěn)定β-Lg的空間結(jié)構(gòu),這主要是由于超聲波處理會破壞過敏原β-乳球蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。從圖4中可以看出隨著超聲波強(qiáng)度的增大,β-乳球蛋白的抗原性呈先增加后降低的趨勢。結(jié)合圓二色譜、自由巰基以及表面疏水性等實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,這可能是因?yàn)棣?乳球蛋白結(jié)構(gòu)展開,表現(xiàn)為β-折疊含量增加、自由巰基暴露、掩埋在β-Lg分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)外翻等,使部分隱性過敏表位變?yōu)轱@性,更易與抗體特異性結(jié)合,抗原性增加,且在400 W 25 min時β-Lg的抗原性達(dá)到最大。而隨著超聲波處理強(qiáng)度的進(jìn)一步增加,抗原性有所降低,但仍比未處理樣品要高。這可能是由于β-Lg結(jié)構(gòu)發(fā)生部分折疊,表現(xiàn)為β-折疊含量降低和表面疏水性下降,蛋白分子表面的抗原表位重新掩埋到分子內(nèi)部(如過敏表位Val41～Lys60,Tyr102～Val124,Arg 149～I(xiàn)le162),使抗體不能與這些掩埋在分子內(nèi)部的抗原表位結(jié)合,抗原性降低。因此β-Lg抗原性的變化與其結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)。

圖4　超聲波處理對β-Lg抗原性的影響Fig.4　Effects of ultrasound treatment power on antigenicity of β-Lg

3　結(jié)論

綜上所述,超聲波處理會迫使β-Lg的二、三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而導(dǎo)致蛋白的抗原性也隨之改變。隨著超聲波功率的增加,β-Lg的空間結(jié)構(gòu)展開,在400 W 25 min時,展開程度達(dá)到最大,其內(nèi)部的過敏表位暴露,導(dǎo)致抗原性達(dá)到最大(2540.20 μg/mL)。隨著超聲波功率的進(jìn)一步增加,β-Lg發(fā)生部分折疊,過敏表位被掩蓋,在550 W 25 min時抗原性開始下降。因此抗原性的變化與其結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)。

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Effect of ultrasound treatment on structure and antigenicity ofβ-lactoglobulin

LI Xue1,TU Zong-cai1,2，*，QI Wu-cheng1,WANG Hui1,YANG Wen-hua1,TIAN Ming1

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.College of Life Science,Jiangxi Normal University,Nanchang 330022,China)

In order to study the effect of ultrasound treatment on structure and antigenicity ofβ-lactoglobulin(β-Lg),SDS-PAGE,circular dichroism spectra,fluorescence spectrum and indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay were used to measure the structure and antigenicity,respectively. The molecular weight ofβ-Lg was not significant change,free sulfhydryl groups decreased,the content ofβ-sheet and surface hydrophobicity firstly increased and then decreased with the increasing of ultrasonic power. The content ofβ-sheet and surface hydrophobicity reached the maximum with 400 W ultrasound treatment. It was indicated thatβ-Lg could be unfolded and spacial structure was destroyed by ultrasound treatment. Meanwhile,the antigenicity ofβ-Lg was also firstly increased and then decreased. When it was treated at 400 W for 25 min,the antigenicity ofβ-Lg increased up to 2540.20 μg/mL,showing an increase by 133%. The results indicated that the unfolding ofβ-Lg might result in the allergic epitope exposed. Therefore,the antigenicity change ofβ-Lg was probably related to its spacial structural alteration induced by ultrasound treatment.

ultrasound;β-lactoglobulin;enzyme-linked immunosorbent assay;structure;antigenicity

2016-03-04

李雪(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品資源開發(fā)與高效利用，E-mail:lixue0616@foxmail.com。

涂宗財(1965-)，男，博士，教授，研究方向:食品資源開發(fā)與高效利用，E-mail：tuzc_mail@aliyun.com。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(863計劃)2013AA102205;國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31460395)。

TS252.1

A

1002-0306(2016)18-0106-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.012