丁苗苗，楊凱倫，王東亮，汝文文，黃 瑞，劉志東，李 楠，張 兵

（1.天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.東阿阿膠股份有限公司，國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，聊城 252200）

超微粉碎對(duì)西洋參中人參皂苷體外溶出的影響研究*

丁苗苗1，楊凱倫1，王東亮2，汝文文2，黃 瑞1，劉志東1，李 楠1，張 兵1

（1.天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.東阿阿膠股份有限公司，國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，聊城 252200）

［目的］考察超微粉碎技術(shù)對(duì)西洋參中人參皂苷成分溶出的影響，為西洋參的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。［方法］采用恒溫水浴磁力攪拌方式進(jìn)行體外溶出實(shí)驗(yàn)，超高液相色譜法（UPLC）測(cè)定西洋參超微粉和粗粉中人參皂苷Re、Rb1的含量，計(jì)算累積溶出度，繪制溶出曲線，比較兩者中人參皂苷的溶出速率。［結(jié)果］西洋參超微粉中人參皂苷Rb1的累積溶出度高于粗粉，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），人參皂苷Re的累積溶出度，超微粉與粗粉比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），西洋參中人參皂苷Rg1含量過(guò)低，未做溶出考察。［結(jié)論］超微粉碎可以促進(jìn)西洋參中人參皂苷Rb1的溶出，對(duì)人參皂苷Re的溶出無(wú)影響。

西洋參；超微粉碎；人參皂苷Rg1、Re、Rb1；體外溶出

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.05.11

超微粉碎技術(shù)是應(yīng)用于中藥領(lǐng)域中的一項(xiàng)新技術(shù)，超微粉碎后的中藥，細(xì)胞破壁率增加，有效成分充分暴露，有利于藥物的釋放和吸收，提高生物利用度［1］，與傳統(tǒng)粉碎技術(shù)相比，具有廣闊的市場(chǎng)前景和社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。超微粉碎是在粉體學(xué)基礎(chǔ)上，利用機(jī)械或流體力學(xué)將直徑大于3 mm以上的中藥粉碎至75 μm以下的操作技術(shù)［2］。其主要作用原理是通過(guò)強(qiáng)烈的沖擊力或氣流使物料與磨體或物料間相互碰撞、摩擦和剪切，以達(dá)到粉碎目的，從而使物質(zhì)表面發(fā)生特定變化。常見(jiàn)的粉碎機(jī)主要有機(jī)械沖擊式、氣流式以及攪拌磨和振動(dòng)磨等。由于其具有提高有效成分溶出速率、生物利用度高、節(jié)約中藥資源、藥物均勻度高等優(yōu)勢(shì)，超微粉碎技術(shù)逐漸應(yīng)用于一些貴重藥材或者稀少的中藥材品種上［3］。西洋參（Panax quinquefolium L.）是五加科人參屬多年生草本植物，藥用為根，別名西洋人參、洋參、花旗參，主產(chǎn)于美國(guó)、加拿大及法國(guó)。是一種具有特殊醫(yī)療價(jià)值的貴重補(bǔ)益藥物。西洋參具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津等功效，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健品和食品中［4］。現(xiàn)代藥理研究表明，西洋參具有增強(qiáng)免疫、抗疲勞、保護(hù)心肌細(xì)胞，抑制血管痙攣、抗高血壓等作用［5］。

人參皂苷是西洋參中主要有效成分，含量也最為豐富，《中國(guó)藥典》以人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量作為西洋參質(zhì)量衡量標(biāo)準(zhǔn)，其中人參皂苷Rb1和Re的含量占西洋參總皂苷含量的50%以上［6-7］。人參皂苷具有多種生物活性，人參皂苷Re有較強(qiáng)的抗缺血性心率失常［8］，抗氧化，抗衰老作用［9］，此外還具有鎮(zhèn)靜、抗利尿［10］，增強(qiáng)藥物的透皮吸收［11］等功能。人參皂苷Rg1具有保護(hù)心肌細(xì)胞［12］，降血糖［13］，抗纖維化［14］等作用。人參皂苷Rb1具有雙向調(diào)節(jié)血壓，改善心功能［15］，提高超氧化物歧化酶（SOD）含量，對(duì)腦組織損傷有較好的保護(hù)作用［16］，能夠減慢心率、降低血壓，對(duì)心肌損傷起到緩解和保護(hù)的作用［17］，這3種有效成分的藥理活性通?？梢员磉_(dá)西洋參的多效性。通過(guò)參照《中國(guó)藥典》（2010版）、文獻(xiàn)［7-20］及活性成分的藥理作用確定西洋參測(cè)定指標(biāo)為人參皂苷Rg1、Re、Rb1。本實(shí)驗(yàn)主要考察將西洋參超微粉碎后的超微粉和一般粉碎方式所得粗粉中人參皂苷Rg1、Re、Rb1體外溶出的差異，分析超微粉碎對(duì)西洋參中人參皂苷體外溶出的影響，為西洋參等滋補(bǔ)藥材超微粉體的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

超高效液相色譜儀（UPLC，Waters，美國(guó)），Mastersizer 2000激光粒度儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司），AX205電子天平（METTLERTOLEDO，瑞士），DELTTA320 PH計(jì)（METTLER TOLEDO，瑞士），Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，美國(guó)），C3860A超聲清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（TK-6H，上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）。

西洋參超微粉、西洋參粗粉（山東東阿阿膠保健品有限公司，批號(hào)20151029），人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品：純度95%（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110703-102228），人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品：純度92.7%（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110754-201324），人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品：純度93.7%（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110704-201424），乙腈：色譜純（默克公司），甲醇：色譜純（默克公司），磷酸二氫鉀、氫氧化鈉均為分析純（天津市光復(fù)化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 西洋參粉末粒徑測(cè)定 參考2010版藥典粒徑測(cè)定方法（附錄IX E），以水為分散介質(zhì)，采用馬爾文2000粒徑測(cè)定儀測(cè)定西洋參超微粉和粗粉的粒徑，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 西洋參粉末粒徑 μm

2.2 人參皂苷Rg1、Re、Rb1分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 ACQUITY?UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），UPLC HSS T3預(yù)柱（2.1 mm×5 mm，1.8 μm），柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，流速為0.3 mL/min，，進(jìn)樣量為1 μL（進(jìn)樣體積范圍：0.1～10.0 μL標(biāo)配），梯度洗脫見(jiàn)表2［20］。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，加甲醇適量溶解，得到含人參皂苷Rg1為202.8 mg/L、人參皂苷Re為200.8 mg/L、人參皂苷Rb1為202.4 mg/L的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取不同時(shí)間溶出的介質(zhì)溶液，樣品經(jīng)14 000 r/min，25 min離心，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.2.4 專屬性考察 空白溶出介質(zhì)溶液對(duì)西洋參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的測(cè)定無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1 UPLC色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 人參皂苷Rg1在1.872～29.954 mg/L（r=0.999 8）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；人參皂苷Re在1.860～29.753 mg/L（r=0.999 7）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；人參皂苷Rb1在1.868～29.888 mg/L （r=0.999 8）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 人參皂苷Rg1、Re、Rb1峰面積的RSD均小于1.5%，表明儀器精密度良好。見(jiàn)表3。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取人參皂苷Rg1、Re、Rb1混標(biāo)儲(chǔ)備液，分別用水、pH1.2鹽酸溶液以及pH6.8、pH7.2、pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液稀釋得到樣品溶液，置于37℃恒溫浴中振蕩，于0、1、2、4、6、8 h取樣，UPLC分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參皂苷在pH1.2的中不穩(wěn)定，在水以及pH6.8、pH7.2、pH7.4的PBS溶液中可以保持8 h穩(wěn)定。見(jiàn)表4。

表3 人參皂苷Rg1、Re、Rb1的精密度

表4 人參皂苷Rg1、Re、Rb1在不同溶劑中8 h內(nèi)的穩(wěn)定性

2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一樣品6份，每份樣品液加入混合對(duì)照品溶液適量，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行UPLC分析。根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算其回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，方法可行。

表5 樣品加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 恒溫水浴磁力攪拌體外溶出實(shí)驗(yàn) 分別稱取西洋參超微粉和粗粉約20 mg，平行3份，置于燒杯中，溶于25 mL，pH7.2PBS，將小杯置于（37±0.5）℃恒溫水浴槽中，設(shè)定轉(zhuǎn)速600 r/min，開(kāi)啟電磁攪拌，分別于2、5、10、15、30 min取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)充同溫度同體積的空白溶出介質(zhì)1mL，樣品經(jīng)14000r/min，25 min高速離心取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，照“2.2.1”色譜條件，UPLC分析，計(jì)算累積溶出率，繪制溶出曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3和表6。

圖2 人參皂苷Re體外溶出曲線

圖3 人參皂苷Rb1體外溶出曲線

表6 西洋參超微粉和粗粉中人參皂苷各時(shí)間累積溶出率（±s）

表6 西洋參超微粉和粗粉中人參皂苷各時(shí)間累積溶出率（±s）

成分 累積溶出率（%） 累積溶出率（%）Re 97.7±1.8 94.3±2.7 96.2±2.3 96.4±3.3 100.9±4.0 97.7±3.4 98.6±5.5 98.5±3.9 102.3±5.4 96.6±1.3 Rb1 53.5±1.2 33.0±3.3 56.9±1.8 36.3±2.1 60.7±1.8 39.5±1.4 61.1±2.0 39.1±1.6 62.9±2.1 40.6±1.9超微粉 粗粉取樣時(shí)間（min）2 5 1 0 15 30 2 5 1 0 15 30 n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6

西洋參超微粉和粗粉中人參皂苷Rb1、Re的溶出速率經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較分析，西洋參超微粉中人參皂苷Rb1的溶出速率高于粗粉，兩者比較具有極顯著性差異（P＜0.01）；人參皂苷Re的累積溶出率，西洋參超微粉與粗粉比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超微粉碎可以促進(jìn)西洋參中人參皂苷Rb1的溶出，而對(duì)于西洋參中人參皂苷Re的體外溶出度無(wú)影響。

3 討論

在實(shí)驗(yàn)中按照中國(guó)藥典（2010年版2部附錄XC）溶出度測(cè)定方法，采用槳法進(jìn)行西洋參超微粉和粗粉體外溶出實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察到西洋參超微粉相互吸引而發(fā)生團(tuán)聚，形成超微粉的團(tuán)聚體；而西洋參粗粉分散狀態(tài)較均勻，未出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。由于超微粉形成團(tuán)聚體使其分散性變差，流動(dòng)性差，降低了人參皂苷從超微粉中的溶出速率。為排除超微粉形成團(tuán)聚體對(duì)超微粉中人參皂苷溶出速率的影響，改進(jìn)了溶出實(shí)驗(yàn)方法，采用恒溫水浴磁力攪拌體外溶出實(shí)驗(yàn)，考察超微粉碎對(duì)西洋參中人參皂苷體外溶出速率的影響。

恒溫水浴磁力攪拌體外溶出實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，筆者考察了200、300、600 r/min的轉(zhuǎn)速對(duì)西洋參超微粉和粗粉中人參皂苷體外溶出速率的影響。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)速為200、300 r/min時(shí)，5～10 min的取樣點(diǎn)，超微粉中人參皂苷Rb1、Re都有上升的趨勢(shì)，分析超微粉在低轉(zhuǎn)速時(shí)仍需數(shù)分鐘破除團(tuán)聚現(xiàn)象，當(dāng)轉(zhuǎn)速升高為600 r/min時(shí)，基本解決了團(tuán)聚的影響，且600 r/min為本實(shí)驗(yàn)室所能達(dá)到的最大轉(zhuǎn)速，因此本實(shí)驗(yàn)最終確定轉(zhuǎn)速為600 r/min。

本實(shí)驗(yàn)初始以人參皂苷Rg1、Rb1、Re為溶出速率指標(biāo)性成分，由于人參皂苷Rg1在西洋參中含量過(guò)低，實(shí)驗(yàn)條件下未達(dá)到儀器定量限，所以本實(shí)驗(yàn)最終以人參皂苷Rb1、Re為溶出速率指標(biāo)性成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，西洋參超微粉可以顯著提高人參皂苷Rb1的溶出速率，說(shuō)明藥材經(jīng)過(guò)超微粉碎后，有利于藥物有效成分的溶出。這與文獻(xiàn)報(bào)道具有一致性［21-22］。

西洋參超微粉和粗粉中人參皂苷Re的溶出速率無(wú)差異，說(shuō)明超微粉碎對(duì)人參皂苷Re的溶出無(wú)影響，這可能是由于人參皂苷Re為四環(huán)三萜類人參三醇型皂苷，較四環(huán)三萜類人參二醇型人參皂苷Rb1的分子量更小一些，空間位阻相對(duì)減小，溶出速度會(huì)快一些，然而超微粉表面積大，表面能高，體系內(nèi)不穩(wěn)定有較強(qiáng)的吸引力，為達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)，粒子產(chǎn)生團(tuán)聚，使其分散性、流動(dòng)性變差，掩蓋了超微粉的溶出優(yōu)勢(shì)。另一方面可能是粉末在溶出過(guò)程中存在溶出與吸附平衡，微粉溶出雖然稍多，但藥材超微粉碎粒度過(guò)小，藥材表面積急劇增大而使其表面能增加，藥物粉體吸附力增大，從而不易溶出［23］。也有文獻(xiàn)［24］報(bào)道由于超微粉的團(tuán)聚不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，將超微粉制粒成型后能夠有效地解決該缺陷，且成型產(chǎn)品質(zhì)量較超微粉更穩(wěn)定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同粒徑對(duì)人參皂苷不同單體影響并不是完全相同，超微粉碎技術(shù)可以顯著提高西洋參中人參皂苷Rb1的溶出速率，而對(duì)于人參皂苷Re的溶出無(wú)影響。因此在西洋參應(yīng)用過(guò)程中，應(yīng)該根據(jù)入藥的具體情況，結(jié)合藥理活性，綜合制造成本，多選幾種評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定其合理粉碎粒徑范圍。

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Effect of ultrafine comminution on ginsenoside dissolution rate in Panax quinquefolium L.

DING Miao-miao1，YANG Kai-lun1，WANG Dong-liang2，RU Weng-weng2，HUANG Rui1，LIU Zhi-dong1，LI Nan1，ZHANG Bing1
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Dong-E-E-Jiao Co.，Ltd.，National Engineering Technology Research Center of Glue of Traditional Medicine，Liaocheng 252200，China）

［Objective］To investigate the effect of ultrafine comminution on ginsenoside dissolution rate in Panax quinquefolium L.［Methods］Vitro dissolution tests were performed，in which homoiothermal water was stirred magnetically and UPLC was used to detect the content of ginsenoside Rb1，Re in ultrafine powder and coarse of Panax quinquefolium L.By calculating cumulative dissolution and making the curves of dissolution rate，the comparison of dissolving rates of powder in ultrafine and coarse was achieved.［Results］The cumulative dissolution of ginsenoside Rb1 in ultrafine powder was higher than in coarse powder.Significant difference（P＜0.01）was found between that in ultrafine powder and coarse，while the dissolution rates of ginsenoside Re had no significant different in ultrafine powder and coarse powder.The dissolution rate of ginsenoside Rg1 was not investigated as it's content was too low.［Conclusion］Ultrafine pulverization technology can increase the dissolution rate of ginsenoside Rb1.However，it has no effect on the dissolution rate of ginsenosides Re.

Panax quinquefolium L.；ultrafine comminution；ginsenoside Rg1，Re，Rb1；dissolution rate

R285.5

A

1673-9043（2016）05-0327-05

2016-05-05）

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-12-1068A）。

丁苗苗（1990-），女，碩士研究生，主要從事中藥制劑方向的研究。

劉志東，E-mail:lonerliuzd@163.com；李 楠，E-mail:linan20080402@163.com。