張影月，韓亞亞，郝 佳，王 濤，劉二偉

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193；2.天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

·中藥研究·

炮制時(shí)間對(duì)杜仲指標(biāo)成分含量及藥代動(dòng)力學(xué)影響研究*

張影月1，韓亞亞1，郝 佳2，王 濤2，劉二偉2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193；2.天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

［目的］建立液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）應(yīng)用于同時(shí)測(cè)定不同炮制時(shí)間杜仲中主要成分京尼平苷（GP）、京尼平苷酸（GPA）、桃葉珊瑚苷（AU）、松脂醇二葡萄糖苷（SG）的定量分析方法，研究不同炮制時(shí)間對(duì)杜仲中4個(gè)指標(biāo)成分在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為的影響。［方法］按照杜仲的藥典鹽炮制方法炮制，分別于0、1、2、4 h取樣。以馬錢子素（MS）為內(nèi)標(biāo)，應(yīng)用LC-MS/MS建立的方法測(cè)定不同炮制時(shí)間杜仲中4個(gè)目標(biāo)成分含量及藥代動(dòng)力學(xué)入血成分含量。［結(jié)果］各目標(biāo)成分在測(cè)定范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系；杜仲炮制時(shí)間宜控制在2 h較為合理。［結(jié)論］本研究從體內(nèi)暴露角度描述了炮制對(duì)目標(biāo)成分的影響，研究結(jié)果對(duì)杜仲的炮制和臨床應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

杜仲；炮制；LC-MS/MS；藥代動(dòng)力學(xué)

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.05.10

杜仲為杜仲科植物杜仲（EucommiaulmoidesOliv）的干燥樹(shù)皮。性微辛，溫；歸肝腎經(jīng)。主要用于肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無(wú)力、頭暈?zāi)垦！⑷焉锫┭?、胎?dòng)不安［1］。主要成分有苯丙素類、木質(zhì)素類和環(huán)烯醚萜類成分，具有降血壓、抗腫瘤、抗菌和抗病毒等功效［2-4］。杜仲的炮制方法很多，目的多為減毒增效或擴(kuò)大其藥用范圍［5］。鹽杜仲以鹽水炙，“文火”炒制，原則以“斷絲”為度，并無(wú)嚴(yán)格的時(shí)間限制，有研究從體外成分含量的變化研究炮制時(shí)間對(duì)炮制品質(zhì)量的影響［6-8］，從體內(nèi)暴露角度研究不同炮制時(shí)間對(duì)制杜仲質(zhì)量的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究主要以杜仲鹽炮制的時(shí)間為條件，以SD大鼠為受試對(duì)象，采用藥典杜仲鹽炮制方法，考察炮制時(shí)間對(duì)鹽杜仲中的4個(gè)主要藥效成分京尼平苷（GP）、京尼平苷酸（GPA）、桃葉珊瑚苷（AU）、松脂醇二葡萄糖苷（SG）［9-10］含量的影響及口服給藥的體內(nèi)暴露情況差異，使炮制時(shí)間控制在合理的范圍內(nèi)，以期為探究更為合理的炮制時(shí)間控制提供依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 儀器、試藥與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1 儀器與試藥 Agilent 6430 Quad LC-MS/MS （QQQ）equipped with electro-spray ionization（ESI）source（美國(guó)安捷倫公司），超純水制造機(jī)（Mill-QⅡ型）（美國(guó)Millipore公司），低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司），十萬(wàn)分之一天平（AX205）（瑞士梅特勒-托利多公司），XW-80A微型漩渦混懸儀（上海瀘西分析儀器廠有限公司），標(biāo)準(zhǔn)品：桃葉珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、馬錢子素購(gòu)自天津一方科技有限公司，經(jīng)鑒定純度在98%以上。乙腈（色譜純，美國(guó)fisher公司）。乙酸（色譜純，美國(guó)天地化學(xué)試劑公司）。羧甲基纖維素鈉（CMCNa，0.5%）中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，8周齡，180～220 g。購(gòu)自北京華阜康科技有限公司，實(shí)驗(yàn)前大鼠在天津中醫(yī)藥大學(xué)適應(yīng)性培養(yǎng)1周［控溫（23±2）℃，控濕（50±10）%］，以適應(yīng)環(huán)境。

2 樣品制備

2.1 杜仲炮制品的制備 取杜仲生藥飲片1 kg，鹽浸24 h，收干，晾干。用“文火”炒制，在炒制過(guò)程中分別于0、1、2、4 h取樣，粉碎，過(guò)80目篩。

2.2 杜仲不同炮制時(shí)間點(diǎn)供試品溶液的制備 精密稱取杜仲不同炮制粉末2.0 g，置具塞錐形瓶中，加入60%甲醇溶液50 mL，密塞，稱質(zhì)量；回流提取1 h，放冷，再稱質(zhì)量，補(bǔ)足減失質(zhì)量；搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，離心，取上清液，即得。

2.3 杜仲提取物的制備 取杜仲4個(gè)炮制時(shí)間點(diǎn)藥材各60 g，分別以10倍量體積65%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液并濃縮，濃縮液經(jīng)減壓干燥得杜仲提取物。提取率為12.7%。

3 分析方法

3.1 色譜條件 EclipsePlusC18（2.1mm×150mm，5μm）色譜柱。流動(dòng)相為乙腈（CH3CN含0.1%CH3COOH），水（H2O，含0.1%CH3COOH），梯度洗脫，柱溫：20℃，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：5 μL。見(jiàn)表1。

表1 色譜分離梯度（ESI-） %

3.2 質(zhì)譜條件 離子源干燥氣流流速為11 L/mL，溫度為330℃，毛細(xì)管電壓4.0 kV。選擇合適離子對(duì)（M/Z），優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)碰撞能量（CE）和碎裂電壓值（Fr.）。見(jiàn)表2。

表2 化合物離子對(duì)及質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)（ESI-）

4 方法學(xué)驗(yàn)證

4.1 專屬性 在3項(xiàng)的分析條件下，桃葉珊瑚苷（AU）、京東平苷（GP）、京東平苷酸（GPA）、松脂醇二葡萄糖苷（SG）、馬錢子素（MS）5個(gè)化合物分離效果良好。保留時(shí)間分別為AU 4.14 min、GPA 8.18 min、GP 19.74 min、MS 21.09 min、SG 24.72 min。

4.2 穩(wěn)定性 取大鼠空白血漿配制高、中、低3個(gè)濃度的對(duì)照品血漿樣品若干份，分別于0 h、室溫放置5 h、凍融3次、冰凍1周后按照3.1、3.2下方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果測(cè)得各成分濃度無(wú)明顯降低，結(jié)果穩(wěn)定。

4.3 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率 配制目標(biāo)成分（GP、GPA、AU、SG）高、中、低3個(gè)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將混合標(biāo)準(zhǔn)品直接溶于甲醇溶液于3.1、3.2項(xiàng)條件下檢測(cè)為純標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶于大鼠空白血漿進(jìn)樣檢測(cè)為血漿標(biāo)準(zhǔn)品峰面積，將混合標(biāo)準(zhǔn)品直接溶于經(jīng)甲醇沉淀后的大鼠空白血漿進(jìn)樣檢測(cè)為加樣標(biāo)準(zhǔn)品峰面積。計(jì)算血漿標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與純標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積的比值，即為絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)。計(jì)算血漿標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與加樣血漿標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積的比值，即為提取回收率。見(jiàn)表3。

表3 GP、GPA、AU、SG在血漿中的基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率及穩(wěn)定性

4.4 準(zhǔn)確度和精密度 處理3個(gè)濃度（高、中、低）的血漿樣品，每個(gè)濃度每日6份，連續(xù)處理3 d。記錄GPA、GP、AU、SG峰面積，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表4。

5 實(shí)驗(yàn)部分

5.1 不同炮制時(shí)間點(diǎn)樣品目標(biāo)成分含量測(cè)定 取按2項(xiàng)方法制備的樣品，每個(gè)炮制時(shí)間點(diǎn)平行取6份。應(yīng)用3項(xiàng)下的分析條件檢測(cè)，計(jì)算4批樣品中指標(biāo)成分的平均含量，見(jiàn)表5。

表4 GP、GPA、AU、SG在血漿中的準(zhǔn)確度和精密度

表5 不同炮制時(shí)間杜仲中4個(gè)指標(biāo)成分含量數(shù)據(jù)表（±s） μg/g

表5 不同炮制時(shí)間杜仲中4個(gè)指標(biāo)成分含量數(shù)據(jù)表（±s） μg/g

炮制時(shí)間（h）0 1 2 4 n 6 6 6 6 AU GP GPA SG 148.07±8.47 45.68±6.63 480.50±5.53 677.19±83.46 215.14±5.07 136.36±1.69 814.59±14.55 989.64±81.65 309.01±13.43 214.46±2.67 1 003.84±42.37 755.06±30.29 40.28±13.21 56.69±10.49 403.13±50.43 336.97±20.62

5.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將24只SD大鼠分為4組，依次灌胃給以炮制0、1、2、4 h杜仲提取物（500 mg/kg），每組平行給藥6只大鼠。給藥后，分別在0、5、10、15、30 min，1、2、3、5、8、12、24 h從大鼠內(nèi)眥靜脈叢取血約0.3 mL，放入肝素化的離心管中離心（8 000 r/min，10 min），取上清血漿50 μL于1.5 mL EP管中，加入150 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋，離心（14 000 r/min，10 min）。取上清液于3.1、3.2項(xiàng)條件下進(jìn)樣檢測(cè)。

5.3 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用DAS軟件（Drug and Statistics，中國(guó)數(shù)學(xué)藥理學(xué)會(huì)，孫瑞元等編制）擬合曲線并計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

6 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示炮制時(shí)間對(duì)杜仲質(zhì)量具有重要影響（表5），分析數(shù)據(jù)證明加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使杜仲有效成分含量下降。從結(jié)果可以看出隨著炮制時(shí)間延長(zhǎng)部分成分含量下降達(dá)7倍以上。由圖1可見(jiàn)，炮制時(shí)間延長(zhǎng)杜仲中指標(biāo)成分含量均呈明顯下降趨勢(shì)，松脂醇二糖苷在0～1 h有增加趨勢(shì)，京尼平苷、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷在1～2 h有明顯增加趨勢(shì)。

圖1 杜仲中指標(biāo)成分AU、GP、GPA、SG變化趨勢(shì)圖

圖2 不同炮制時(shí)間杜仲口服給藥后血漿中所測(cè)化合物藥時(shí)曲線比較

口服不同炮制時(shí)間的杜仲提取物后，藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2，可見(jiàn)口服炮制2 h的杜仲提取物，京尼平苷和京尼平苷酸的最高血藥濃度Cmax為最高，為口服炮制0 h提取物Cmax的2倍左右。AUC0-24h和AUC0-∞均為最高，可見(jiàn)炮制時(shí)間的不同可以影響京尼平苷和京尼平苷酸在體內(nèi)的暴露水平，炮制2 h口服給藥提高了它們?cè)诖笫篌w內(nèi)的血藥濃度。口服炮制1 h的杜仲提取物，桃葉珊瑚苷和松脂醇二糖苷的最高血藥濃度Cmax為最高，為口服炮制4 h提取物的2倍左右，從AUC值分析，2 h炮制時(shí)間大部分成分體內(nèi)暴露最高。AUC0-24h和AUC0-∞無(wú)明顯變化趨勢(shì)，可見(jiàn)炮制時(shí)間對(duì)桃葉珊瑚苷和松脂醇二糖苷的體內(nèi)暴露水平無(wú)明顯的影響，說(shuō)明提取物中指標(biāo)成分含量和體內(nèi)暴露情況并不完全一致，但體外和體內(nèi)結(jié)果均表明杜仲炮制4 h時(shí)指標(biāo)成分均顯著下降，提示杜仲炮制炒制時(shí)間不宜超過(guò)4h。見(jiàn)表6、表7。

7 結(jié)論

有關(guān)杜仲成分的現(xiàn)代儀器分析方法中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，具有高靈敏度和高專屬性［11-13］，適用于杜仲中微量成分的研究分析以及藥代動(dòng)力學(xué)研究［14-16］。本實(shí)驗(yàn)建立了高靈敏度的LC-MS/MS方法，以馬錢子素為內(nèi)標(biāo)，同時(shí)測(cè)定生物血漿樣品中京尼平苷、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷和松脂醇二葡萄糖苷含量，并通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證。由表6、表7可以看出，口服炮制2 h杜仲提取物AU、GPA、GP曲線下面積AUC0-24h相對(duì)于口服其他炮制點(diǎn)的提取物有明顯升高，由此可見(jiàn)炮制2 h杜仲中的主要成分相對(duì)于其他炮制時(shí)間杜仲在大鼠體內(nèi)的吸收量有所提高，表明了合理的炮制時(shí)間對(duì)于杜仲中主要成分在大鼠體內(nèi)的吸收有一定的促進(jìn)作用，可提高杜仲中藥效成分的生物利用度。中藥藥效作用具有多樣性和復(fù)雜性［17-18］，本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)暴露水平角度表征了中藥多組分在生物體內(nèi)的整體藥代動(dòng)力學(xué)特征，反應(yīng)了杜仲中主要成分在生物體內(nèi)的存留特性，為最終闡明炮制對(duì)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的影響以及建立獨(dú)具特色的中藥藥代動(dòng)力學(xué)理論提供一定的依據(jù)［19-20］。

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表6 不同炮制時(shí)間杜仲口服給藥后GP、GPA的藥代參數(shù)

表7 不同炮制時(shí)間杜仲口服給藥后AU、SG的藥代參數(shù)

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Influence of processing time on Eucommia cortex and its pharmacokinetics study

ZHANG Ying-yue1，HAN Ya-ya1，HAO Jia2，WANG Tao2，LIU Er-wei2
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine Research，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae，Ministry of Education，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objectives］To develop a set of LC-MS/MS method for the simultaneous determination the compound of geniposide，geniposidic acid，aucubin and pinoresinol diglucoside in the different processed barks of Eucommia and for the analysis of biolcgical samples which contain the compound of geniposide，geniposidic acid，aucubin and pinoresinol diglucoside from the rats'oral administration of the Eucommia.［Methods］The Eucommia was processed with saline water according to Chinese pharmacopoeia.In the parch processing course，samples were randomly collected at 0，1，2 and 4 h respectively.Validation of a high performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry LC-MS/MS （QQQ）method，with the strychni prime as internal standard，was used for the determination of the four target compounds in rats'plasma to study the pharmacokinetics of Eucommia.［Results］The determination methods with good precision and stability were suitable for the assay of Eucommia in the biological samples.It is reasonable to control the process time for Eucommia at 2 hours.［Conclusion］Additionally，these constituents demonstrated good pharmacokinetic properties in the body.The pharmacokinetics parameters in our research provided with information for the clinical application.

Eucommia；processing；LC-MS/MS；pharmacokinetics

R283.1

A

1673-9043（2016）05-0322-05

2016-06-05）

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金聯(lián)合資助課題（20131210120010）；國(guó)家科技重大專項(xiàng)“孵化基地”課題（2013ZX09401004）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（TD12-5036，TD12-5033）；天津市抗癌重大專項(xiàng)項(xiàng)目（12ZCDZSY17000）。

張影月（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幋鷦?dòng)力學(xué)。

劉二偉，E-mail:liuwei628@hotmail.com。