張潔塵 楊永紅 李志量 馮素英

·論著·

用石蠟切片行C3d、C4d免疫組化染色輔助診斷大皰性類天皰瘡的意義

張潔塵 楊永紅 李志量 馮素英

目的 探討C3d、C4d免疫組化染色在石蠟包埋組織切片中輔助診斷大皰性類天皰瘡的價(jià)值。方法 通過免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)20例大皰性類天皰瘡患者石蠟包埋組織切片中C3d、C4d的表達(dá)，并與家族性良性天皰瘡、大皰性表皮松解癥患者及正常皮膚進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果 20例大皰性類天皰瘡患者石蠟包埋切片C3d、C4d真表皮交界基底膜處沉積率為95%（19/20），9例大皰性表皮松解癥患者中真表皮交界基底膜處C3d、C4d陽(yáng)性率0%（0/9），4例家族性慢性良性天皰瘡患者基底膜帶均為陰性。結(jié)論石蠟包埋組織切片中，C3d、C4d免疫組化染色可以作為輔助診斷大皰性類天皰瘡的方法之一。

類天皰瘡，大皰性；石蠟包埋；顯微切片術(shù)；免疫組織化學(xué)；補(bǔ)體C3d；補(bǔ)體C4d

大皰性類天皰瘡（BP）是以自身抗體及補(bǔ)體在皮膚基底膜帶沉積為主要特征的自身免疫性大皰病。自身免疫抗體針對(duì)半橋粒復(fù)合物蛋白BP180、BP230，而半橋粒是將角質(zhì)形成細(xì)胞基底錨定到其下方基底膜的結(jié)構(gòu)。目前研究認(rèn)為，補(bǔ)體激活途徑參與其發(fā)病機(jī)制中，而補(bǔ)體可通過直接免疫熒光（DIF）檢測(cè)。免疫熒光技術(shù)建立以來，BP是首先應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)的疾病之一［1］。然而，由于DIF檢測(cè)需要新鮮冰凍組織，臨床不易開展，對(duì)于組織病理懷疑BP，而臨床遺漏行DIF檢測(cè)的患者，常需要重復(fù)取材，增加了患者的負(fù)擔(dān)。因此，我們對(duì)石蠟包埋組織切片行組織化學(xué)染色是一種可行的補(bǔ)救措施。補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典激活途徑及替代激活途徑參與了BP的發(fā)?。?］。激活的補(bǔ)體降解產(chǎn)物C3d、C4d已被證明是體液性排斥的重要標(biāo)志，已應(yīng)用于腎移植體液免疫排斥反應(yīng)的檢測(cè)［3］，其沉積與排斥嚴(yán)重程度以及預(yù)后密切相關(guān)。近期研究顯示，C3d及C4d免疫組化在石蠟包埋皮膚活檢組織標(biāo)本中，具有診斷炎癥性皮膚病的作用，包括BP的診斷［4］?，F(xiàn)將我們的研究報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象：2011—2014年，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院確診為BP的患者20例，其中女7例，男13例，年齡58～90歲。對(duì)照組9例為先天性大皰性表皮松解癥（EB）患者，女4例，男5例。年齡7～57歲；家族性良性天皰瘡患者（HH）4例，其中女2例，男2例，年齡45～58歲，健康對(duì)照4例，均來自本院外科整形美容手術(shù)切除新鮮健康人皮膚組織。根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、組織病理檢查、免疫熒光檢查、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定或鹽裂皮膚間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢查確診。

作者單位：210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院 江蘇省皮膚病與性病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室皮膚科（第二作者現(xiàn)在濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院科研處）

1.2 方法：

1.2.1 主要試劑：兔抗人C3d多克隆抗體，兔抗人C4d多克隆抗體（ab136916，美國(guó)Abcam公司），免疫組化試劑盒（SP9706，UltraSensitive TM S-P 超敏試劑盒，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），DAB試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.2.2 方法：免疫組化SP法，將石蠟包埋組織切片（厚度4.5 μm），常規(guī)脫蠟水化，微波抗原修復(fù)然后用過氧化氫酶抑制劑作用10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，加正常山羊血清封閉液，室溫孵育10 min；滴加一抗，4℃過夜（設(shè)空白對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照）C3d抗體1∶300稀釋，C4d抗體1∶200稀釋，加HRP標(biāo)記的二抗，室溫靜置15 min，DAB顯色5～10 min，蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化，脫水、透明，中性樹脂膠封片。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判定：3名研究人員分別盲判，7 d后重復(fù)判定。兩次均判定為陽(yáng)性的標(biāo)記為陽(yáng)性。陽(yáng)性結(jié)果定義為C3d、C4d在基底膜處呈線性沉積。陰性結(jié)果為C3d、C4d僅在水皰腔、水皰頂部或底部沉積，而無皮損周邊皮膚的基底膜沉積。

1.3 結(jié)果：

1.3.1 BP組：20例BP患者中19例出現(xiàn)C3d、C4d在水皰周圍基底膜線狀沉積。20例組化切片中出現(xiàn)水皰的17例，13例皰頂可見C3d、C4d線狀沉積，15例皰底可見C3d、C4d線狀沉積；其中在水皰頂部及底部均有沉積，而水皰周邊基底膜無C3d、C4d沉積的1例；僅在皰頂C3d、C4d沉積的1例，無C3d、C4d沉積在皰底的患者（圖1）。

1.3.2 對(duì)照組：EB患者9例，HH患者4例以及健康對(duì)照的4例皮膚均未見基底膜線狀沉積（圖2，3）。

2 討論

Magro 等［4］將 C3d、C4d 石蠟包埋組織免疫組化應(yīng)用于炎癥皮膚病的輔助診斷，包括膠原血管疾?。t斑狼瘡、皮肌炎）、血管病變（卟啉病、血管栓塞綜合征、脈管栓塞綜合征、壞死性血管炎）、自身免疫性皰?。ㄌ彀挴彙P）。Chandler等［5］使用 C4d 石蠟包埋組織免疫組化染色用于BP的輔助診斷，結(jié)果9例BP和（或）獲得性EB患者有7例基底膜帶可見特征性線狀沉積。Pfaltz等［6］用類似方法研究 C3d，結(jié)果顯示，97%（31/32例）的BP患者C3d基底膜線狀沉積。郭坤和耿松梅［7］報(bào)道，有 96%（24/25例）BP患者石蠟包埋組織C3d染色陽(yáng)性。

本研究將C3d、C4d共同應(yīng)用于BP石蠟包埋切片免疫組化研究，選擇3名研究人員獨(dú)立盲判且7 d后重復(fù)判定，兩次均判定為陽(yáng)性的標(biāo)記為陽(yáng)性，3名研究人員判定結(jié)果均一致。本文結(jié)果顯示，已確診的BP患者石蠟包埋切片的C3d、C4d陽(yáng)性在基底膜沉積率均達(dá)95%（19/20例），與上述研究結(jié)果類似。而且C4d的結(jié)果普遍清晰度均優(yōu)于C3d，這與Magro等［4］報(bào)道的結(jié)果一致。本文研究中選擇EB及HH患者和健康人做為陰性對(duì)照。EB是以真皮或基底膜水皰為特征的遺傳性疾病，其水皰位置雖然位于基底層下方，但水皰形成是由于物理原因?qū)е碌恼姹砥し蛛x。本研究選取確診的9例EB患者中均無C3d、C4d皮膚基底膜帶線狀沉積，其中在水皰頂部及底部均有沉積，而水皰周邊基底膜無C3d、C4d沉積的1例；僅在皰頂C3d、C4d沉積的1例，沒有C3d、C4d僅沉積在皰底患者。Chandler等［5］報(bào)道的研究中，分析了皰底沉積現(xiàn)象，該研究基底膜具有線狀C4d沉積的70%患者（7/10例）中，有3例具有皰底沉積僅有1例是做過鹽裂皮膚間接免疫熒光被證實(shí)為獲得性大皰性表皮松解癥患者，作者推測(cè)，C4d沉積可能反應(yīng)了抗體沉積位置，BP位于上方透明板層，而獲得性大皰性表皮松解癥則位于下方的致密板層。在本研究中，EB也可出現(xiàn)皰頂皰底沉積現(xiàn)象，具有水皰改變的17例BP患者石蠟包埋組織切片中，既有皰頂沉積又有皰底沉積，且未發(fā)現(xiàn)規(guī)律性。因此，我們認(rèn)為，皰頂與皰底沉積不具有特異性。水皰周圍的基底膜出現(xiàn)線狀沉積具有診斷價(jià)值，這與Pfaltz等［6］及郭坤和耿松梅［7］的判定方法相一致。

綜上所述，雖然冰凍切片免疫熒光染色診斷BP具有操作步驟簡(jiǎn)單、組織抗原保存良好、特異性強(qiáng)、敏感度高等特點(diǎn)。但冰凍切片保存時(shí)間較短，需要及時(shí)完成免疫熒光染色檢測(cè)，若外院轉(zhuǎn)送新鮮標(biāo)本時(shí)間過長(zhǎng)，高溫可能導(dǎo)致組織自溶，影響結(jié)果判斷；而且冰凍切片機(jī)很大程度上限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。我們研究結(jié)果表明，石蠟包埋組織切片的C3d、C4d染色在水皰周邊組織真表皮連接處的基底膜區(qū)域出現(xiàn)線狀沉積是一種臨床輔助診斷方法，具有較高陽(yáng)性率。

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［3］ Feucht HE,Schneeberger H,Hillebrand G,et al.Capillary deposition of C4d complement fragment and early renal graft loss［J］.Kidney Int,1993,43（6）:1333-1338.

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［5］ Chandler W,Zone J,Florell S.C4d immunohistochemical stain is a sensitive method to confirm immunoreactant deposition in formalin-fixed paraffin-embedded tissue in bullous pemphigoid［J］.J Cutan Pathol,2009,36（6）:655-659.DOI:10.1111/j.1600-0560.2008.01129.x.

［6］ Pfaltz K,Mertz K,Rose C,et al.C3d immunohistochemistry on formalin-fixed tissue is a valuable tool in the diagnosis of bullous pemphigoid of the skin ［J］.J Cutan Pathol,2010,37（6）:654-658.DOI:10.1111/j.1600-0560.2009.01450.x.

［7］郭坤,耿松梅.C3d在大皰性類天皰瘡患者皮損組織中的表達(dá)［J］.中華皮膚科雜志,2012,45（5）:364-365.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2012.05.024.

Diagnostic value of immunohistochemical staining for C3d and C4d in paraffin sections in bullous pemphigoid

Zhang Jiechen,Yang Yonghong,Li Zhiliang,Feng Suying.Department of Dermatology,Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo estimate the value of immunohistochemical staining for C3d and C4d in paraffin-embedded tissue sections for the auxiliary diagnosis of bullous pemphigoid （BP）.MethodsParaffinembedded tissue sections from 20 patients with BP served as the experiment group,and those from lesions of 9 patients with familial benign pemphigus and 4 patients with epidermolysis bullosa as well as from normal skin served as the controls.Immunohistochemical SP method was used to measure the expressions of C3d and C4d in these paraffin sections.ResultsThe deposition of C3d and C4d was observed in the basement membrane at the dermo-epidermal junction in 95% （19/20） of BP tissue sections,but undetected in any of the familial benign pemphigus or epidermolysis bullosa tissue sections.ConclusionImmunohistochemical staining for C3d and C4d in paraffin-embedded tissue sections may serve as an auxiliary method for the diagnosis of BP.

Pemphigoid, bullous; Paraffin embedding; Microtomy; Immunohistochemistry;Complement C3d;Complement C4d

Feng Suying,Email:fengsuying@medmail.com.cn

2015-04-09）

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院協(xié)和青年基金（2012J07）

Fund program:Union Youth Foundation of Peking Union Medical College(2012J07）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.01.001

馮素英，Email:fengsuying@medmail.com.cn