黃志廣 ， 付文亮 ， 景浩然 ， 龍民慧， 甘向東， 徐東剛,*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530021；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100850)

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SAK-HV灌胃給藥對高脂大鼠降脂效果的影響

黃志廣1， 付文亮2， 景浩然2， 龍民慧2， 甘向東2， 徐東剛1,2*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530021；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100850)

研究重組蛋白SAK-HV口服給藥對高脂模型大鼠血脂水平及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，并對其降低膽固醇機制進行初步探討.高脂飼料喂養(yǎng)雄性Wistar大鼠10周建立高脂模型，將成模大鼠按體質(zhì)量隨機分為：模型組、溶劑對照(碳酸氫鈉)組、給藥(SAK-HV)組及陽性對照(他汀)組.口服給藥6周，分別檢測血清中甘油三酯和總膽固醇含量、肝臟脂肪沉積情況、小腸Npc1l1及肝臟Abcg5/Abcg8的mRNA及蛋白表達水平、主動脈ROS含量、血清SOD活性及MDA含量.檢測結(jié)果顯示，與模型組大鼠相比，SAK-HV組大鼠血清總膽固醇和甘油三酯顯著降低；肝臟脂肪沉積減少，小腸中NPC1L1的表達顯著低下降，同時肝臟ABCG5/ABCG8的表達顯著升高；大鼠主動脈ROS含量顯著降低，血清SOD活性顯著升高，而血清MDA含量顯著降低.結(jié)果表明SAK-HV口服給藥可通過抑制小腸對膽固醇的吸收，增強肝臟對膽固醇的外排作用降低血脂，同時它可降低機體氧化應(yīng)激水平，因此有望成為治療高脂血癥的候補藥物.

SAK-HV； 高脂血癥； 口服給藥； 膽固醇轉(zhuǎn)運； 氧化應(yīng)激

隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣的改變，高脂血癥發(fā)病率逐年升高.高脂血癥，又稱血脂異常，是指血液中脂質(zhì)含量過高，能導(dǎo)致心腦血管疾病，如動脈粥樣硬化、冠心病和腦梗等[1].另外，它還能引起機體氧化應(yīng)激水平升高，而氧化應(yīng)激水平過高能促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[2].據(jù)保守估計，我國高脂血癥患病人數(shù)已超1.6億.因此，研發(fā)降脂新藥具有十分重要的意義.

SAK-HV是我室前期研制的具有抗動脈粥樣硬化作用的融合蛋白，它是以葡激酶(SAK)突變體為骨架，整合精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列和水蛭素C端12肽，具有溶栓、抗血小板聚集和抗凝酶作用[3-4].動物實驗發(fā)現(xiàn)，SAK-HV尾靜脈注射給藥能顯著降低ApoE-/-小鼠血清TG、TC水平，影響小腸膽固醇轉(zhuǎn)運相關(guān)基因尼曼-匹克C1型類似蛋白1(Niemann-Pick C1 Like 1,Npc1l1)及ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G5/G8(ATP-binding cassette(ABC) transporters G5/G8,Abcg5/Abcg8)的表達，顯示該藥物降低血清膽固醇可能與小腸對膽固醇的吸收和轉(zhuǎn)運有關(guān)[5].另外，口服給藥是一種方便、經(jīng)濟和依從性好的用藥方式，加上肝臟是膽固醇代謝的主要器官，因此，研究口服SAK-HV是否能有效降低血脂，能否影響膽固醇在肝臟中的代謝具有重要的臨床應(yīng)用價值.本實驗利用大鼠高脂模型，采用灌胃給藥方式，通過檢測血脂水平、肝臟脂肪沉積情況、小腸及肝臟組織膽固醇轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的表達水平、氧化應(yīng)激指標(biāo)，評價SAK-HV口服給藥的降脂效果，探討其降膽固醇機制，為該藥物的后續(xù)研發(fā)奠定基礎(chǔ).

1　 研究方法

1.1材料和試劑

Wistar大鼠及高脂飼料購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心(實驗動物質(zhì)量合格證許可證號：SCXK-(軍)2012-0004).高脂飼料配方(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：膽固醇2%，豬油10%，糖5%及基礎(chǔ)飼料83%.SAK-HV由本室研制.阿托伐他汀鈣片購自輝瑞制藥有限公司(商品名為立普妥).油紅購自Sigma公司.NPC1L1、ABCG5抗體購自Santa公司，ABCG8抗體購自Novus Biologicals公司.RNA提取試劑盒(貨號：71201-50)購自北京天恩澤基因科技有限公司.反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：K1622)、Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)(貨號：K0222)購自Thermo scientific公司.引物用Primer 3.0軟件設(shè)計，由生物工程(上海)股份有限公司合成(表1).甘油三酯(TG)測定試劑盒(貨號：A110-1)、總膽固醇(TC)測定試劑盒(貨號：A111-1)、活性氧(ROS)檢測盒(貨號：E004)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(貨號：A001-1)及丙二醛(MDA)測試盒(貨號：A003-1)購自南京建成生物工程研究所. 食用碳酸氫鈉、生理鹽水等.

表1　引物序列表

1.2實驗方法

(2) 對照組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，高脂組換成高脂飼料，大鼠自由進食和飲水.高脂組大鼠喂養(yǎng)10周后，其血清中甘油三脂(Triglyceride, TG)和總膽固醇(Total Cholesterol, TC)含量均高于對照組，差異極顯著(P<0.01)(圖1A)，據(jù)此判定造模成功.

(3)將造模成功的24只大鼠按體質(zhì)量隨機分成模型組、碳酸氫鈉組、SAK-HV組及他汀組4組，每組各6只.各組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，自由進食和飲水.結(jié)果顯示各組大鼠攝食量呈緩慢下降趨勢，組間差異不顯著(數(shù)據(jù)未給出).

(4)第11周開始連續(xù)給藥，每天1次.模型組：灌生理鹽水，3 mL/只;碳酸氫鈉組：灌0.1 mol/L的碳酸氫鈉溶液(生理鹽水配制)，pH 8.0，3 mL/只；SAK-HV組：先灌0.1 mol/L的碳酸氫鈉溶液，pH 8.0，2 mL/只，再灌SAK-HV溶液(碳酸氫鈉溶液配制)，劑量為15 mg/kg，1 mL/只；他汀組：灌阿托伐他汀溶液(生理鹽水配制)，劑量為20 mg/kg，3 mL/只.

(5) 給藥6周后停止給藥，禁食12 h，對大鼠實施麻醉，心臟取血并處死.血液樣品4 000 r/min離心10 min，取上層血清，分裝，-70 ℃保存.分離大鼠主動脈，生理鹽水漂洗，除去殘留血塊，-70 ℃保存.取大鼠胃部以下3～12 cm處的小腸組織，剪成小段，一部分-70 ℃保存，另一部分用福爾馬林保存；取肝臟大葉中部，剪成小塊，一部分-70 ℃保存，另一部分用福爾馬林保存.實驗過程保障實驗動物福利，并嚴(yán)格遵守實驗動物倫理準(zhǔn)則.

1.3測試方法

1.3.1檢測血清中TG、TC含量實驗過程嚴(yán)格按照測試盒附帶說明書的步驟進行.

1.3.2qPCR檢測相關(guān)基因相對表達提取小腸及肝臟組織的mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行qPCR反應(yīng)，檢測小腸中Npc1l1及肝臟中Abcg5/Abcg8的相對表達量.

1.3.3肝臟組織油紅O染色實驗將福爾馬林固定的組織脫水沉底，再進行速凍包埋、切片.冰凍切片復(fù)溫干燥10 min，4%多聚甲醛固定15 min.油紅工作液孵育10～15 min，破膜10～15 min，再用油紅工作液37 ℃染色1 h.75%酒精分化2 s，水洗1 min.Harris蘇木素復(fù)染2 min，水洗1 min；1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，水洗1 min，氨水反藍，水洗.吸去多余水分，甘油明膠封片.顯微鏡鏡檢并采集圖像.

各模塊以Arduino Uno主控板為核心，Arduino采用開放源代碼的軟硬件平臺，具有類似Java、C語言的Processing/Wiring開發(fā)環(huán)境.模塊通過Arduino主控板編寫程序，通過Arduino Xbee擴展板連接Xbee pro S1無線模塊進行無線數(shù)據(jù)交互.

1.3.4石蠟切片免疫組化實驗福爾馬林固定的組織先水洗、脫水包埋，再進行切片.石蠟切片脫蠟至水，浸入檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)中進行抗原修復(fù)，放入3%過氧化氫溶液(雙氧水：純水=1∶9)室溫避光孵育25 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，BSA室溫封閉30 min.加入PBS配好的一抗，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜.加入與一抗相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育50 min.加入新配制的DAB顯色液顯色，流水沖洗終止.Harris蘇木素復(fù)染3 min，水洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，水洗1 min，氨水反藍，水洗.最后脫水封片，顯微鏡鏡檢并采集圖像.

1.3.5大鼠主動脈ROS含量檢測研磨大鼠主動脈，離心，取上層蛋白液，檢測ROS含量，實驗過程嚴(yán)格按照測試盒附帶說明書的步驟進行.

1.3.6血清SOD活性及MDA含量檢測實驗過程嚴(yán)格按照測試盒附帶說明書的步驟進行.

1.4數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1各組間血脂結(jié)果比較

用酶法檢測大鼠血清中TG和TC含量，結(jié)果(圖1B)表明，SAK-HV組大鼠血清TG、TC含量分別低于模型組、碳酸氫鈉組和他汀組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；他汀組TG、TC含量低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

圖1　各處理組大鼠血清中TG和TC含量

注：*P<0.05表示差異顯著；**P<0.01表示差異極顯著，下圖同.

2.2大鼠小腸組織中Npc1l1的mRNA及蛋白質(zhì)水平比較

采用實時定量PCR技術(shù)檢測各組小腸中Npc1l1的mRNA表達水平.結(jié)果(圖2A)顯示，SAK-HV組小腸中Npc1l1的mRNA表達量分別低于模型組和他汀組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.采用石蠟切片免疫組化技術(shù)檢測小腸中NPC1L1蛋白表達，圖片中棕黃色為陽性表達(圖2B).采用Image-pro plus圖像處理軟件統(tǒng)計陽性表達面積比.結(jié)果(圖2C)顯示，在小腸上皮絨毛部位，SAK-HV組棕黃色面積顯著低于模型組和他汀組，表明SAK-HV組NPC1L1蛋白表達量顯著低于模型組和他汀組，與qPCR結(jié)果相一致.

2.3大鼠肝組織中脂肪沉積比較

油紅O染色將肝細(xì)胞中的脂滴染成紅色，能直觀反映肝臟脂肪沉積情況.染色結(jié)果顯示各組肝組織細(xì)胞輪廓清晰，紅色部分為脂滴，藍色部分為細(xì)胞核.模型組肝組織細(xì)胞體積增大，胞漿中可見大量鮮紅色脂滴，幾乎占據(jù)整個肝細(xì)胞(圖3A).與模型組比較，SAK-HV組的肝細(xì)胞體積變小，胞漿中脂滴顏色呈淺紅色(圖3C)，說明SAK-HV組肝臟脂肪沉積少于模型組.與他汀組比較，SAK-HV組細(xì)胞胞漿中脂滴顏色略淺，說明SAK-HV組肝臟脂肪沉積少于他汀組(圖3D).與模型組比較，碳酸氫鈉組肝細(xì)胞胞漿脂滴油紅著色無明顯變化(圖3B).

圖2　各組大鼠小腸中Npc1l1的mRNA及蛋白表達水平

圖3　大鼠肝臟紅油O染色結(jié)果

2.4大鼠肝臟組織中Abcg5/Abcg8 mRNA及蛋白水平比較

qPCR結(jié)果(圖4A)顯示，SAK-HV組肝臟組織中Abcg5/Abcg8的mRNA表達水平分別高于模型組、碳酸氫鈉組和他汀組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.肝臟免疫組化結(jié)果(圖4B)顯示，SAK-HV組ABCG5棕黃色面積比顯著高于模型組、碳酸氫鈉組和他汀組；SAK-HV組ABCG8棕黃色面積比顯著高于模型組、碳酸氫鈉組和他汀組(圖4C)，表明SAK-HV組ABCG5、ABCG8蛋白表達量都顯著高于模型組、碳酸氫鈉組和他汀組，與qPCR的結(jié)果基本一致.

圖4　各組大鼠肝臟中Abcg5/Abcg8的mRNA及蛋白質(zhì)表達水平

2.5大鼠主動脈中活性氧(ROS)水平比較

采用化學(xué)熒光法檢測大鼠主動脈中ROS含量.結(jié)果(圖5)顯示，SAK-HV組ROS含量分別低于模型組、碳酸氫鈉組和他汀組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；碳酸氫鈉組ROS含量低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

圖5　各組大鼠主動脈中ROS含量

2.6大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性比較

采用羥胺法檢測血清中SOD活性.結(jié)果(圖6)顯示，SAK-HV組血清中SOD活性分別高于模型組和碳酸氫鈉組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，碳酸氫鈉組和他汀組SOD活性顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

圖6　各組大鼠血清中SOD活性變化

2.7大鼠血清中丙二醛(MDA)含量比較

采用TBA法檢測各組血清中MDA含量.結(jié)果(圖7)顯示，SAK-HV組、碳酸氫鈉組和他汀組MDA含量都低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

圖7　各組大鼠血清中MDA含量變化

3　討論

阿托伐他汀是目前治療高脂血癥最常用的他汀類藥物，因此，本實驗選用阿托伐他汀作為陽性對照藥物，評價SAK-HV的降脂效果.實驗結(jié)果表明，SAK-HV組TG、TC指標(biāo)均低于他汀組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明SAK-HV的降脂效果優(yōu)于阿托伐他汀.

血液膽固醇含量偏高是高脂血癥的癥狀之一.體內(nèi)膽固醇代謝主要包括合成、吸收、轉(zhuǎn)運、消耗及外排等生理生化過程.本課題組已有的研究結(jié)果[5-6]提示，SAK-HV降低血清總膽固醇，可能與膽固醇的吸收和轉(zhuǎn)運有關(guān)，小腸是膽固醇吸收的主要器官.2004年，ALTMANN等[7]發(fā)現(xiàn)，在小腸上皮細(xì)胞中高表達的NPC1L1在膽固醇吸收過程中起重要作用.DAVIES等[8]報道，與正常小鼠相比，Npc1l1-/-小鼠小腸對膽固醇吸收降低70%.哺乳動物主要以分泌膽汁的方式排除體內(nèi)的膽固醇，而膽汁膽固醇的分泌依賴于ABCG5和ABCG8蛋白.Abcg5、Abcg8是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G亞家族(ATP-binding cassette transporters subfamily G)成員，此二者是ABC半轉(zhuǎn)運蛋白，需相互結(jié)合形成異二聚體后才能發(fā)揮作用[9-10].YU等[11]報道，在肝臟中，ABCG5/ABCG8的作用是將肝臟中未酯化的膽固醇經(jīng)肝膽管外排至小腸.本實驗通過實時定量PCR技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測小腸Npc1l1及肝臟Abcg5/Abcg8的mRNA及蛋白質(zhì)水平.結(jié)果顯示，SAK-HV能顯著降低Npc1l1的表達，提高ABCG5/ABCG8的表達.由此可見，SAK-HV一方面抑制小腸對食物中游離膽固醇的吸收；另一方面增強肝臟對膽固醇的外排作用，從而起到降低血清總膽固醇的作用.

大量文獻[12-14]報道高脂飲食能引起血脂水平及機體氧化應(yīng)激水平升高，而高脂血癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的重要危險因素之一.高脂血癥能引起組織線粒體ROS增加，降低NADPH/NADP+比值.而線粒體ROS過多與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).它能誘導(dǎo)內(nèi)皮功能紊亂、炎性細(xì)胞激活及內(nèi)皮和血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[15-16].SOD是機體抗氧化系統(tǒng)中不可或缺又普遍存在的酶類，其活性高低能反映機體抗氧化能力[17].MDA是多不飽和脂肪酸過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量高低可衡量機體氧化應(yīng)激水平[18].本實驗結(jié)果顯示，SAK-HV能降低主動脈ROS含量，提高血清SOD活性，降低血清MDA水平，表明SAK-HV能降低機體氧化應(yīng)激水平，提高機體抗氧化能力，提示該藥物對動脈粥樣硬化等疾病具有積極的治療作用.

此外，本課題組之前的研究是以ApoE-/-小鼠為實驗對象并采取尾靜脈注射方式對藥效進行評價[5].該實驗存在以下2個問題：一是ApoE-/-小鼠為基因敲除鼠，缺失膽固醇運輸?shù)妮d脂蛋白，該模型不能很好地模擬正常情況下飲食誘導(dǎo)形成的高脂血癥；二是注射給藥在實際應(yīng)用上有一定局限，不利于藥物的廣泛使用.本實驗通過高脂飼料喂養(yǎng)，建立大鼠高脂血癥模型，較好地模擬正常情況下飲食誘導(dǎo)形成的高脂血癥，同時還證實口服給藥的方式亦能起到很好的降脂效果和降低機體氧化應(yīng)激水平的作用.

口服給藥雖能克服注射用藥的不足，但SAK-HV作為一種重組蛋白，直接口服給藥，胃酸極易使之變性失活.預(yù)實驗結(jié)果表明，SAK-HV直接灌胃給藥對高脂大鼠血脂水平無顯著影響，證實了該推測.因此，本實驗借鑒治療胃酸過多的方法[19]，先灌碳酸氫鈉溶液，快速中和胃酸，再灌SAK-HV.實驗結(jié)果顯示，SAK-HV組血脂及機體氧化應(yīng)激水平均顯著低于碳酸氫鈉組，說明利用這種給藥方式SAK-HV能明顯降低血脂和機體的氧化應(yīng)激水平，這些研究為該藥物后續(xù)口服劑型的開發(fā)奠定了基礎(chǔ).同時本研究顯示，碳酸氫鈉也能降低血清TG含量、降低機體氧化應(yīng)激水平，其機制尚不明確，可能通過影響小腸對脂類的吸收，進而對血脂及機體氧化應(yīng)激水平產(chǎn)生影響.

綜上所述，SAK-HV口服給藥能通過影響膽固醇轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的表達，顯著降低高脂飼料喂養(yǎng)引起的血脂升高及機體氧化應(yīng)激水平升高，有望成為新型降脂藥物.

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【中文責(zé)編：成文英文責(zé)編：李海航】

Effect of SAK-HV on Reducing Lipid in Hyperlipidemic Rats by Gavage

HUANG Zhiguang1, FU Wenliang2, JING Haoran2, LONG Minhui2, GAN Xiangdong2, XU Donggang1,2*

(1.Guangxi Medical University, Nanning 530021, China; 2.Institute of Basic Medical Sciences, the Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)

This article is to assess the influence of SAK-HV given by gavage on blood lipid and oxidative stress in hyperlipidemia model rats and to investigate the possible mechanism of lowering cholesterol. Male Wistar rats were fed by high-fat diet for 10 weeks to build hyperlipidemia model rats. Then the model rats were randomly assigned to model group, NaHCO3group, treatment (SAK-HV) group and positire control (atorvastatin) group by body weight and administrated with drugs perorally. 6 weeks later, all rats were anesthetized. Serum, aortas, intestines and livers were separated and analyzed. Data showed that compared to model group, the level of triglyceride and total cholesterol in serum of SAK-HV group were significantly reduced; fat deposition in liver was improved; the expression of NPC1L1 in intestine was inhibited and the expression of ABCG5/ABCG8 in liver was enhanced; the content of ROS in aorta was significantly reduced; the activity of SOD in serum was significantly improved; the content of MDA in serum was significantly decreased. These results demonstrated that SAK-HV could reduce the content of blood lipid, the level of body oxidative stress and the total cholesterol via inhibiting cholesterol intake in intestine and enhancing the excretion of cholesterol in liver. SAK-HV may be a promising candidate drug against hyperlipemia.

SAK-HV; hyperlipidemia model; oral medication; cholesterol transport; oxidative stress

2015-09-20《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家科技重大專項新藥創(chuàng)制項目(2012ZX09102301-017) ;“十二五”國家重大新藥創(chuàng)制生物技術(shù)大平臺項目(2012ZX09301003-001-005-026)

徐東剛，研究員，Email: xudg@bmi.ac.cn.

R963；R966

A

1000-5463(2016)03-0115-07