李延雷， 陳煒東， 滕素巖， 高書成

(1.黑龍江省東寧縣暖泉子林場，黑龍江牡丹江 157200；2.黑龍江省東寧縣林業(yè)局，黑龍江牡丹江 157200)

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元蘑液體菌種的優(yōu)化培養(yǎng)

李延雷1， 陳煒東2， 滕素巖2， 高書成1

(1.黑龍江省東寧縣暖泉子林場，黑龍江牡丹江 157200；2.黑龍江省東寧縣林業(yè)局，黑龍江牡丹江 157200)

[目的] 篩選元蘑液體菌種培養(yǎng)基配方，優(yōu)化液體菌種培養(yǎng)工藝。[方法] 通過設(shè)置不同的液體培養(yǎng)基配方、不同的接種條件(包括不同菌齡、不同接種量)和不同的培養(yǎng)條件(包括不同轉(zhuǎn)速、不同培養(yǎng)時間)，以菌絲體生物量、菌絲球密度及菌絲球形態(tài)為指標(biāo)進(jìn)行元蘑液體菌種的篩選。[結(jié)果] 液體培養(yǎng)元蘑菌種的最佳培養(yǎng)基配方為：200 g馬鈴薯、150 g稻草粉、10 g玉米粉、20 g葡萄糖、3 g蛋白胨、2 g酵母膏、維生素B11片；最佳接種菌齡為5 d；最佳接種量為9%；最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為160 r/min；最佳培養(yǎng)時間為7 d。[結(jié)論] 元蘑液體菌種經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)，菌絲體生物量、菌絲球密度及菌絲球形態(tài)都有很大提高。

元蘑；液體菌種；優(yōu)化培養(yǎng)

Optimized Culture of Liquid Strains ofHohenbueheliaserotina

元蘑[Hohenbueheliaserotina(Perts: Fr.)Sing.]隸屬真菌界真菌門擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目側(cè)耳科亞側(cè)耳屬[1]，又稱亞側(cè)耳、黃蘑、凍蘑，分布于吉林、黑龍江、河北、山西、廣西、陜西、四川、云南、西藏等地區(qū)，以東北林區(qū)最多。元蘑具有極高的營養(yǎng)價值，其質(zhì)地柔嫩、味道鮮美、食味獨特，含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦質(zhì)元素等多種營養(yǎng)成分[2-3]，被譽(yù)為“山珍”“健康食品”“長壽食品”等，在古代《奉天通志》中就曾有記載，在民間有很長的食用歷史。元蘑不僅具有很高的營養(yǎng)價值，而且是一種地方性草藥，具有疏風(fēng)活絡(luò)、強(qiáng)筋壯骨的功效[4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，元蘑性甘、溫、能祛風(fēng)活絡(luò)、清熱燥濕，適用于癲癇、肝硬化腹水、風(fēng)濕痛、肌肉痛和目赤腫痛等癥狀[4]。

目前，在元蘑的人工栽培過程中普遍采用試管母種制作原種、再擴(kuò)大制作栽培種的固體菌種接種培育法，這種方法生產(chǎn)效率低，菌絲滿袋周期長且菌齡不一致。液體發(fā)酵生產(chǎn)液體菌種則可以克服上述缺點，是一種適合規(guī)?；?、工廠化的菌種制備技術(shù)。筆者對元蘑液體菌種制備過程中培養(yǎng)基配方進(jìn)行了篩選，對其生產(chǎn)工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期為元蘑的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1供試菌株供試菌株保存于東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)科實驗室。

1.2試驗方法

1.2.1培養(yǎng)基的制備。試驗使用的分離培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其制作方法如下：將馬鈴薯洗凈去皮，用電子天平稱取200 g，切成1 cm×1 cm×1 cm的小塊，用紗布包好后放入1 000 mL水中煮沸，待馬鈴薯塊軟化后撈出。加入葡萄糖20 g和瓊脂15 g，再次煮沸，加水補(bǔ)足1 000 mL，再用雙層紗布過濾，pH自然，倒入錐形瓶內(nèi)，將瓶口用封口膜封好后，用高壓滅菌鍋高壓濕熱滅菌，121 ℃下滅菌20 min。滅菌結(jié)束后，待培養(yǎng)基溫度降低至不燙手但未凝固時，在超凈工作臺內(nèi)，將經(jīng)過滅菌的PDA培養(yǎng)基定量倒入直徑8 cm的培養(yǎng)皿中，裝液量為20 mL，凝固后備用。

1.2.2液體培養(yǎng)基的制備。試驗共采用5種液體培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基制作方法如下：①對照組(液體培養(yǎng)基CK)。馬鈴薯處理方法同PDA，加入20 g葡萄糖，再次煮沸，加水補(bǔ)足1 000 mL，再用雙層紗布過濾，pH自然，倒入500 mL錐形瓶內(nèi)，每個錐形瓶分裝300 mL液體培養(yǎng)基，封口膜封口后，放入高壓滅菌鍋內(nèi)，121 ℃下滅菌30 min以備用。②試驗組 Ⅰ。馬鈴薯處理方法同PDA，與150 g稻草放入1 000 mL水中煮沸，約20 min后撈出，加入10 g玉米粉，煮約10 min，然后用雙層紗布過濾，再加入20 g葡萄糖、3 g蛋白胨、2 g酵母膏和維生素B11片，待融化后進(jìn)行分裝和滅菌，分裝與滅菌方法同對照組。③試驗組 Ⅱ。馬鈴薯處理方法同PDA，與15 g麥麩放入1 000 mL水中煮沸，約20 min后撈出，用雙層紗布過濾，再加入20 g葡萄糖、1 g磷酸二氫鉀、500 mg硫酸鎂，待融化后進(jìn)行分裝和滅菌，分裝與滅菌方法同對照組。④試驗組Ⅲ。稱取10 g玉米粉和10 g豆餅粉加入1 000 mL水中煮沸，約10 min后撈出，4層紗布過濾，過濾后加入20 g蔗糖和2 g酵母膏繼續(xù)煮，待融化后進(jìn)行分裝和滅菌，分裝與滅菌方法同對照組。

1.2.3不同液體培養(yǎng)基配方對菌絲生長的影響。將PDA斜面培養(yǎng)基保存的元蘑菌種，接種于新的PDA平板培養(yǎng)基中心，待菌絲長滿整個平板培養(yǎng)基后，用內(nèi)徑5 mm已滅菌的打孔器在距平板中心接種點4 cm處打孔，將菌齡一致的菌塊轉(zhuǎn)接到各組液體培養(yǎng)基中，每瓶液體培養(yǎng)基接入菌塊10塊，每個配方設(shè)置5個重復(fù)。將接入菌塊的液體培養(yǎng)基錐形瓶放入恒溫振蕩器內(nèi)，在25 ℃、130 r/min的條件下培養(yǎng)7 d，觀察菌絲球形態(tài)，并檢測菌絲球密度和生物量。

1.2.4元蘑液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

1.2.4.1種子培養(yǎng)。以篩選得到的最佳液體培養(yǎng)基，進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)。接種方法同“1.2.3”，接種后置于25 ℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)1 d，然后放入25 ℃的恒溫振蕩器中以130 r/min的轉(zhuǎn)速恒溫培養(yǎng)一定天數(shù)，備用。

1.2.4.2接種菌齡對菌絲生長的影響。以10%的接種量，分別向裝有300 mL最佳液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中接入菌齡為3、5、7、9、11 d的種子，在25 ℃的恒溫振蕩器中以130 r/min轉(zhuǎn)速避光培養(yǎng)，每個處理4次重復(fù)。培養(yǎng)5 d后，檢測菌絲體生物量。

1.2.4.3接種量對菌絲生長的影響。采用最適接種菌齡的種子，分別按3%、6%、9%、12%、15%的接種量，接種于裝有300 mL培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，在25 ℃的恒溫振蕩器中以130 r/min的轉(zhuǎn)速避光培養(yǎng)，每個處理4次重復(fù)。培養(yǎng)5 d后，檢測菌絲體生物量。

1.2.4.4搖床轉(zhuǎn)速對菌絲生長的影響。采用最適菌齡和最適接種量，接種于裝有300 mL培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，放入恒溫振蕩器中，分別以120、140、160、180、200 r/min的轉(zhuǎn)速于25 ℃恒溫下培養(yǎng)，每個處理4次重復(fù)。培養(yǎng)5 d后，檢測菌絲體生物量。

1.2.4.5培養(yǎng)時間對菌絲生長的影響。采用最適菌齡和最適接種量，接種于裝有300 mL培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，放入恒溫振蕩器中，在最佳轉(zhuǎn)速下25 ℃恒溫培養(yǎng)，每個處理4次重復(fù)。分別在培養(yǎng)3、5、7、9、11 d后，收集菌絲體，檢測菌絲體生物量。

1.2.5各項菌種質(zhì)量指標(biāo)的檢測。

1.2.5.1菌絲球密度的測定。將培養(yǎng)的液體菌種搖勻后，用移液器吸取1 mL的菌液，加入到9 mL的無菌水中稀釋10倍，測定菌絲球個數(shù)。

1.2.5.2生物量的測定。取50 mL液體菌種，2 000 r/min離心20 min，去上清，菌絲體沉淀經(jīng)蒸餾水充分洗滌后，用濾紙過濾，待濾液無色透明后收集菌絲體，80 ℃下真空干燥至恒重，使用電子天平準(zhǔn)確稱重。按照以下公式計算菌絲體生物量：

2　結(jié)果與分析

2.1不同液體培養(yǎng)基配方對菌絲生長的影響由表1可知，對照組和3個試驗組液體培養(yǎng)基的菌絲生長情況表現(xiàn)出較大差異。試驗組 Ⅰ 的菌絲生長情況最佳，菌絲體生物量和菌絲球密度分別達(dá)到5.3 g/L和159個/mL，試驗組 Ⅲ 次之，試驗組 Ⅱ 較差，對照組的菌絲生長情況最差。試驗組培養(yǎng)基的營養(yǎng)比對照組更加豐富，因此試驗組菌絲的生長情況好于對照組。從菌絲球性狀來看，3個試驗組之間沒有明顯差異，菌絲球均為米黃色，大小均勻且稠密，而對照組菌絲球較為稀疏。從菌絲萌發(fā)時間來看，試驗組 Ⅰ 和Ⅲ只需1 d，試驗組 Ⅱ 需要2 d，而對照組則需要3 d才能萌發(fā)，這大大延緩了菌絲體生長對數(shù)期的到來。由此可見，試驗組 Ⅰ 液體培養(yǎng)基配方更適合用于液體培養(yǎng)元蘑菌絲體。

表1　液體培養(yǎng)基配方對菌絲生長的影響

2.2不同接種菌齡對菌絲生長的影響不同菌齡的菌絲體所處的生長期不同，其活力也存在較大差異，因此選擇不同菌齡的菌種對菌絲體后期的生長影響較大。由表2可知，接種菌齡在3～11 d，隨菌齡的增加，菌絲體生物量和菌絲球密度先增加后減少。當(dāng)菌齡為3 d時，菌絲體生物量和菌絲球密度為5.1 g/L和157個/mL；當(dāng)菌齡為5 d時，菌絲體生物量和菌絲球密度達(dá)到最大，分別為6.9 g/L和214個/mL，此后隨菌齡增加，菌絲體生物量和菌絲球密度逐漸減?。划?dāng)菌齡為11 d時，菌絲體生物量和菌絲球密度減小至5.9 g/L和181個/mL，但仍然高于菌齡為3 d時。從菌絲球性狀來看，菌齡為3 d時，菌絲球為米黃色，大小均一但比較稀疏，而菌齡達(dá)到11 d時，菌絲球為米黃色，雖然較稠密，但大小不均一，只有菌齡在5～9 d時，菌絲球性狀較好。因此，選擇菌齡為5 d時的液體菌種，菌絲體的生長情況最佳。

2.3不同接種量對菌絲生長的影響接種量對液體培養(yǎng)菌絲體的生長情況影響較為顯著。由表3可知，在相同培養(yǎng)時間的條件下，接種量越大，菌絲體的生物量和菌絲球密度也越大。當(dāng)接種量為12%時，菌絲體生物量和菌絲球密度均達(dá)到最大值，分別為6.9 g/L和219個/mL。當(dāng)接種量為9%時，菌絲體生物量和菌絲球密度與接種量12%差異不顯著，分別為6.8 g/L和212個/mL；當(dāng)接種量為3%時，菌絲體的生物量和菌絲球密度最小，分別為4.7 g/L和139個/mL。從菌絲球性狀來看，當(dāng)接種量在6%以上時，菌絲球均表現(xiàn)為米黃色，大小均一，稠密；當(dāng)接種量為3%時，菌絲球較為稀疏。因此，從節(jié)約菌種的角度來看，接種量為9%最為合適。

表2接種菌齡對菌絲生長的影響

Table 2Effects of age of inoculation strains on the growth of the mycelia

接種菌齡Ageofinoculationstrainsd菌絲體生物量Myceliunbiomassg/L菌絲球密度Densityofmyceliumpellets個/mL菌絲球性狀Shapeofmyceliumpellets35.1157米黃色,大小較均一,較稀疏56.9214米黃色,大小均一,稠密76.8209米黃色,大小均一,稠密96.3192米黃色,大小較均一,稠密115.9181米黃色,大小不均一,稠密

表3不同接種量對菌絲生長的影響

Table 3Effects of amount of inoculation on the growth of the mycelia

接種量Amountofinoculation%菌絲體生物量Myceliunbiomassg/L菌絲球密度Densityofmyceliumpellets個/mL菌絲球性狀Shapeofmyceliumpellets34.7139米黃色,大小較均一,較稀疏65.5168米黃色,大小均一,較稠密96.8212米黃色,大小均一,稠密126.9219米黃色,大小均一,稠密156.9217米黃色,大小均一,稠密

2.4不同搖床轉(zhuǎn)速對菌絲生長的影響液體培養(yǎng)時不同轉(zhuǎn)速對菌絲生長也有一定程度的影響。由表4可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為120～160 r/min時，隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌絲體生物量和菌絲球密度也在逐漸增加。當(dāng)轉(zhuǎn)速為160 r/min時，菌絲體生物量和菌絲球密度達(dá)到最大值，分別為7.1 g/L和223個/mL；當(dāng)轉(zhuǎn)速為120 r/min時，菌絲體生物量和菌絲球密度最小，分別為6.1 g/L和182個/mL；當(dāng)轉(zhuǎn)速為180和200 r/min時，菌絲體生物量分別為6.8和6.9 g/L，菌絲球密度分別為211和214個/mL，與轉(zhuǎn)速160 r/min相比略有下降。從菌絲球性狀來看，各轉(zhuǎn)速之間的差異不大，都表現(xiàn)為菌絲球米黃色，大小均一且稠密。因此，液體培養(yǎng)時，160 r/min為最佳的培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

2.5不同培養(yǎng)時間對菌絲生長的影響液體培養(yǎng)時不同培養(yǎng)時間對菌絲生長有極顯著的影響。由表5可知，液體培養(yǎng)至11 d時，菌絲體生物量和菌絲球密度都達(dá)到最大值，分別為7.3 g/L和241個/mL；液體培養(yǎng)3～7 d時，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲體生物量和菌絲球密度也逐漸增加。液體培養(yǎng)3 d時，菌絲體生物量和菌絲球密度都最小，分別為5.2 g/L和157個/mL；液體培養(yǎng)7 d時，菌絲體生物量和菌絲球密度與培養(yǎng)9 d時無顯著差異，菌絲體生物量為7.2 g/L，菌絲球密度為237個/mL。在菌絲球性狀方面，液體培養(yǎng)5 d后，菌絲球顏色為米黃色，大小均一且稠密，培養(yǎng)時間不足5 d時，菌絲球則相對稀疏。因此，從生產(chǎn)周期來看，液體培養(yǎng)時間為7 d時，效果最佳。

表4　不同轉(zhuǎn)速對菌絲生長的影響

表5　不同培養(yǎng)時間對菌絲生長的影響

3　結(jié)論與討論

元蘑質(zhì)地柔嫩、味道鮮美，不僅具有很高的營養(yǎng)價值，而且具有一定的藥用功效。液體培養(yǎng)生產(chǎn)液體菌種是一種適合規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)食用菌的菌種制備技術(shù)，具有接種效率高、菌種萌發(fā)快、菌絲生長快等優(yōu)點。然而，關(guān)于元蘑液體菌種培養(yǎng)的研究卻鮮有報道。辛樹權(quán)等[5]研究發(fā)現(xiàn)以元蘑菌絲體生物量為指標(biāo)時，最佳氮源為馬鈴薯，最佳碳源為葡萄糖，最佳無機(jī)鹽為磷酸二氫鉀，最佳pH為6.0。筆者對元蘑液體菌種制備過程中培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)元蘑菌種的最佳培養(yǎng)基配方為試驗組Ⅰ，最佳接種菌齡為5 d，最佳接種量為9%，最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為160 r/min，最佳培養(yǎng)時間為7 d。該研究結(jié)果可為元蘑的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供科學(xué)指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

[1] 曹德賓,劉英,王艷芹.元蘑[J].農(nóng)業(yè)知識,2007(5): 12-15.

[2] 曹瑞敏,王志才,陳海燕,等.長白山野生亞側(cè)耳中部化學(xué)成分及微量元素分析[J].中國中藥雜志,1995(4): 233-234.

[3] 姚永志,左錦靜,王壘.元蘑游離必需氨基酸的測定[J].食品研究與開發(fā),2009(9): 146-148.

[4] 李茹光,王策篇,楊成錄,等.東北食用藥用及有毒蘑菇[M].長春: 東北師范大學(xué)出版社,1992: 62-66.

[5] 辛樹權(quán),趙驥,沈永.不同培養(yǎng)條件對元蘑菌絲生長的影響[J].北方園藝,2013(10): 140-142.

LI Yan-lei1,CHEN Wei-dong2,TENG Su-yan2et al

(1.Dongning Nuanquanzi Forest Farm,Mudanjiang,Heilongjiang 157200; 2.Dongning Forestry Bureau,Mudanjiang,Heilongjiang 157200)

[Objective] To screen the medium formula of liquid strains ofHohenbueheliaserotinato optimize the culture process of liquid strains.[Method] By setting different liquid medium formulas,inoculation conditions (including strain age and amount of inoculum) and culture conditions (including rotation speed and culture time),culture conditions of liquid strains ofH.serotinawere optimized by myceliun biomass,density and shape of mycelium pellets.[Result] The optimal formula of the liquid medium ofH.serotinastrains are shown as follows: potato 200 g,straw powder 150 g,corn flour 10 g,glucose 20 g,peptone 3 g,yeast extract 2 g,and a piece of vitamin B1; the optimal age of strains was 5 d; the optimal amount of inoculum was 9%; the optimal rotation speed was 160 r/min; the optimal culture time was 7 d.[Conclusion] By optimized culture,the myceliun biomass,density and shape of mycelium pellets ofH.serotinawere greatly improved.

Hohenbueheliaserotina; Liquid seed; Optimized culture

中央財政林業(yè)科技推廣示范資金項目。

李延雷(1983- )，男，黑龍江大慶人，高級工程師，從事食用菌推廣工作。

2016-07-08

S 646

A

0517-6611(2016)26-0001-03