董夢潔， 左丹婷， 胡 玉， 喻婉清， 韓 雪

江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430056)

?

菜豆花內(nèi)生假單胞桿菌的分離與鑒定

董夢潔， 左丹婷， 胡 玉， 喻婉清， 韓 雪*

江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430056)

[目的]分離并鑒定菜豆花中的1株內(nèi)生優(yōu)勢細(xì)菌(WBF1)。[方法]從菜豆花中分離出1株內(nèi)生優(yōu)勢細(xì)菌WBF1，通過革蘭氏染色、16S rDNA及生理生化實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]革蘭氏染色結(jié)果顯示該菌為革蘭氏陰性桿菌，16S rDNA序列分析顯示其為變形桿菌科不動(dòng)桿菌屬假單胞桿菌；其生理生化特征符合假單胞桿菌特性；該菌定植于菜豆花中，生長溫度為20～43 ℃。[結(jié)論]該菌是菜豆基因工程生防菌宿主菌的良好候選菌株。

菜豆；內(nèi)生菌；染色；序列分析

菜豆，又稱四季豆、蕓豆，其嫩莢是國人喜愛的蔬菜品種。菜豆在美洲已有幾千年的栽培史，是當(dāng)?shù)赜〉诎踩说闹饕卟撕图Z食作物，大概在16世紀(jì)末傳入中國，并逐漸形成了一些有中國特色的栽培種和品種[1]。 菜豆開花期至收采期常見的病害有炭疽和銹病，蟲害有蚜蟲和豆螟，目前對于這些病蟲害沒有有效的防治方法，傳統(tǒng)農(nóng)藥仍然是防治菜豆花期病蟲害的主要手段?！敝位ú恢吻v”是所有豆科植物預(yù)防病蟲害的原則，菜豆防治的重點(diǎn)也在于花期的蟲害控制。

植物內(nèi)生菌是指可以定殖于健康植物組織中,而對植物特征及功能均無影響的微生物。內(nèi)生菌與植物在長期“協(xié)同進(jìn)化”過程中形成了“互利互惠”的關(guān)系,內(nèi)生菌從宿主植物中獲得穩(wěn)定的養(yǎng)分和生長環(huán)境[2-3],不易受外界條件影響[4-5]。同時(shí)，內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物常常幫助宿主抵御蟲害及外來微生物的侵害[6-7]。因此，內(nèi)生菌是基因工程生防菌非常理想的宿主菌，也是近年來農(nóng)業(yè)微生物研究的新熱點(diǎn)。但菜豆中內(nèi)生菌的研究報(bào)道在國內(nèi)外仍處于空白。鑒于此，筆者從菜豆花中分離出1株內(nèi)生假單胞桿菌(WBF1)，并對該菌進(jìn)行了鑒定，旨在為利用基因工程生防菌控制菜豆花期病蟲害提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料從菜豆花中分離出的1株內(nèi)生優(yōu)勢細(xì)菌WBF1。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生菌的分離。菜豆花表面清凈后，采用0.1%HgCl2、75%乙醇消毒處理，然后無菌研磨，離心，取上清涂布NA培養(yǎng)基，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，平板得到的單菌落劃線純化并保種。

1.2.2形態(tài)鑒定。菌株活化到對數(shù)生長期后，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡觀察。

1.2.3細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增。提取細(xì)菌基因組，采用16S rDNA通用引物,引物序列為1492R，5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT -3′和27F，5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 15 min。

1.2.4序列分析。應(yīng)用Blastn程序在核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank中搜索與測序結(jié)果相似的序列，并應(yīng)用軟件Mega 5.0進(jìn)行分析，得到該菌種屬情況。

1.2.5生長溫度范圍考察。菌落涂布LB固體平板，置于不同溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄菌落生長情況。

1.2.6生理生化實(shí)驗(yàn)。菌落過夜活化，對數(shù)生長期的菌體進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、H2S產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、V.P實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)和油脂水解實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1革蘭氏染色分離到的內(nèi)生菌菌體在油鏡下為革蘭氏陰性短桿狀菌(圖1)。

圖1　革蘭氏染色結(jié)果Fig.1　The result of gram staining

2.216S rDNA測序結(jié)果Mega軟件分析結(jié)果顯示，分離的內(nèi)生菌16S rDNA序列與不動(dòng)桿菌屬中的變形桿菌綱假單胞菌目菌的序列相似度達(dá)99%，因此，該內(nèi)生菌屬于假單胞桿菌目，變形桿菌綱,不動(dòng)桿菌屬。

2.3生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分離得到的內(nèi)生假單胞菌，其糖發(fā)酵、V.P、檸檬酸和油脂分解實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，淀粉水解、H2S產(chǎn)生、吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.4菌落生長溫度范圍菌體在溫度20～43 ℃生長情況良好。

3　結(jié)論與討論

該研究分離得到1株菜豆花的內(nèi)生假單胞桿菌，該菌可以在菜豆花中定殖，在各期花中屬于優(yōu)勢菌株，但在菜豆其他部位未分離到。該內(nèi)生菌的生長溫度為20～43 ℃，與菜豆開花結(jié)莢的溫度吻合。16S rDNA序列顯示，該內(nèi)生菌為假單胞菌目，變形桿菌綱，不動(dòng)桿菌屬。該菌生理生化特征符合假單胞桿菌的特性。研究報(bào)道，假單胞菌可以通過產(chǎn)生抗生物質(zhì)使植物抵御病害，并且其次級(jí)代謝產(chǎn)物可促進(jìn)植物吸收和生長[8]；同時(shí)假單胞菌具有幫助植物抗磷、耐鎘等對抗重金屬的特性[9]，是植物益生菌及抗蟲害菌的理想菌株。因此，通過基因工程的方法轉(zhuǎn)入殺蟲的基因，并利用該菌可以在菜豆花中特異性地定殖和繁殖，其生長繁殖對植株生長無不良影響的特點(diǎn)，使其有望成為菜豆基因工程生防菌宿主菌的理想候選菌株。

[1] 張箭.菜豆：四季豆發(fā)展傳播史研究[J].農(nóng)業(yè)考古,2014(4):218-229.

[2] BABALOLA O O.Beneficial bacteria of agricultural importance[J].Biotechnol Lett,2010,32(11):1559-1570.

[3] SOLTER L F,MADDOX J V,VOSSBRINCK C R.Physiological host specificity: A model using the European corn borer,Ostrinianubilalis(Hübner) (Lepidoptera: Crambidae) and microsporidia of row crop and other stalk-boring hosts[J].J Invertebr Pathol,2005,90(2):127-130.

[4] 楊威,劉蘇閔，郭堅(jiān)華.細(xì)菌定殖能力與其生物防治功能相關(guān)性研究進(jìn)展[J].中國生物防治，2010，26(S1)：90-94.

[5] 徐玲玲，單慶紅，郭斌.植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及應(yīng)用展望[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013，41(13):5641-5643,5709.

[6] 劉峰，蔣宇揚(yáng)，劉世英,等.植物內(nèi)生菌抗蟲工程研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2004，15(4):417-419.

[7] 陳澤斌，靳松,張永福，等.植物內(nèi)生菌生物防治研究進(jìn)展及存在的問題[J].昆明學(xué)院學(xué)報(bào),2014，36(3):40-42.

[8] 汪來發(fā),邱德勛.假單胞桿菌防治植物病害的研究進(jìn)展[J].陜西林業(yè)科技,1997，68(4):60-61,68.

[9] 陳雪姣，郭雪玲，南昊,等.一株耐鎘假單胞桿菌的分離鑒定及其對鎘的吸附研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,55(8):2765-2768,2773.

The Isolation of an EndogenousPseudomonassp. from the Bean and Identification

DONG Meng-jie, ZUO Dan-ting, HU Yu, HAN Xue*et al

(School of Life Science, Jianghan University, Wuhan, Hubei 430056)

[Objective] To isolate and identify an endogenous do minant (WBF1) from the bean flower. [Method] An endogenous dominant (WBF1) isolated from the bean flower was identified by gram staining, 16S rDNA and physiological and biochemical test. [Result] The gram staining result showed it was gram negative bacillus, and the 16S rDNA sequence analysis showed it belonged toPseudomonassp.,Acinetobacter, Proteus. The physiological and biochemical characters corresponded with that ofPseudomonassp. The bacterium grew in bean flower, and growth temperature was between 20 and 43 ℃. [Conclusion] The bacterium was an ideal candidate to be the engineered biocontrol host for the bean.

Bean; Endogenous bacteria; Staining; Sequence analysis

湖北省教育廳指導(dǎo)性項(xiàng)目(B2014080)；湖北省蔬菜豆類工程技術(shù)中心開放基金項(xiàng)目(201412)。

董夢潔(1995- )，女，湖北武漢人，本科生，專業(yè)：生物技術(shù)。*通訊作者，副教授，博士，從事微生物學(xué)研究。

2016-08-05

S 182

A

0517-6611(2016)26-0020-01