周　燕，申衛(wèi)東，周先果，劉金蓮，莫秋紅

(南寧輸血醫(yī)學(xué)研究所/南寧中心血站，南寧 530007)

?

·調(diào)查報告·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.027

廣西地區(qū)不同壯族人群Kell血型系統(tǒng)抗原基因分布特征的研究*

周燕，申衛(wèi)東，周先果，劉金蓮，莫秋紅

(南寧輸血醫(yī)學(xué)研究所/南寧中心血站，南寧 530007)

目的了解廣西地區(qū)不同地域壯族人群Kell血型系統(tǒng)k和K、Jsa和Jsb抗原的分布和基因多態(tài)性特征。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法(PCR-SSP)方法對1 025名廣西地區(qū)不同壯族人群的Kell血型系統(tǒng)進(jìn)行基因分型。結(jié)果廣西地區(qū)不同壯族人群Kell血型系統(tǒng)基因頻率為K=0.000 0，k=1.000 0；Jsa=0.000 0，Jsb=1.000 0。結(jié)論廣西地區(qū)不同壯族人群Kell基因頻率分布呈單態(tài)性分布，與文獻(xiàn)報道的中國其他的人群分布特點一致。

Kell血型系統(tǒng)；基因頻率；廣西[壯族自治區(qū)]；PCR-SSP

在目前國際輸血協(xié)會已確認(rèn)的33個紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中，Kell血型系統(tǒng)是僅次于ABO和Rh的第三大血型系統(tǒng)[1]；抗-Kell血型系統(tǒng)抗原的抗體能介導(dǎo)免疫輸血反應(yīng)和新生兒溶血癥。 Kell血型系統(tǒng)抗原發(fā)現(xiàn)于1946年，源自于患者Kelleher檢測出抗-Kell抗體而導(dǎo)致她的新生兒產(chǎn)生溶血性疾病，該抗體相應(yīng)抗原即為Kell血型系統(tǒng)的第1個抗原K；1949年Levine發(fā)現(xiàn)了Kell系統(tǒng)的第2個抗原k。1958年Giblett在黑人中發(fā)現(xiàn)了Kell血型系統(tǒng)中的新抗原Jsa，1963年Walker發(fā)現(xiàn)了Jsa的對偶抗原Jsb，迄今已發(fā)現(xiàn)了25個Kell血型系統(tǒng)的抗原。k和K抗原是Kell血型系統(tǒng)中最具有臨床意義的Kell抗原，在不同人群中有不同的頻率分布。在大多數(shù)人群中，k抗原較K抗原常見,黑人人群中98%是K-k+表型，高加索人群中為91%[2]；而Jsb則為高頻抗原。目前國內(nèi)有關(guān)Kell血型系統(tǒng)的研究多建立在漢族人群的k和K抗原基礎(chǔ)之上，對Jsa和Jsb抗原的研究甚為稀少。廣西是壯族人口主要聚集地，迄今國內(nèi)少見無壯族人群Kell血型系統(tǒng)的研究，壯族人群Kell血型系統(tǒng)是否與中國其他民族人群或白種人等人群存在差異？本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法(PCR-SSP)對9個廣西壯族人口分布較密集地區(qū)的人群進(jìn)行Kell血型系統(tǒng)基因分型，以期了解廣西壯族人群Kell血型系統(tǒng)k和K抗原，Jsa和Jsb的分布和基因多態(tài)性特征。

1　資料與方法

1.1一般資料2010～2013年間分別從廣西壯族人口聚集地武鳴、上林、隆安、賓陽、平果、大化、都安、巴馬、大新共9個地區(qū)采集無血緣關(guān)系血液樣本[3]。本研究在采集血液樣本之前均經(jīng)受試對象本人的知情同意，并與之簽訂臨床研究知情同意書。其中武鳴地區(qū)采集110份樣本，上林地區(qū)采集109份樣本，隆安地區(qū)采集110份樣本，賓陽地區(qū)采集96份樣本，平果地區(qū)采集120份樣本，大化地區(qū)采集120份樣本，都安地區(qū)采集120份樣本，巴馬地區(qū)采集120份樣本，大新地區(qū)采集120份樣本，共1 025份樣本。每份樣本均采集EDTA抗凝血5 mL，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2設(shè)備與試劑Magcore Nucleic Acid Extraction Kit(中國臺灣RBC Bioscience，批號：PM-K14-11332)，人類Kell紅細(xì)胞血型系統(tǒng)基因分型檢測試劑盒(美國G&T Biotech公司產(chǎn)，批號：#RB06)，rTaq DNA聚合酶[TaKaRa Biotechnology(Dalian)，批號：CK7601AA)]，瓊脂糖凝膠(西班牙Biwest，批號111860)，DNA green綠如藍(lán)核酸染料(北京天恩澤基因科技有限公司，批號：108111)。MagCore?HF16全自動核酸提取儀(中國臺灣RBC Bioscience)，GeneAmp9700型PCR擴(kuò)增儀(美國ABI)，Runone全套水平電泳儀(美國Embitec)，BIO-BEST凝膠成像儀(德國Simen)。

1.3DNA提取使用MagCore?HF16全自動核酸提取儀，按照MagCore?Nucleic Acid Extraction Kit試劑說明書進(jìn)行。

1.4PCR擴(kuò)增采用PCR-SSP，使用序列特異性引物，通過PCR 反應(yīng)，特異性擴(kuò)增Kell基因片段。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min 30個；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸5 min，降溫至4 ℃，完成擴(kuò)增。

1.5電泳配制2%瓊脂糖凝膠(每100 mL凝膠中含5 μL DNA green綠如藍(lán)核酸染料)，取5 μL PCR產(chǎn)物直接點樣到凝膠孔中，使用0.5×TBE緩沖液在100 V電壓下電泳20 min，然后在凝膠成像分析系統(tǒng)下拍照記錄實驗結(jié)果。

表2　Kell血型系統(tǒng)等位基因在不同人群中的分布

NA：無法評估；-：無法提取數(shù)據(jù)。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，不同人群基因頻率分布比較采用χ2檢驗，以顯示基因頻率分布的差異性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1廣西壯族人群Kell血型系統(tǒng)抗原基因頻率分布情況廣西9個壯族聚集地的1 025份血樣中均未發(fā)現(xiàn)K(+)及Jsa(+)樣本，K和Jaa基因頻率為0，而к與Jsb基因頻率則為1，即廣西壯族人群Kell血型系統(tǒng)呈單態(tài)性分布，見表1。

2.2廣西壯族人群與其他人群Kell血型系統(tǒng)基因多態(tài)性比較西藏藏族、成都漢族、青海土族及蒙古族與本組壯族相似，在人群中均未發(fā)現(xiàn)K抗原；而歐美人群中K抗原基因頻率要明顯高于中國人群。此外，Jsa抗原目前也僅在非洲黑人中發(fā)現(xiàn),見表2。

3　討　論

K抗原在所有人群中的頻率較低，而k抗原在所有人群中都有較高的存在率。本研究中采用PCR-SSP方法對本組1 025名壯族人群Kell血型系統(tǒng)的K、k抗原進(jìn)行基因分型，本組壯族人群均為kk，提示k基因頻率為1，Kell血型系統(tǒng)呈單態(tài)性分布，這與國內(nèi)漢族、西藏藏族及青海土族、蒙古族的研究一致；另據(jù)賈嫈[6]報道在青海地區(qū)的撒拉族中發(fā)現(xiàn)1例Kk雜合子，推測與當(dāng)?shù)厝隼迦巳号c居住在印度北部人群通婚有關(guān)。但總體而言，我國人群K抗原的基因頻率非常低，正是由于中國人群中K抗原頻率十分低，因此產(chǎn)生抗-K抗體并且再次遇到K陽性血輸注的概率基本為零，所以在我國K抗原鑒定并沒有納入常規(guī)檢測范圍。由于紅細(xì)胞血型系統(tǒng)的分布有種族和地區(qū)差異，因此所介導(dǎo)的免疫輸血反應(yīng)及新生兒溶血病的主要特征也有所差別。從表2中可發(fā)現(xiàn)，白種人群中K抗原基因頻率要明顯高于中國人群(P<0.05)，白種人群中因輸血或妊娠等免疫因素而產(chǎn)生抗-K抗體的概率較高，是除ABO和Rh系統(tǒng)以外最常見的紅細(xì)胞抗體。鑒于抗-K抗體能引起嚴(yán)重的免疫性輸血反應(yīng)和新生兒溶血病[14-15]，因此在歐美國家的輸血治療工作中，K抗原的鑒定成為獻(xiàn)血者和患者血型檢查的常規(guī)項目。同時，對該組1 025名壯族人群Kell血型系統(tǒng)的Jsa和Jsb抗原進(jìn)行基因分型檢測，廣西壯族人群與臺灣漢族、北京漢族類似，均未發(fā)現(xiàn)Jsa抗原存在。由于全球?qū)sa和Jsb抗原的分布研究尚少，目前僅在非洲黑人中報道過Jsa抗原的存在，故而本研究結(jié)果豐富了國內(nèi)Jsa和Jsb抗原分布的研究，且結(jié)果也與文獻(xiàn)報道相一致。

與其他血型系統(tǒng)類似，Kell血型也有無效型，稱為K0型，Chown于1957年在國際報道，1984年郝露萍等[16]報道了國內(nèi)1例K0型；2007年上海血液中心在24 093名健康無償獻(xiàn)血者中發(fā)現(xiàn)1例K0型，其發(fā)生率與國外研究類似，約為0.004%[17]。而在本次研究中，并未發(fā)現(xiàn)K0型，估計與樣本數(shù)量有關(guān)。但值得注意的是，K0型個體若被免疫后能產(chǎn)生抗Ku抗體，該抗體能與除K0表型以外所有的紅細(xì)胞反應(yīng)，同樣可引起新生兒溶血病及溶血性輸血反應(yīng)。這提示在今后的臨床輸血實踐中，要警惕K0型的存在及可能引起的免疫異常性疾病的發(fā)生。

此外，以往的紅細(xì)胞血型研究多采用經(jīng)典的血清學(xué)方法，雖然該方法較為直接且簡單易行，但也存在一些不足，如某些紅細(xì)胞血型系統(tǒng)的抗血清難以獲得、效價低、價格昂貴等，因此對該部分血型系統(tǒng)不適合采用血清學(xué)方法進(jìn)行大規(guī)模篩選。進(jìn)入21世紀(jì)以后，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，使運用以DNA為基礎(chǔ)的基因分型技術(shù)檢測紅細(xì)胞血型成為可能。血型基因分型技術(shù)檢測結(jié)果準(zhǔn)確、成本低，更為重要的是DNA標(biāo)本容易保存，利于核查，適合大規(guī)模篩查?；蚍中偷姆肿由飳W(xué)技術(shù)的發(fā)展也使得建立稀有血型供者庫，為臨床提供稀有紅細(xì)胞成為可能，這在本文的研究工作中得到充分的認(rèn)證。

廣西南寧作為東盟國際博覽會的永久舉辦地，國際交流與合作日益頻繁，且當(dāng)今社會的流動性已較以前大為增加，因此在醫(yī)療實踐中遇到外籍或其他民族的獻(xiàn)血者、用血者的概率已大大提高，通過該研究了解了廣西地區(qū)壯族人群Kell紅細(xì)胞血型系統(tǒng)呈單態(tài)性分布，這對確保臨床輸血安全將起到重要作用。另外通過本研究，所獲得的廣西地區(qū)壯族人群Kell血型中K、k抗原及Jsa、Jsb抗原的基因頻率，在一定程度上豐富了本地區(qū)壯族人群紅細(xì)胞血型系統(tǒng)的群體遺傳學(xué)資料，也可作為中華紅細(xì)胞稀有血型庫建設(shè)的依據(jù)。

[1]Arnoni CP,Muniz JG,De Paula TA,et al.An easy and efficient strategy for KEL genotyping in a multiethnic population[J].Rev Bras Hematol Hemoter,2013,35(2):99-102.

[2]杜若甫．中國人群體遺傳學(xué)[M]．北京：科學(xué)出版社，2004：125-130．

[3]梁庭望．中國壯族[M]．銀川：寧夏人民出版社，2012：13-15．

[4]張嶸，田力，李曉娟，等．西藏藏族人群多個紅細(xì)胞血型系統(tǒng)基因多態(tài)性研究[J]．中國輸血雜志，2014，27(5)：505-507．

[5]洪纓，鞏天祥，周昌華，等．成都地區(qū)獻(xiàn)血人群Kell等9個血型系統(tǒng)抗原基因分型研究[J]．中國輸血雜志，2012，25(8)：763-766．

[6]賈嫈．高海拔地區(qū)四民族Kell系統(tǒng)血型分布[J]．臨床檢驗雜志，2005，32(1)：56．

[8]Kahar MA,Patel RD.Phenotype frequencies of blood group systems (Rh,Kell,Kidd,Duffy,MNS,P,Lewis,and Lutheran) in blood donors of South Gujarat,India[J].Asian J Transfus Sci,2014,8(1):51-55.

[9]Meyer S,Vollmert C,Trost N,et al.High-throughput Kell,Kidd,and Duffy matrix-assisted laser desorption/ionization,time-of-flight mass spectrometry-based blood group genotyping of 4000 donors shows close to full concordance with serotyping and detects new alleles[J].Transfusion,2014,54(12):3198-3207.

[10]Roychoudhury AK,Nei M.Human polymorphic genes world distribution[M].New York:oxford university press,1988.

[11]Yung C H,Chow MP,Hu HY,et al.Blood group phenotype in Taiwan.Transfusion,1989,29:233-235

[12]郝露萍，張志，永尾暢夫，等．北京地區(qū)人群中6種紅細(xì)胞抗原的調(diào)查[J]．中華血液學(xué)雜志，1986，7(2)：68-69．

[13]杰夫·丹尼爾，主編.人類血型(中文翻譯版,第二版)[M]．北京：科學(xué)出版社，2007：352-362．

[14]Karagol BS,Zenciroglu A,Okumus NA,et al.Hemolytic disease of the newborn caused by irregular blood subgroup (Kell,C,c,E,and e) incompatibilities:report of 106 cases at a Tertiary-Care centre[J].Am J Perinatol,2012,29(6):449-454.

[15]Rath M,Smits-Wintjens V,Lindenburg I,et al.Exchange transfusions and top-up transfusions in neonates with Kell haemolytic disease compared to Rh D haemolytic disease[J].Vox Sang,2011,100(3):312-316.

[16]郝露萍，張志，永尾暢夫，等．一例稀有的K0紅細(xì)胞表現(xiàn)型[J]．中華血液學(xué)雜志，1984，5(5)：300-302．

[17]王晨．Kell血型中罕見K_0表型1例[J]．臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2007，6(9)：167．

The characteristic of gene polymorphism of Kell blood group in Zhuang population from Guangxi region in China*

Zhou Yan,Shen Weidong,Zhou Xianguo,Liu Jinlian,Mo Qiuhong

(NanningInstituteofTransfusionMedicine/NanningBloodCenter,Nanning,Guangxi530007,China)

ObjectiveTo investigate gene polymorphism of Kell blood group in different Zhuang population from Guangxi region.MethodsThe genotypes of Kell blood group of 1025 non-related individuals in different areas of Guangxi Zhuang population were analyzed by PCR-SSP.ResultsThe Kell antigen in all individuals was homozygous,the gene frequency of K and Jsa was 0,while that of k and Jsb was 1.000.ConclusionThe distribution characteristic of Kell blood group in Guangxi Zhuang population was monomorphism,which was similar to other Chinese population reported by literatures.

Kell blood-group system;gene frequency;Guangxi;PCR-SSP

廣西自然科學(xué)基金資助項目(2010GXNSFA013262)；廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題(Z2010196)；南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(201003048C-1)。作者簡介：周燕(1979-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事輸血醫(yī)學(xué)研究。

R394.4

A

1671-8348(2016)27-3827-03

2016-02-11

2016-04-06)