周　琴,鄭芳秀，陳英蘋，張曉青，張　玢，黃瑞萍，陸蓓亦，繆婷婷，袁　珮，虞　斌

(南京醫(yī)科大學附屬常州婦幼保健院/常州市產(chǎn)前診斷中心，江蘇常州 213003)

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論著·臨床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.011

高通量基因測序?qū)ρ鍖W篩查臨界風險孕婦的應(yīng)用價值*

周琴,鄭芳秀，陳英蘋，張曉青，張玢，黃瑞萍，陸蓓亦，繆婷婷，袁珮△，虞斌

(南京醫(yī)科大學附屬常州婦幼保健院/常州市產(chǎn)前診斷中心，江蘇常州 213003)

目的探討對于血清學篩查臨界風險的孕婦應(yīng)用高通量基因測序價值。方法選擇2012年5月至2015年5月在常州市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診的1 066例血清學篩查臨界風險的孕婦，在知情同意的原則下抽取孕婦外周血，提取血漿中胎兒游離DNA，制備文庫，采用Illumina NextSeq500測序平臺對其進行測序分析，對測序提示的染色體異?；颊咝醒蚰で淮┐?，羊水細胞培養(yǎng)后染色體G顯帶核型分析。結(jié)果1 066例樣本中，高通量基因測序提示15例染色體非整倍體異常，經(jīng)知情同意，13例孕婦自愿接受羊水產(chǎn)前診斷，其中7例羊水G帶核型結(jié)果與測序結(jié)果一致，包括4例21三體，1例18三體，1例47,XXX，1例47,XXY，其余6例G帶核型正常。結(jié)論高通量基因測序可作為血清學篩查臨界風險孕婦的有效補充檢測手段。

產(chǎn)前診斷；DNA;高通量測序；臨界風險；無創(chuàng)產(chǎn)前篩查

產(chǎn)前篩查和診斷是減少出生缺陷有效的預防手段之一。目前，大多機構(gòu)采用孕中期母體血清AFP+βHCG 的二聯(lián)產(chǎn)前篩查， 而后對高危人群進行羊水產(chǎn)前診斷。國內(nèi)外研究顯示，這種篩查模式胎兒非整倍體染色體異常檢出率僅為60%～70%[1-2]。國內(nèi)學者提出了臨界風險的概念，希望能夠加強此部分孕婦的管理，減少漏診病例的發(fā)生。

隨著分子生物學技術(shù)和醫(yī)學遺傳學的發(fā)展，應(yīng)用高通量基因測序技術(shù)檢測母血中胎兒游離DNA進行無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(non-invasive prenatal testing，NIPT)逐漸應(yīng)用于臨床。我國將臨界風險孕婦作為該技術(shù)適用人群，但迄今為止尚缺少相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)。本文回顧性分析本中心接受NIPT檢測的臨界風險孕婦結(jié)果，探討該技術(shù)用于臨界風險孕婦檢測胎兒染色體非整倍體的應(yīng)用價值。

1　資料與方法

1.1研究對象2012年5月至2015年5月，在常州市婦幼保健院因唐氏篩查臨界風險就診，經(jīng)知情同意自愿選擇NIPT的1 066例單胎孕婦，孕齡16～24周，年齡16～40歲。

1.2判斷標準血清學篩查臨界風險：即 1/1 000≤21三體綜合征(簡稱21三體)風險值小于1/300，1/1 000≤18三體綜合征(簡稱18三體)風險值小于1/350)。

1.3方法

1.3.1孕中期血清學篩查經(jīng)末次月經(jīng)或B超確定孕周，所有對象抽取肘靜脈血3 mL，室溫靜置30 min后離心分離血清，如在24 h內(nèi)不能及時測定，則放置-20 ℃冰箱內(nèi)保存。采用時間分辨免疫熒光分析法(Wallac1235 全自動時間分辨熒光免疫分析儀，美國PE公司)檢測孕婦血清AFP和f -βHCG濃度。結(jié)合孕婦年齡、孕周、體質(zhì)量、有無糖尿病等因素，應(yīng)用Lifecycle軟件計算風險值，包括神經(jīng)管缺陷(NTD)風險值、唐氏綜合征(DS)風險值、18-三體風險值。對臨界風險者及時召回進行遺傳咨詢[3]。

1.3.2無創(chuàng)基因檢測孕婦知情同意后，使用Streck公司生產(chǎn)的cell-free DNA BCT采血管抽取孕婦外周血10 mL，室溫保存，48 h內(nèi)分離血漿，4 ℃條件下1 600×g離心10 min，取上清液血漿16 000×g離心10 min，分離上清液血漿至EP管中，得到至少1.2 mL血漿。按Shaw等[4]的方法進行高通量測序檢測，主要包括：提取血漿中胎兒游離DNA，構(gòu)建文庫。采用Illumina NextSeq cn500測序平臺(美國Illumina公司)對其進行測序，獲得不低于400 M的有效reads數(shù)，平均每個樣本不低于4 M的reads。運行序列比對軟件BWA map將測序所得序列比對至人類基因組參考序列圖譜。使用自有軟件BGPD v2.0.1針對對比對結(jié)果進行每條染色體序列個數(shù)統(tǒng)計。計算每條染色體reads所占比例(%hrN)，sample代表需檢測的樣品，mean%ChrNreference和S.D.% ChrNreference分別代表參照樣品組平均值和變異系數(shù)，并利用以下公式計算各個染色體Z值。利用Z值來評估樣本的實際患病情況(cutoff：|Z|=3)。

1.3.3羊水細胞培養(yǎng)和核型分析對NIPT提示胎兒染色體非整倍體異常孕婦，進行產(chǎn)前遺傳咨詢，經(jīng)知情同意后于孕18～24周在超聲引導下行羊膜腔穿刺術(shù)，細胞培養(yǎng)、制片、閱片過程均按本實驗室常規(guī)操作進行[3]。

1.4隨訪采用病例查詢和電話的方式對妊娠結(jié)局進行隨訪，重點關(guān)注新生兒健康狀況。

2　結(jié)　果

2.1無創(chuàng)基因檢測和羊水細胞核型分析結(jié)果血清學篩查提示臨界風險孕婦經(jīng)知情同意有1 066例自愿接受NIPT進一步產(chǎn)前篩查，經(jīng)高通量基因測序和生物信息學分析，提示有15例胎兒染色體非整倍體高風險，高風險率1.41%(15/1 066)，包括4例21三體，2例18三體，1例18單體，3例47,XXX，2例47,XXY，3例45,XO。NIPT提示高風險孕婦均及時召回進一步產(chǎn)前遺傳咨詢，13例孕婦自愿接受羊膜腔穿刺術(shù)，經(jīng)羊水細胞培養(yǎng)G顯帶染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)7例結(jié)果與NIPT結(jié)果一致，包括4例21三體，1例18三體，1例47,XXX，1例47,XXY。6例樣本羊水染色體核型分析均為正常核型，即NIPT為假陽性。見表1。

雖經(jīng)充分產(chǎn)前咨詢，仍有1例孕婦NIPT提示18單體，拒絕羊膜腔穿刺，出生后隨訪家屬自述正常。另1例孕婦NIPT提示18三體，因胎兒B超示胎兒多發(fā)畸形予引產(chǎn)。

表1　臨界風險中NIPT高危與產(chǎn)前診斷結(jié)果對比

2.2高通量基因測序應(yīng)用于染色體非整倍體產(chǎn)前檢查的準確性1 066例血清學產(chǎn)前篩查臨界風險孕婦，經(jīng)NIPT后羊水細胞核型分析確診7例胎兒染色體非整倍體異常，發(fā)生率為0.66%(7/1 066)，應(yīng)用高通量基因測序技術(shù)檢測染色體非整倍體異常的陽性預測值為53.85%(7/13)。其中，21三體及18三體的陽性預測值均為100%(5/5)。性染色體異常的陽性預測值為25.00%(2/8)，性染色體異常假陽性率為75.00%(6/8)。

3　討　論

孕中期進行母體血清學篩查，對篩查高風險孕婦進一步產(chǎn)前診斷，這是目前常用的產(chǎn)前篩查與診斷模式。經(jīng)大量臨床數(shù)據(jù)證實，在出生缺陷防控方面起到巨大作用，但由于技術(shù)本身的局限性，篩查檢出率有待進一步提高。同時，以羊膜腔穿刺方法獲取胎兒遺傳物質(zhì)進行染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的金標準，但該方法為有創(chuàng)性、費時長，對實驗要求高，孕婦接受程度不高。在實際工作中，回顧性分析本中心的假陰性病例，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)漏診病例均為臨界風險孕婦。國內(nèi)其他研究也顯示，臨界風險孕婦存在相當比例的漏診可能，包括風險值臨界風險和單純MoM值異常[5]。因此，如果能夠進一步加強臨界風險孕婦的管理，將有效提高產(chǎn)前篩查的效能，提高出生人口素質(zhì)。然而，是否需要將臨界風險孕婦全部納入羊水產(chǎn)前診斷值得進一步商榷。

近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，高通量基因測序產(chǎn)前篩查項目逐步應(yīng)用于臨床，國內(nèi)外諸多報道均已證實，NIPT對T21、T18和T13的高敏感度、特異度、陽性預測值及正確率，與染色體核型分析技術(shù)有較高的一致性，并有無創(chuàng)性、高準確性和高通量等優(yōu)勢[6-10]。此方法的漏診率較低，并且具有非介入性的優(yōu)勢，可作為介入性產(chǎn)前診斷資源不足情況下的一種有效補充。為了進一步提高篩查效率，國內(nèi)專家特別將臨界風險孕婦作為該技術(shù)適用人群，希望通過“高級”篩查技術(shù)減少漏診的發(fā)生。與此同時，國際產(chǎn)前診斷協(xié)會2015年更新了NIPT專家共識，提出NIPT可以用于中風險人群，以減少漏診的發(fā)生[11]。為進一步探討該技術(shù)用于臨界風險孕婦胎兒染色體非整倍體檢測的應(yīng)用價值，本文回顧性分析了本中心接受NIPT檢測的臨界風險孕婦結(jié)果。

本研究中，1 066例臨界風險樣本中，NIPT提示15例染色體非整倍體異常，除1例孕婦拒絕做羊膜腔穿刺，1例孕婦因胎兒超聲示多發(fā)畸形引產(chǎn)，13例樣本經(jīng)染色體核型分析驗證，7例與測序結(jié)果一致，其余6例為正常核型。應(yīng)用高通量基因測序技術(shù)檢測染色體非整倍體異常的陽性預測值為53.85%(7/13)。其中，21三體及18三體的陽性預測值均為100%(5/5)，性染色體異常的陽性預測值為25.00%(2/8)?？梢娛褂酶咄繙y序作為無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)對21三體及18三體的準確率較高，而對于性染色體異常的準確性相對較低，可能與該技術(shù)本身存在一定的技術(shù)劣勢有關(guān)[12]。其數(shù)據(jù)分析部分對算法的依賴太大，給出的是一個統(tǒng)計分析的結(jié)果，故不能排除小概率事件的發(fā)生。上述結(jié)果由于樣本例數(shù)偏少，有待進一步積累病例資料研究分析。

本研究中出現(xiàn)6例假陽性，NIPT均提示性染色體高風險，可能與母體因素、胎盤滋養(yǎng)層細胞、性染色體互換等因素有關(guān)。而隨訪過程中，6例孕婦均拒絕做進一步檢測，故無法得知假陽性產(chǎn)生的確切原因。另外本研究中1例NIPT提示18三體的孕婦因胎兒B超提示胎兒多發(fā)畸形直接引產(chǎn)。據(jù)研究報道 ，超過90%的18三體胎兒中晚孕期可發(fā)現(xiàn)超聲影像改變，故推測該例樣本進行羊水診斷證實為18三體的可能性大[13]。另1例NIPT提示18單體的孕婦拒絕羊水穿刺，出生后隨訪，家屬自述正常，但未做外周血染色體診斷，無法確診。目前本單位獲得了國家高通量基因測序NIPT臨床試點資質(zhì)，將加大該技術(shù)的規(guī)范應(yīng)用，同時也會加強臨床應(yīng)用的研究，以得出更科學的臨床數(shù)據(jù)。

綜上所述，本研究中有7例孕婦因唐氏篩查檢測結(jié)果為臨界中風險進而選擇NIPT，最終確診胎兒為染色體數(shù)目異常。此類孕婦若按之前的產(chǎn)前診斷指導方案極有可能漏診，若等患兒出生時才發(fā)現(xiàn)異常，不僅會給這些家庭帶來巨大的精神和經(jīng)濟壓力，更會給社會造成巨大的負擔。因此，本課題組認為，NIPT可做為唐氏篩查臨界風險孕婦的有效補充檢測手段。

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Application of high-throughput sequencing in pregnant women with critical risk of serological screening*

Zhou Qin,Zheng Fangxiu,Chen Yingping,Zhang Xiaoqing,Zhang Bin,HuangRuiping,MiaoTingting,YuanPei△,YuBin

(ChangzhouMaternalandChildHealthCareHospital,theAffiliatedChangzhouMaternalandChildHealthCareHospitalofNanjingMedicalUniversity/ChangzhouPrenatalDiagnosisCenter,Changzhou,Jiangsu213003,China)

ObjectiveTo evaluate the clinical value of the application high-throughput sequencing for the detection of fetal chromosome in pregnant women with critical risk.MethodsA total of 1 066 pregnant women with critical risk of serological screening were collected from May 2012 to May 2015 at our center.The peripheral venous blood from the pregnant women was drawn,plasma DNA was extracted,and the sequencing library was prepared.High-throughput sequencing procedure was carried out on Illumina NextSeq500 platform.The cases of sex chromosomal abnormalities were advised to accept prenatal fetal chromosomal karyotype analysis of amniotic fluid cells using G-banding technique.ResultsHigh-throughput sequencing revealed 15 cases of sex chromosomal aneuploidies in 1 066 pregnant women.After receiving informed consent,13 cases of pregnant women voluntarily received amniotic fluid prenatal diagnosis,of which 7 cases were consistent with the sequencing results,including four cases of Trisomy21,one cases of Trisomy18,one cases of 47,XXX and one cases of 47,XXY,while the other six cases were confirmed to be normal karyotype.ConclusionHigh-throughput sequencing can be used as an effective method for the detection of critical pregnant women with critical risk.

prenatal diagnosis;DNA;high-throughput sequencing;critical risk;non-invasive prenatal testing

江蘇省常州市科技支撐計劃(社會發(fā)展)項目(CE20155055)。作者簡介：周琴(1983-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事臨床優(yōu)生優(yōu)育、遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷等工作?！?/p>

，E-mail:ybcz0519@163.com。

R175

A

1671-8348(2016)27-3780-03

2016-02-22

2016-04-26)