修 　 爽，　賈 馨 媛，祖國仁

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

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海洋細(xì)菌Vibrioagarivorans-1產(chǎn)瓊膠酶培養(yǎng)基優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)

修 爽，賈 馨 媛，祖國仁

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

以瓊膠酶的酶活力為指標(biāo)，對海洋細(xì)菌Vibrioagarivorans-1的培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，并研究瓊膠酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)。通過單因素和正交試驗(yàn)對海洋細(xì)菌Vibrioagarivorans-1的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明最佳營養(yǎng)組分為: 酵母膏的質(zhì)量濃度為12 g/L，瓊脂粉質(zhì)量濃度為3 g/L，NaCl質(zhì)量濃度為45 g/L，在該條件下酶活力達(dá)到7.689 U/g。其粗酶液的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適反應(yīng)pH為7，在pH范圍為6～8的內(nèi)酶活性較穩(wěn)定，溫度在20～40 ℃時酶的穩(wěn)定性較好，但溫度達(dá)到80 ℃基本失活。

瓊膠酶；海洋細(xì)菌Vibrioagarivorans-1；酶學(xué)性質(zhì)

0　引　言

瓊膠酶能將瓊膠多糖降解為瓊膠寡糖，目前瓊膠寡糖作為抗氧化劑、甜味填充劑等，被廣泛用于抑制淀粉的老化、食品的防腐等方面[1]。瓊膠酶是一種重要的酶工具，用于制備海藻的多糖結(jié)構(gòu)或單細(xì)胞以及其原生質(zhì)體。瓊膠酶具有專一性，并且能夠切斷特定鏈的特定位置，可用于制備低聚糖，α-瓊膠酶降解瓊脂糖結(jié)構(gòu)中的α-L-1,3糖苷鍵，產(chǎn)生以3,6-內(nèi)醚-L-半乳糖為還原端的瓊膠寡糖；β-瓊膠酶降解瓊脂糖結(jié)構(gòu)中的β-D-l,4-糖苷鍵，產(chǎn)生以D-半乳糖為還原端的新瓊膠寡糖[2]。其降解流程容易于控制，反應(yīng)條件較溫和，對于環(huán)境污染小，目前有報道對于雙歧桿菌的生長瓊膠寡糖能起到促進(jìn)作用，并能清除自由基等生理功能[3-4]。

我國對于海洋細(xì)菌產(chǎn)瓊膠酶菌株的研究還很少報道，目前大部分的文獻(xiàn)顯示研究還在產(chǎn)酶菌株的篩選、酶的制備純化與性質(zhì)分析及酶的應(yīng)用等初級階段，由于目前還沒篩選出高效的產(chǎn)酶菌株，無法進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)[5]。因此，優(yōu)化高產(chǎn)瓊膠酶產(chǎn)生菌培養(yǎng)基有重要的理論意義和應(yīng)用價值，本實(shí)驗(yàn)對產(chǎn)瓊膠酶海洋細(xì)菌Vibrioagarivorans-1發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究，以期為瓊膠酶的深入研究及開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

海洋細(xì)菌Vibrioagarivorans-1，大連黑石礁附近海域的江籬中分離得到,本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏 10，CaCl20.5，NaCl 25，K2HPO41.0，F(xiàn)eSO40.3，F(xiàn)ePO41.0，蛋白胨5.0，pH 7.2。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 5.0，CaCl20.5，酵母膏10.0，F(xiàn)ePO41.0，K2HPO41.0，瓊脂粉 2.0，F(xiàn)eSO40.3，NaCl 25，pH 7.2。

試管斜面培養(yǎng)基(2216培養(yǎng)基) (g/L)：酵母膏1.0，蛋白胨5.0，瓊脂粉20，磷酸鐵0.1，海水1.0 L，pH 7.2。

1.2方法

1.2.1DNS配制方法

溶液Ⅰ：取10%的NaOH溶液15.2 mL，加入6.8 g 結(jié)晶苯酚，將溶液稀釋至70 mL，并加入6.9 g的NaHSO3。

溶液Ⅱ：取10%的NaOH溶液300 mL，加入255 g的酒石酸鉀鈉，繼續(xù)加入880 mL、1%的3，5-二硝基水楊酸溶液。

將溶液Ⅰ與溶液Ⅱ混合均勻，得到的混合溶液放在避光處7～10 d后使用[6]。

1.2.2酶活力測定方法

分別向試管中加入1 mL的發(fā)酵溶液和1 mL 0.2%的H3PO4緩沖溶液，在40 ℃恒溫條件下水浴30 min，向處理后的溶液中加入2 mL DNS，將試管置于沸水中10 min，在25 mL的定容管定容，8 000 r/min離心10 min，取離心后的上清液在540 nm處測OD值。

酶活力定義：1 mL酶液1 min產(chǎn)1 μg還原糖定義為一個活力單位。

1.2.3培養(yǎng)基組分優(yōu)化

研究酵母膏、瓊脂粉、NaCl質(zhì)量濃度3個因素對產(chǎn)酶的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，確定最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分。

1.2.4瓊膠酶酶學(xué)性質(zhì)

通過優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分發(fā)酵產(chǎn)酶24 h后得到的粗酶液。

1.2.4.1最適反應(yīng)溫度

將瓊膠酶粗酶液分別于20、30、40、50、60、70、80 ℃反應(yīng)，測定酶活力，確定瓊膠酶粗酶液的最適反應(yīng)溫度。

1.2.4.2最適pH

分別用pH 4～10的緩沖液配制0.2%的瓊脂底物，在40 ℃條件下測定酶活力，確定瓊膠酶粗酶液的最適反應(yīng)pH。

1.2.4.3酶的熱穩(wěn)定性

將酶液分別在20、30、40、50、60、70、80 ℃下保溫l h，冷卻后測粗酶液殘余的相對酶活力。

1.2.4.4酶的pH穩(wěn)定性

將瓊膠酶粗酶液分別用pH為4～10的緩沖溶液進(jìn)行稀釋，在42 ℃的水浴鍋中放置4 h，測定瓊膠酶的相對酶活力。

2　結(jié)果與討論

2.1瓊脂粉質(zhì)量濃度對瓊膠酶酶活力的影響

將瓊脂粉質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5、6 g/L的培養(yǎng)基在30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h，分別測定瓊膠酶活力，結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)瓊脂粉質(zhì)量濃度達(dá)到3 g/L時，酶活力最高值為5.83 U/g，瓊膠質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，酶活力反而降低。

圖1　瓊脂粉質(zhì)量濃度對瓊膠酶酶活力的影響

2.2NaCl質(zhì)量濃度對瓊膠酶酶活力的影響

配制NaCl質(zhì)量濃度分別為15、25、35、45、55、65 g/L，瓊脂粉質(zhì)量濃度為3 g/L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，分別測定瓊膠酶酶活力，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到45 g/L時，酶活力最高值為6.58 U/g。NaCl質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，酶活力反而降低，

圖2　NaCl質(zhì)量濃度對瓊膠酶酶活力的影響

2.3酵母膏質(zhì)量濃度對瓊膠酶酶活力的影響

配制酵母膏質(zhì)量濃度分別為6、8、10、12、14、16 g/L，瓊脂粉質(zhì)量濃度為3 g/L、NaCl質(zhì)量濃度為45 g/L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基放在28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，分別測定瓊膠酶酶活力，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)酵母膏質(zhì)量濃度達(dá)到12 g/L時，酶活力最高值為6.910 U/g。酵母膏質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，酶活力反而降低。

圖3　酵母膏質(zhì)量濃度對瓊膠酶酶活力的影響

2.4正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，對瓊脂粉質(zhì)量濃度、NaCl質(zhì)量濃度、酵母膏質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，故采用L9(34)正交試驗(yàn)(表1)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，各因素對瓊膠酶活力的影響順序?yàn)锳，B，C，其最優(yōu)培養(yǎng)基條件為A2B2C2，即瓊脂粉質(zhì)量濃度3 g/L，NaCl質(zhì)量濃度45 g/L，酵母膏質(zhì)量濃度12 g/L，此條件下所得瓊膠酶活力為7.689 U/g。

2.5瓊膠酶酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1最適pH

從圖4中可以看出，pH為7時酶活力最高，但隨著pH的升高酶活力逐漸下降，因此確定酶的最適反應(yīng)pH為7。

表1正交試驗(yàn)因素和水平

Tab.1Factors and levels of orthogonal experiment

水平ρ/(g·L-1)瓊脂粉(A)NaCl(B)酵母膏(C)123510.0234512.5345515.0

表2　發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果

圖4　酶的最適反應(yīng)pH

2.5.2最適反應(yīng)溫度

從圖5中可以看出，瓊膠酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，當(dāng)溫度超過40 ℃時酶活力逐漸下降，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃以上時瓊膠酶基本失活。

2.5.3酶的pH穩(wěn)定性

從圖6可以看出，pH在6～8，相對酶活力達(dá)80%以上，低于或高于此范圍相對酶活力將迅速下降。

2.5.4酶的熱穩(wěn)定性

從圖7可以看出，瓊膠酶在20～40 ℃保溫1 h，相對酶活力在80%以上，酶活穩(wěn)定性較好，溫度逐漸升高，相對酶活力逐漸下降，溫度達(dá)到80 ℃時基本失活。因此該酶在40 ℃以下時酶活穩(wěn)定。

圖5　酶的最適反應(yīng)溫度

圖6　酶液的pH穩(wěn)定性

圖7　酶的熱穩(wěn)定性

3　結(jié)　論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定產(chǎn)瓊膠酶菌最優(yōu)培養(yǎng)基組分為：NaCl質(zhì)量濃度45 g/L，瓊脂粉質(zhì)量濃度3 g/L，酵母膏質(zhì)量濃度12 g/L，此條件下酶活力達(dá)到7.689 U/g。初步研究了瓊膠酶的酶學(xué)性質(zhì)，該菌株所產(chǎn)的瓊膠酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適反應(yīng)pH為7，在pH 6～8酶活性較穩(wěn)定，溫度在20～40 ℃時酶活性穩(wěn)定性較好，溫度達(dá)到80 ℃基本失活。

[1] 劉江濤,蔡俊鵬,吳冰.瓊膠酶及其綜合應(yīng)用的研究概況[J].現(xiàn)代食品科技,2005,21(1):177-179.

[2] VERA J, ALVAREZ R, MURANO E, et al. Identification of a marine agarolyticPseudoalteromonasisolate and characterization of its extracellular agarase[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(11): 4378-4383．

[3] FLORIAN W, CHRISTOPHE W, BERNAR K, et al. Structure-activity relationships of oligoagar elicitors towardsGracilariaconferta(Rhodophyta)[J]. Journal of Phycology, 2001, 37(3): 418-426.

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[5] 湯海青.高產(chǎn)瓊膠酶菌株的選育和產(chǎn)酶的研究[D]. 青島：中國海洋大學(xué),2004.

[6] IMOTO T, YEGISHITA K. A simple activity measurement of lysozyme[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1971, 35: 1154-1156.

Fermentation medium optimization of marine microorganisms producing agarase and its zymology properties

XIU Shuang, JIZ xinyuan,ZU guoren

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

ThecomponentsofliquidfermentationmediumofmarinemicroorganismsVibrio agarivorans-1producingagarasewereoptimizedwiththeactivityofagaraseasindicatorsandtheenzymaticpropertiesofcrudeagarasesolutionwasstudied.ThecultureconditionsofthemarinemicroorganismsVibrio agarivorans-1wereoptimizedbysinglefactorandorthogonalexperiment.Theexperimentalresultindicatedthattheactivityofagarasereachedat7.689U/gastheconcentrationofagar,NaClandyeastextractwas3, 45and12g/L,respectively.Theoptimalreactiontemperatureforcrudeagarasewasat40 ℃,andtheoptimalpHwas7.TheactivityofagarasewasstablewhenpHwasintherangeof6-8andtheactivityofagarasewashigherinatemperaturerangeof20-40 ℃,buttheactivityofagaraselostat80 ℃.

agarase; marine microorganismsVibrioagarivorans-1; zymology properties

2015-03-29.

修 爽(1989-)，女，碩士研究生.

TS201.6

A

1674-1404(2016)05-0328-04

修爽,賈馨媛,祖國仁.海洋細(xì)菌Vibrioagarivorans-1產(chǎn)瓊膠酶培養(yǎng)基優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,35(5):328-331.