王紅瑩, 杜　嫚

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

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斑馬魚母源凝集素基因zfol的克隆和表達(dá)分析

王紅瑩, 杜嫚

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

為驗(yàn)證凝集素Zfol是否為母源蛋白及其具體表達(dá)模式，揭示凝集素這類來(lái)源于母體的免疫物質(zhì)在魚類胚胎發(fā)育早期的免疫保護(hù)作用并提供理論依據(jù)，克隆Zfol 的基因全長(zhǎng)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析.利用RT-PCR和Western blot分析了zfolmRNA和Zfol蛋白的時(shí)空表達(dá).結(jié)果表明：zfolmRNA及Zfol蛋白在斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)均呈動(dòng)態(tài)變化.zfolmRNA在成魚的卵巢、心臟、肝臟、腎臟、腦中表達(dá)，在精巢中未檢測(cè)到表達(dá).Zfol蛋白在精巢、心臟、腦、肝臟等組織中檢測(cè)不到表達(dá)，而在腎臟中有低含量表達(dá)，在卵巢中有高含量表達(dá).

凝集素；斑馬魚； 基因zfol； 克隆；表達(dá)分析

凝集素是動(dòng)、植物體內(nèi)一種重要組分，作為一類能識(shí)別并結(jié)合糖基的蛋白質(zhì)，可結(jié)合致病源表面糖蛋白或糖綴合物，在識(shí)別致病源、抑制細(xì)菌增殖、阻止卵子多精受精、調(diào)節(jié)糖類物質(zhì)代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用類在[1-4].早期胚胎發(fā)育過(guò)程中依賴母源免疫和自身非特異免疫.卵母細(xì)胞中有一些凝集素來(lái)源于母體，可能是魚體的先天免疫因子，在魚類還沒(méi)發(fā)育成熟時(shí)保護(hù)早期胚胎避免病原入侵[5-8].研究卵母細(xì)胞特異的凝集素功能有助于深入了解胚胎發(fā)育早期的免疫保護(hù)機(jī)制[7,9,10].與其他魚類相比，作為模式生物的斑馬魚(Daniorerio)早期胚胎發(fā)育細(xì)胞分裂快速、飼養(yǎng)簡(jiǎn)便、遺傳背景清晰、遺傳操作技術(shù)成熟等，這些特點(diǎn)為本研究的順利開展提供了可能.

本文以克隆斑馬魚基因zfol為切入點(diǎn)，在生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平分別分析了zfol在胚胎發(fā)育過(guò)程中及各組織中的表達(dá)差異，為進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行功能研究奠定了基礎(chǔ).

1　材料和方法

1.1材料

供試材料：野生型斑馬魚在(28±0.5)℃循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng)，每天早晚各投喂餌料1次，控制光照(14 h照明/10 h黑暗)的明暗周期照明.需要收集胚胎時(shí)，于前一天將雌雄斑馬魚按照只數(shù)2∶1比例放置在同一繁殖缸內(nèi)，中間用隔板隔開，第二天光照前去掉插板，待斑馬魚開始追尾，約20～40 min后開始產(chǎn)卵，收集受精卵，胚胎用水清洗后，置于ERS培養(yǎng)液，放置于(28±0.5)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2試劑

限制性內(nèi)切酶、KOD試劑盒、Taq酶(日本TakaRa)，T4 DNA 連接酶、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega)，Trizol regent(美國(guó)Invitrogen)，抗體(上海Abmart)，凝膠回收試劑盒(上海華舜)，質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒(上海生工).

1.3RNA的提取和cDNA合成

取斑馬魚胚胎，利用TRIZOL方法提取總RNA.利用MMLV反轉(zhuǎn)錄成cDNA.

1.4目的基因zfol克隆和mRNA水平檢測(cè)

克隆zfol基因的引物：F：5′-ATGAAGGTTTATC

AAGGTGTTTTG-3′，R：5′-TTATAGAGTACATTTACG

GATG-3′.β-actin作為內(nèi)參，引物如下：F： 5′-CTTGCGGTATCCACGAGAC-3′，R：5′-GCGCCATACA

GAGCAGAA-3′. PCR產(chǎn)物與pGEM-T Vector 相連接，轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌中，利用菌落PCR鑒定是否插入正確，測(cè)序.zfol轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)采用RT-PCR方法，引物同上.

1.5Western blot 檢測(cè)Zfol蛋白的時(shí)空表達(dá)模式

受精后的斑馬魚胚胎觀察，選取不同發(fā)育時(shí)期的胚胎進(jìn)行收集.斑馬魚成魚中，選取不同組織，將以上樣品分別用 RIPA裂解液裂解，隨后采用Western blot 方法檢測(cè)Zfol的不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中的表達(dá)模式.

2　結(jié)果

2.1zfol克隆測(cè)序及序列分析

PCR擴(kuò)增后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證得到zfol的開放閱讀框序列(圖1).經(jīng)生物信息學(xué)檢測(cè)，zfol基因編碼256個(gè)氨基酸.其5′非翻譯區(qū)的長(zhǎng)度為73 bp，3′非翻譯區(qū)的長(zhǎng)度為93 bp，有完整的poly A尾巴，基因的cDNA全長(zhǎng)為937 bp.以上結(jié)果表明zfol基因編碼完整的蛋白.

圖1　凝膠電泳檢測(cè)zfol基因 Fig.1　Agarose gel electrophoresis detection of zfol gene

圖2　測(cè)序結(jié)果和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Fig.2　Sequencing result and correspongding amino acid sequences

2.2zfolmRNA表達(dá)量在不同發(fā)育時(shí)期的胚胎中的變化

為研究凝集素zfol是否為母源蛋白，及其在魚類的早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的模式，采用RT-PCR方法檢測(cè)了其在斑馬魚受精后不同胚胎發(fā)育時(shí)期的mRNA表達(dá)量的變化(圖3).以β-actin為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)檢測(cè)各個(gè)時(shí)期所用的總RNA量是否一致.RT-PCR分析結(jié)果顯示zfol在受精后的各個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá).從發(fā)育起始就有高含量表達(dá)，說(shuō)明其是來(lái)自母體遺傳，為母源蛋白，表達(dá)量受精后到16 hpf一直較高，后期隨著胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，母體蛋白影響變小，zfol的mRNA表達(dá)量下降，到36 hpf后，隨著胚胎的分裂發(fā)育，新生胚胎自身的mRNA及蛋白大量表達(dá)，zfol的表達(dá)量有所上升.

圖3　受精后斑馬魚胚胎發(fā)育不同時(shí)期的zfol mRNA表達(dá)水平Fig.3　Temperal expression of zfol mRNA in different periods during zebrafish embryogenesis

2.3在成體斑馬魚不同組織中zfol轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化

不同組織的定位預(yù)示著不同的功能實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR方法研究了斑馬魚成魚中不同組織中zfol的表達(dá)變化(圖4)，結(jié)果顯示組織表達(dá)中，zfolmRNA在成魚的卵巢、心臟、肝臟、腎臟、腦中有表達(dá)，在精巢中未檢測(cè)到表達(dá).

圖4　斑馬魚成魚各組織中zfol mRNA表達(dá)水平Fig.4　zfol mRNA expression level in each indicated tissues of zebrafish

2.4Zfol蛋白在斑馬魚各發(fā)育早期的表達(dá)水平變化

蛋白起始表達(dá)時(shí)期、表達(dá)量的多少預(yù)示了是否是母源蛋白.實(shí)驗(yàn)以β-Tubulin作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)Zfol蛋白表達(dá)情況(圖5).在受精后最初的4 h內(nèi)，Zfol含量非常高，此時(shí)期新生胚胎自身的蛋白尚未開始大量表達(dá).說(shuō)明此時(shí)的Zfol來(lái)自母體.此后蛋白含量出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，母體蛋白逐漸耗盡，在受精后約6 h，蛋白含量回落，表達(dá)量下降.12～16 h蛋白含量有小幅上升，20～24 h表達(dá)量再次回落，到36 h蛋白表達(dá)量升至最高，此后Zfol蛋白含量劇烈下降.故斑馬魚受精后早期胚胎發(fā)育的96 h內(nèi)，Zfol蛋白表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)波動(dòng)變化.

0～96 hpf：斑馬魚胚胎受精后0～96 h圖5 Zfol蛋白在斑馬魚各發(fā)育早期的表達(dá)水平Fig.5　Zfol expression levels at each early developmental stages of zebrafish

2.5在成體斑馬魚不同組織中Zfol蛋白水平表達(dá)模式

不同組織的蛋白定位直接與蛋白的功能相關(guān)，采用Western blot檢測(cè)了Zfol在斑馬魚成體魚不同組織中的表達(dá)模式(圖6).結(jié)果表明：Zfol蛋白在精巢、心臟、腦、肝臟等組織中檢測(cè)不到表達(dá)，而在腎臟中有低含量表達(dá)，在卵巢中有高含量表達(dá).

圖6　斑馬魚不同組織中Zfol 蛋白的表達(dá)水平Fig.6　Zfol expression level in different tissues of zebrafish

3　討論

凝集素基因zfol是否為母源基因及其具體表達(dá)模式是本研究關(guān)注的要點(diǎn).魚類各組織中尤其是卵母細(xì)胞中有一些凝集素來(lái)源于母體.在卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程中及受精后的早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，這些凝集素的功能可能與免疫保護(hù)相關(guān)，屬于母源垂直傳遞的母源免疫.為研究克隆基因zfol是否為母源基因，揭示其分布模式和表達(dá)模式，實(shí)驗(yàn)克隆得到了該基因全長(zhǎng)，生物信息學(xué)分析表明該基因的cDNA編碼一個(gè)全序列的功能蛋白.在斑馬魚受精后的早期胚胎發(fā)育時(shí)期，該基因的mRNA及蛋白在斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)均呈動(dòng)態(tài)變化，且在受精后的前幾個(gè)小時(shí)表達(dá)量很高.在成魚組織中，卵巢的表達(dá)量最高.說(shuō)明zfol基因和蛋白在母體就存在，并隨著魚的產(chǎn)卵，經(jīng)卵母細(xì)胞垂直傳遞給新生個(gè)體.因此在受精后的幾小時(shí)內(nèi)，新生個(gè)體自身的基因和蛋白還沒(méi)大量表達(dá)時(shí)，zfol基因和蛋白的含量處于高表達(dá).因此zfol基因是母源基因，其編碼的蛋白質(zhì)是母源凝集素蛋白.

此外，zfolmRNA在成魚的卵巢、心臟、肝臟、腎臟、腦中有表達(dá)，在精巢中未檢測(cè)到表達(dá).Zfol蛋白在精巢、心臟、腦、肝臟等組織中檢測(cè)不到，而在腎臟中有低含量表達(dá)，在卵巢中有高含量表達(dá).這可能是翻譯水平存在調(diào)控，因此造成mRNA和蛋白檢測(cè)結(jié)果的差異.zfolmRNA及Zfol蛋白在斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)均呈動(dòng)態(tài)變化，說(shuō)明基因和蛋白的調(diào)控是多層次和多方面的.在轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯以及翻譯后修飾等過(guò)程中，存在多方面的復(fù)雜調(diào)控，以保證基因在個(gè)體的不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和不同組織器官中的精確表達(dá).

本文對(duì)斑馬魚凝集素基因zfol在早期不同發(fā)育時(shí)期和成體不同組織器官中的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果表明其是母源凝集素蛋白.凝集素被認(rèn)為是來(lái)自母體的有的會(huì)對(duì)胚胎發(fā)揮免疫保護(hù)功能[7,10,11].由zfol基因在斑馬魚胚胎發(fā)育早期的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)譜，獲知了其發(fā)揮重要功能的關(guān)鍵時(shí)期，為后續(xù)進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ).

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Molecular Cloning and Characterization of Maternal Lectin Genezfolin Zebrafish

WangHongying,DuMan

(Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plant Germplasm in Wuling Area of China ,College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities of Life Science,Wuhan,430074)

To investigate the expression pattern of maternal lectin Zfol, and to provide the theoretical basis for immune protection effect of lectins from the mother′s immune material on embryogenesis, the full-length ofzfolgene was cloned and the expression pattern was characterized. Bioinformatics analysis tozfolwas also performed. The spatial-temporal expression pattern ofzfolmRNA and protein levels was determined by RT-PCR and Western blot, respectively. The results indicated that bothzfolmRNA and Zfol proteins showed dynamic expression pattern during zebrafish embryogenesis. High level expression ofzfolmRNA were detected in the liver, kidney, ovary, brain, and heart except testis in adult fish; whereas, Zfol protein was highly expressed in ovary, less expressed in kidney, and not expressed in testis, heart, brain and liver.

lectin; zebrafish;zfol;cloning;expression analysis

2016-04-04

王紅瑩 (1976-), 女, 副教授, 博士, 研究方向: 水生生物學(xué)、分子生物學(xué), E-mail: wanghongying@mail.scuec.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31001099)

S965.299

A

1672-4321(2016)03-0026-04