周秀云

(北京市海淀區(qū)婦幼保健院超聲科，北京　100080)

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·腫瘤·

多配體蛋白聚糖結(jié)合蛋白在女性腦膠質(zhì)瘤侵襲/轉(zhuǎn)移中的異常表達(dá)機(jī)制及其影像學(xué)規(guī)律

周秀云

(北京市海淀區(qū)婦幼保健院超聲科，北京100080)

目的探討多配體蛋白聚糖結(jié)合蛋白(Syntenin)在女性腦膠質(zhì)瘤侵襲/轉(zhuǎn)移中的異常表達(dá)分子機(jī)制并分析其影像學(xué)規(guī)律。方法選取45例該院收治的經(jīng)手術(shù)證實(shí)的女性腦腫瘤患者，其中腦膠質(zhì)瘤26例，轉(zhuǎn)移瘤19例。取手術(shù)切除獲得的26份腦膠質(zhì)瘤組織，采用RT-PCR和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Syntenin和磷酸化FAK Tyr397基因與蛋白的表達(dá)情況。收集術(shù)前患者行常規(guī)MRI和動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI掃描相關(guān)資料，在腫瘤實(shí)性區(qū)域最大截面和周圍區(qū)域分別選取3個(gè)ROI，經(jīng)工作站處理并計(jì)算得到ROI內(nèi)的腫瘤的容積轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)(Ktrans)、回流速率常數(shù)(Kep)、血管外細(xì)胞容積分?jǐn)?shù)(Ve)。分析腦膠質(zhì)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的影像學(xué)規(guī)律。結(jié)果Syntenin mRNA、FAK mRNA表達(dá)水平在不同病理分級(jí)的腦膠質(zhì)瘤中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Syntenin mRNA、FAK mRNA表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤病理等級(jí)呈正相關(guān)。Syntenin 與磷酸化FAK Tyr397蛋白表達(dá)水平在不同病理分級(jí)的腦膠質(zhì)瘤中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Syntenin 與磷酸化FAK Tyr397蛋白表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤病理等級(jí)呈正相關(guān)；Syntenin 蛋白表達(dá)水平與FAK Tyr397呈正相關(guān)。膠質(zhì)瘤與轉(zhuǎn)移瘤的瘤實(shí)質(zhì)Ktrans、Kep、Ve值之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。膠角質(zhì)母細(xì)胞瘤周圍區(qū)域Ktrans、Kep、Ve值均明顯高于轉(zhuǎn)移瘤周圍區(qū)域，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。膠質(zhì)瘤Ktrans值與周圍區(qū)域Ktrans、Kep、Ve值均呈正相關(guān)；腦轉(zhuǎn)移瘤Ktrans值與周圍區(qū)域Ktrans、Kep、Ve值均無相關(guān)性。結(jié)論女性腦膠質(zhì)瘤中Syntenin可通過與FAK相互作用經(jīng)相應(yīng)的信號(hào)通路提升腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力；動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI可準(zhǔn)確反映腦膠質(zhì)瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤實(shí)性部分和瘤周區(qū)域的血腦屏障損壞程度，在兩者鑒別診斷中具有重要價(jià)值。

腦膠質(zhì)瘤；多配體蛋白聚糖結(jié)合蛋白；黏著斑激酶；腦轉(zhuǎn)移瘤

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，具有惡性生長、侵襲性強(qiáng)、預(yù)后不佳等特點(diǎn)，其中膠質(zhì)瘤高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性是復(fù)發(fā)和病死的主要原因。多配體蛋白聚糖結(jié)合蛋白(Syntenin)是從人黑色素瘤細(xì)胞中克隆出來的一種支架蛋白，可通過上調(diào)自身PDZ結(jié)構(gòu)域上黏著斑激酶(FAK)活性來介導(dǎo)多種腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移〔1〕。而Syntenin能否通過與FAK相互作用來影響腦膠質(zhì)瘤的侵襲、遷移仍未明確〔2〕。本研究探討Syntenin促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，并分析其中腦膠質(zhì)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI參數(shù)特點(diǎn)。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2015年3月至2016年3月在本院進(jìn)行 MRI 檢查，并經(jīng)手術(shù)證實(shí)的腦腫瘤患者45例，均為女性。其中膠質(zhì)瘤26例，年齡56～72〔平均(63.40±8.95)〕歲；膠質(zhì)瘤Ⅰ級(jí)4例、Ⅱ級(jí)9例、Ⅲ級(jí)7例、Ⅳ級(jí)6例。腦轉(zhuǎn)移瘤19例(原發(fā)部位為卵巢、乳腺、肺)，年齡58～79〔平均(65.11±9.27)〕歲。入選患者均為首次手術(shù)治療，無化療史，術(shù)前均行常規(guī)MRI和DCE-MRI掃描，自愿參與本次研究。腦膠質(zhì)瘤組織由膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除獲得，經(jīng)生理鹽水洗凈后，液氮速凍15 s，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑兔抗人Syntenin、FAK Tyr397多克隆抗體(上海豐壽生物科技有限公司)，小鼠抗人β-actin單克隆抗體(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，RIPA裂解液(西安晶彩生物科技有限公司)，Trizol、PCR試劑盒(上海浩然生物技術(shù)有限公司)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3膠質(zhì)瘤組織中Syntenin mRNA、FAK mRNA檢測(cè)采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)，取100 mg腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本，Trizol一步法提取總RNA，紫紫外分光光度法測(cè)定其純度和含量，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。-20℃保存?zhèn)溆?。反?yīng)體系30 μl，包括：蒸餾水16 μl，緩沖液5 μl，dNTPs(2 mmol/L)3 μl，MgSO4(30 mmol/L)3 μl，引物(10 mmol/L)1 μl，cDNA 1 μl，PCR酶1 μl；采用常規(guī)兩步法，共完成30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。取3 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光成像，讀取積分光密度值，以 β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行校正。

1.4膠質(zhì)瘤組織中Syntenin、磷酸化FAK Tyr397蛋白檢測(cè)采用Western印跡法檢測(cè)，取腦轉(zhuǎn)移瘤組織標(biāo)本0.05 g，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后剪碎，加入蛋白裂解液，研磨。取組織懸液置于EP管中，4℃ 10 000 r/min離心15 min，取上清，測(cè)定蛋白濃度。取蛋白樣品于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，封閉后分別于兔抗人Syntenin、磷酸化FAK Tyr397抗體結(jié)合，4℃放于搖床孵育4 h；Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗后與二抗結(jié)合，4℃放于搖床孵育2 h；TBST洗滌后化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)避光孵育，發(fā)光顯示。

1.5MRI檢查35例患者均使用美國GE3.0T MRI掃描儀和八通道相控陣線圈進(jìn)行掃描。數(shù)據(jù)導(dǎo)入GE ADW3.1影像工作站，使用Image Tool進(jìn)行圖像處理，利用血流動(dòng)力學(xué)雙室模型，建立動(dòng)脈輸入函數(shù)(AIF)選取側(cè)腦室體層面的上矢狀竇為參照血管，標(biāo)記ROI面積約為50 mm2，得到時(shí)間-對(duì)比劑濃度曲線。取腫瘤實(shí)性最大截面部分測(cè)量3個(gè)ROI，參考常規(guī)MRI掃描，避開出血、壞死、鈣化、囊性病變區(qū)域，計(jì)算得到腫瘤的容積轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)(Ktrans)、回流速率常數(shù)(Kep)、血管外細(xì)胞容積分?jǐn)?shù)(Ve)，記錄3個(gè)ROI中的上述變量值，計(jì)算平均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.0軟件行t檢驗(yàn)和Pearson等級(jí)相關(guān)性分析。

2　結(jié)　果

2.1膠質(zhì)瘤組織中Syntenin mRNA、FAK mRNA的表達(dá)情況不同病理分級(jí)腦的腦膠質(zhì)瘤中，Syntenin mRNA/β-actin mRNA的光密度比值分別為：Ⅰ級(jí)0.00±0.00、Ⅱ級(jí)0.40±0.02、Ⅲ級(jí)0.71±0.02、Ⅳ級(jí)0.94±0.01；FAK mRNA /β-actin mRNA的光密度比值分別為：Ⅰ級(jí)0.90±0.01、Ⅱ級(jí)1.16±0.09、Ⅲ級(jí)1.42±0.04、Ⅳ級(jí)1.89±0.04。Syntenin mRNA、FAK mRNA表達(dá)水平在不同病理分級(jí)的腦膠質(zhì)瘤中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson分析顯示，Syntenin mRNA、FAK mRNA表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤病理等級(jí)呈正相關(guān)(r=0.891、0.963，P<0.05)。見圖1。

2.2膠質(zhì)瘤組織中Syntenin 與磷酸化FAK Tyr397蛋白表達(dá)情況不同病理分級(jí)腦的腦膠質(zhì)瘤中Syntenin條帶與β-actin條帶的灰度值比值分別為：Ⅰ級(jí)0.00±0.00、Ⅱ級(jí)0.20±0.05、Ⅲ級(jí)0.39±0.03、Ⅳ級(jí)0.90±0.03；磷酸化FAK Tyr397比值分別為：Ⅰ級(jí)0.19±0.02、Ⅱ級(jí)0.30±0.02、Ⅲ級(jí)0.50±0.01、Ⅳ級(jí)0.76±0.05。Syntenin 與磷酸化FAK Tyr397蛋白表達(dá)水平在不同病理分級(jí)的腦膠質(zhì)瘤中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。Pearson分析顯示，Syntenin 與磷酸化FAK Tyr397蛋白表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤病理等級(jí)呈正相關(guān)(r=0.962、0.947，P<0.05)。Syntenin 蛋白表達(dá)水平與FAK Tyr397呈正相關(guān)(r=0.935，P<0.05)。見圖2。

2.3膠質(zhì)瘤與轉(zhuǎn)移瘤影像學(xué)測(cè)量參數(shù)比較膠質(zhì)瘤與轉(zhuǎn)移瘤的瘤實(shí)質(zhì)Ktrans、Kep、Ve值之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。膠角質(zhì)母細(xì)胞瘤周圍區(qū)域Ktrans、Kep、Ve值均明顯高于轉(zhuǎn)移瘤周圍區(qū)域(P<0.05)。見表1。

圖1　不同病理分級(jí)腦膠質(zhì)瘤中Syntenin mRNA、FAK mRNA表達(dá)變化

圖2　不同病理分級(jí)腦膠質(zhì)瘤中Syntenin 與磷酸化FAK Tyr397蛋白表達(dá)變化

類型n Ktrans 瘤實(shí)質(zhì)瘤周圍 Kep 瘤實(shí)質(zhì)瘤周圍 Ve 瘤實(shí)質(zhì)瘤周圍膠質(zhì)瘤260.26±0.070.09±0.041)0.40±0.090.42±0.091)0.64±0.100.11±0.031)轉(zhuǎn)移瘤190.24±0.060.04±0.020.36±0.050.21±0.050.68±0.120.07±0.02

與轉(zhuǎn)移瘤相比：1)P<0.05

2.4瘤實(shí)質(zhì)Ktrans值與其周圍區(qū)域Ktrans、Kep、Ve值相關(guān)性分析膠質(zhì)瘤Ktrans值與周圍區(qū)域Ktrans、Kep、Ve值均呈正相關(guān)(r=0.762、0.475、0.662，P<0.05)。腦轉(zhuǎn)移瘤Ktrans值與周圍區(qū)域Ktrans、Kep、Ve值均無相關(guān)性(r=0.251、0.030、0.105，P>0.05)。

3　討　論

Syntenin是包含2個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域的支架蛋白，在多種惡性腫瘤細(xì)胞系中均呈過度表達(dá)，并且與腫瘤惡性程度及病情進(jìn)展緊密相連。研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組織中Syntenin表達(dá)水平隨組織惡性程度的增加而上升〔3〕。分子機(jī)制研究顯示，Syntenin通過上調(diào)FAK活性來介導(dǎo)黑色素瘤轉(zhuǎn)移〔4〕，而Syntenin能否通過與FAK相互作用來影響腦膠質(zhì)瘤的侵襲、遷移，目前仍未明確。

本研究提示腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Syntenin可通過與FAK相互作用，通過對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路來調(diào)控細(xì)胞結(jié)構(gòu)重組、黏著斑形成、降解等過程，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲〔5〕。相關(guān)研究顯示，F(xiàn)AK的C末端仍未發(fā)現(xiàn)和PDZ結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的基因序列〔6〕，說明黏著斑中Syntenin和FAK的相互作用還需要其他分子介導(dǎo)。本次研究說明在腦膠質(zhì)瘤中，Syntenin能夠通過提升整合素介導(dǎo)的FAK信號(hào)通路來促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。

動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI可通過追蹤對(duì)比劑來評(píng)估血腦屏障結(jié)構(gòu)完整性和腦中血流動(dòng)力學(xué)，分為定量和半定量參數(shù)分析，半定量參數(shù)主要反映腫瘤組織中的灌注情況，定量參數(shù)可分析腫瘤的血管通透性，包括Ktrans、Kep、Ve值，其關(guān)系可用Ve=Ktrans/Kep表示，數(shù)值越高說明血管通透性越強(qiáng)〔7〕。本次研究提示腦膠質(zhì)瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤破壞血腦屏障方面無明顯差異，說明上述腫瘤具有類似的惡性腫瘤特性。

瘤周區(qū)域包括腫瘤浸潤區(qū)、腫瘤組織周圍水腫區(qū)。本次研究說明腦膠質(zhì)瘤周區(qū)域的血管通透性增加，血腦屏障損壞程度明顯高于腦轉(zhuǎn)移瘤。腦膠質(zhì)瘤中有明顯的血管增生，對(duì)周圍組織有較強(qiáng)浸潤性，瘤周微循環(huán)出現(xiàn)異常，主要與其內(nèi)生皮細(xì)胞間距增寬，由血管通透性增加引發(fā)。腦轉(zhuǎn)移瘤周區(qū)域無腫瘤細(xì)胞，Ktrans、Kep、Ve值相對(duì)較低。本次研究結(jié)果和腫瘤自身特征相吻合，腦膠質(zhì)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的瘤周區(qū)域的微血管通透性存在明顯差異，對(duì)這其鑒別診斷具有重要價(jià)值。

1Kegelman TP,Das SK，Emdad L,etal.Targeting tumor invasion:the roles of MDA-9/Syntenin〔J〕.Expert Opin Ther Target，2015；19(1):97-112.

2晉暉.氫質(zhì)子磁共振波譜在腦膠質(zhì)瘤臨床應(yīng)用中的價(jià)值〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(7):1815-6.

3Hwangbo C，Park J，Lee JH，etal.mda-9/Syntenin protein positively regulates the activation of Akt protein by facilitating integrin-linked kinase adaptor function during adhesion to type I collagen〔J〕.J Biol Chem，2011；286(38):33601-12.

4Sala-Valdés M，Gordón-Alonso M，Tejera E，etal.Association of syntenin-1 with M-RIP polarizes Rac-1 activation during chemotaxis and immune interactions〔J〕.J Cell Sci，2012；125(5):1235-46.

5Das SK，Bhutia SK，Kegelman TP，etal.MDA-9/syntenin:a positive gatekeeper of melanoma metastasis〔J〕.Front Biosci，2012；17(1):1-15.

6Kegelman TP，Das SK，Hu B,etal.MDA-9/syntenin is a key regulator of glioma pathogenesis〔J〕.Neurol Oncol，2014；16(1):50-61.

7李永麗，連建敏，竇社偉，等.腦膠質(zhì)瘤術(shù)后放療后復(fù)發(fā)和放射性腦壞死磁共振彌散張量成像鑒別〔J〕.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013；48(3):362-5.

〔2015-12-11修回〕

(編輯袁左鳴)

北京市自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目(20147110001)；北京市海淀區(qū)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(K20110069)

周秀云(1964-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事超聲影像學(xué)診斷研究。

R65

A

1005-9202(2016)18-4496-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.045