張國(guó)雙　王志濤　趙　琦　尋知元

(天津市安定醫(yī)院，天津　300222)

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人參總皂苷對(duì)β-淀粉樣蛋白25～35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞毒性的保護(hù)作用

張國(guó)雙王志濤1趙琦2尋知元

(天津市安定醫(yī)院，天津300222)

目的探討人參總皂苷對(duì)β-淀粉樣蛋白(Aβ25～35)誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。方法建立大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞Aβ25～35損傷模型。通過(guò)Neurofilament染色，測(cè)定細(xì)胞毒性以及乳酸脫氫酶(LDH)活性考察人參總皂苷對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞毒性的保護(hù)作用；利用Hoechst33258進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；通過(guò)Fluo-3AM熒光探針技術(shù)在共聚焦顯微鏡下測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度 (〔Ca2+〕i)的變化情況。結(jié)果1.5 μmol/L Aβ25～35為造成神經(jīng)細(xì)胞毒性的最佳濃度。人參總皂苷50 mg/L，100 mg/L以及200 mg/L對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞具有良好保護(hù)作用，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。人參總皂苷100 mg/L可顯著降低Aβ25～35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可明顯抑制Aβ25～35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞〔Ca2+〕i的升高。結(jié)論人參總皂苷可有效保護(hù)海馬神經(jīng)細(xì)胞免受Aβ25～35毒性損傷，其作用機(jī)制與降低〔Ca2+〕i有關(guān)。

人參總皂苷；β-淀粉樣蛋白(Aβ)25～35；海馬神經(jīng)細(xì)胞；細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度〔Ca2+〕i

阿爾茨海默病(AD)主要表現(xiàn)為記憶力減退、認(rèn)知功能障礙、分析判斷能力的下降、意識(shí)模糊和智力逐漸喪失、甚至人格改變，最終導(dǎo)致生活不能自理〔1〕。在65歲以上人群中，AD是繼心血管病、腫瘤、腦卒中之后的第4位死亡原因〔2，3〕。AD發(fā)病早期的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)是β-淀粉樣前體蛋白(APP)分解代謝和β-淀粉樣蛋白(Aβ)的異常釋放和沉積〔4〕。目前，獲得批準(zhǔn)治療AD的藥物主要是有益于記憶和思維的，并不能夠針對(duì)疾病的病因來(lái)治療〔5〕。因此尋找從發(fā)病機(jī)制上能改善AD的藥物非常有現(xiàn)實(shí)意義。體外原代培養(yǎng)海馬細(xì)胞，采用Aβ25～35損傷海馬細(xì)胞，可一定程度上模擬在體AD的發(fā)生機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)旨在探討人參總皂苷對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑Aβ25～35購(gòu)自Sigma(美國(guó))人參總皂苷購(gòu)買(mǎi)于成都普瑞法生物有限公司(成都，中國(guó))。

1.2動(dòng)物、給藥及分組雌性SD大鼠，體重200～220 g，孕期18 d，由天津大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。海馬細(xì)胞生長(zhǎng)至第7天后，取出海馬細(xì)胞進(jìn)行分別處理：①正常組，不加任何處理因素，換上同體積的新鮮的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；②模型組，在每孔中加入Aβ25～35終濃度為1.5 μmol/L無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；③人參總皂苷組(含Aβ25～351.5 μmol/L)。每小組藥物均用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液配制。置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3細(xì)胞活性以及乳酸脫氫酶(LDH)活性測(cè)定向96孔板的每孔加入20 μl MTT(3 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后吸棄上清，加入150 μl二甲基亞砜，充分振蕩至晶體完全溶解，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)各孔的光密度值(OD)，并計(jì)算相對(duì)生存率。取各孔的細(xì)胞培養(yǎng)基，按照南京建成LDH試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并在450 nm處測(cè)定各組吸光度值，計(jì)算各組培養(yǎng)基中LDH活性。

1.4Hoechst33258 染色方法培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞于第7天給藥處理，分為正常組，模型組(Aβ25～351.5 μmol/L)，人參總皂苷組(20 μmol/L)給藥處理24 h后開(kāi)始免疫染色。按章立等〔6〕等方法操作，冷PBS清洗，4%多聚甲醛固定1 h。PBS清洗3次后，加5 mg/L Hoechst33258染色液染色30 min，PBS液清洗，封片液封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞核固縮或碎片分裂視為凋亡。于64× 鏡下每片玻璃片隨機(jī)取5個(gè)不同視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡率(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))。

1.5激光共聚焦測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子(〔Ca2+〕i)濃度根據(jù)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定海馬細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度〔6〕。采用Fluo-3 AM熒光染色鈣離子，激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)為525～530 nm測(cè)定〔Ca2+〕i。激光共聚焦皿培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞7 d，棄去培養(yǎng)液，PBS洗兩遍，加入終濃度為5 μmol/L Fluo-3AM與D-Hank(無(wú)Ca2+)的混合液，負(fù)載45 min后，測(cè)定F值；加入Ionomycin終濃度為5 μmol/L測(cè)定Fmax；加入MnCl2終濃度為2 mmol/L測(cè)定Fmin，計(jì)算〔Ca2+〕i濃度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1Aβ25～35造成海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷海馬神經(jīng)細(xì)胞在加入1.5 μmol/L Aβ25～355 h后，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)生存率為(78.9±6.3)%。綜合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(圖1)，選定Aβ25～351.5 μmol/L為神經(jīng)細(xì)胞毒性模型的造模濃度。

2.2人參總皂苷對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞影響

2.2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)正常細(xì)胞核呈圓形或橢圓形；凋亡細(xì)胞核固縮或裂片。模型Aβ25～35組可見(jiàn)較多的細(xì)胞表現(xiàn)為核染色質(zhì)凝集，致密濃染，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮或碎裂成2塊以上。與模型組比較，人參皂苷保護(hù)組可以顯著降低Aβ25～35處理后海馬神經(jīng)元的損傷，細(xì)胞形態(tài)有較好的恢復(fù)，呈現(xiàn)出與正常細(xì)胞類(lèi)似的形態(tài)學(xué)(圖2)。

2.2.2細(xì)胞凋亡率檢測(cè)如圖3所示：Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示，正常細(xì)胞熒光著色淺；凋亡細(xì)胞呈強(qiáng)熒光反應(yīng)。模型組可見(jiàn)熒光增強(qiáng)。與正常組細(xì)胞凋亡率〔(5.2±0.4)%〕及LDH活性〔(100.2±11.3)%〕相比，模型組細(xì)胞凋亡率〔(29.6±1.1)%〕以及LDH活性〔(259.3±19.2)%〕顯著增加；由Aβ25～35所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及LDH活性可顯著地被100 mg/L人參總皂苷抑制。與模型組比較，人參總皂苷可以顯著降低Aβ25～35處理后海馬神經(jīng)元的凋亡率〔(13.2±0.6)%〕和LDH活性〔(149.6±9.5)%〕。

2.2.3〔Ca2+〕i檢測(cè)圖4所示，與正常組比較〔(100.2±9.8)%〕1.5 μmol/L Aβ25～35使Fluo-3-Ca熒光顯著增強(qiáng)〔(328.7±29.6)%〕，而人參總皂苷處理顯著抑制了這種熒光增強(qiáng)〔(261.3±19.6)%〕。模型組對(duì)細(xì)胞損害較大，造成〔Ca2+〕i增高，而人參總皂苷能對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的損害具有較好的保護(hù)作用。

圖1　Aβ25～35對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用(Hoechst 33258染色，×64)

圖2　人參總皂苷緩解Aβ25～35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷(Hoechst33258染色,×64)

圖3　人參總皂苷對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(Hoechst 33258熒光染色，×64)

圖4　人參總皂苷對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞〔Ca2+〕i的影響

3　討　論

人參Panax ginseng C.A.Mey和西洋參P.quinquefolium L.是五加科人參屬植物，具有“除邪氣、補(bǔ)五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、開(kāi)心、益智”等功效〔7，8〕。人參總皂苷是人參、西洋參的主要活性提取組分，具有抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老和治療老年性疾病引起的認(rèn)知功能障礙等作用〔4，9，10〕。

AD發(fā)病早期的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)是APP分解代謝和Aβ的異常釋放和沉積〔4〕。Aβ25～35可造成DNA損傷等凋亡特征，因此選擇Aβ25～35造成海馬細(xì)胞毒性具有重要意義。染色質(zhì)染色劑Hoechst33258熒光染色證明，1.5 μmol/L 的Aβ25～35使培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡特征。人參總皂苷能有效地減少由Aβ25～35毒性產(chǎn)生的DNA碎片發(fā)生，降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示人參總皂苷可通過(guò)抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡而降低Aβ25～35對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用?！睠a2+〕i濃度的升高被認(rèn)為是凋亡的重要信號(hào)，研究表明抑制〔Ca2+〕i濃度的升高一定程度上可以防止細(xì)胞凋亡〔11，12〕。本研究表明人參總皂苷可平衡神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)〔Ca2+〕i濃度，降低Aβ25～35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

1宋曉征，李成杰，張子寅，等.維生素E對(duì)阿爾茨海默病患者血清中CD8/CD28表達(dá)水平的影響〔J〕.中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2013;16(20)：48-9.

2Glenner GG，Wong CW.Alzheimer's disease and Down's syndrome：sharing of a unique cerebrovascular amyloid fibril protein〔J〕.Biochem Biophy Res Commun，1984;122(3)：1131-5.

3Miller DL，Papayannopoulos IA，Styles J，etal.Peptide compositions of the cerebrovascular and senile plaque core amyloid deposits of Alzheimer's disease〔J〕.Arch Biochem Biophy，1993;301(1)：41-52.

4蘇心，張文治，吳劍娟.β-淀粉樣蛋白對(duì)培養(yǎng)胎鼠大腦神經(jīng)干細(xì)胞作用的研究〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2005;7(3)：192-5.

5Wang JZ，Grundke-Iqbal I，Iqbal K.Glycosylation of microtubule-associated protein tau：an abnormal posttranslational modification in Alzheimer's disease〔J〕.Nature Med，1996;2(8)：871-5.

6章立，李新榮，徐蘅，等.用Fluo3-AM測(cè)定2型糖尿病患者淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及藥物對(duì)患者胞內(nèi)Ca2+濃度的影響〔J〕.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999;30(6)：451-5.

7譚世強(qiáng)，張愛(ài)華，許永華，等.人參總皂苷對(duì)粘蟲(chóng)體內(nèi)蛋白質(zhì)含量及消化酶活性的影響〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2013;38(11)：1692-6.

8魏建華，楊文志，劉強(qiáng)，等.人參餅干中人參總皂苷、人參單體皂苷Rb1及Re+Rg1含量測(cè)定及人參餅干中人參皂苷的定性鑒別〔J〕.人參研究,2013;(1)：31-3.

9潘愛(ài)珍，易偉民，余曉娟，等.人參總皂苷對(duì)脾虛模型大鼠的保護(hù)作用研究〔J〕.中國(guó)藥房，2013;24(39)：3682-4.

10呂昕瞳，楊丹莉，鄧江，等.人參總皂苷對(duì)血管緊張素Ⅱ所致乳大鼠心肌細(xì)胞肥大的抑制作用〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013;27(4)：641-5.

11Emilsson L，Saetre P，Jazin E.Alzheimer′s disease：mRNA expression profiles of multiple patients show alterations of genes involved with calcium signaling〔J〕.Neurobiol Dis，2006;21(3)：618-25.

12Poon HF，Shepherd HM，Reed TT，etal.Proteomics analysis provides insight into caloric restriction mediated oxidation and expression of brain proteins associated with age-related impaired cellular processes：mitochondrial dysfunction，glutamate dysregulation and impaired protein synthesis〔J〕.Neurobiol Aging，2006;27(7)：1020-34.

〔2014-12-29修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

張國(guó)雙(1979-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事精神醫(yī)學(xué)臨床研究。

R743

A

1005-9202(2016)18-4438-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.015

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2天津市人民醫(yī)院