周超　劉彥　張文鋒　陳楠　李培志

(1. 成都市第六人民醫(yī)院肝膽外科， 四川 成都 610051；2. 成都市第五人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 四川 成都 611130；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科， 重慶 400010)

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·論著·

foxo3a在膿毒血癥患者外周血單個核細(xì)胞的表達(dá)變化及意義

周超1劉彥2張文鋒3陳楠3李培志3

(1. 成都市第六人民醫(yī)院肝膽外科， 四川 成都 610051；2. 成都市第五人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 四川 成都 611130；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科， 重慶 400010)

目的檢測叉頭蛋白O3a(forkhead box O3a，foxo3a)在膿毒血癥患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的表達(dá)變化，并探討其在膿毒血癥發(fā)生過程中的作用。方法分離急性梗阻性化膿性膽管炎(acute obstructive suppurative cholangitis，AOSC)患者(n=27)治愈1周后的PBMC和血清，以及健康志愿者(n=12)的PBMC和血清，分別用蛋白印記法(western blotting，WB)和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(qRT-PCR)檢測PBMC中foxo3a、核因子κB p65(NF-κB p65)和核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制因子(IκB)和蛋白及基因的表達(dá)和磷酸化水平；并用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素10(IL-10)的含量。結(jié)果27例AOSC患者血清中LPS、TNF-α和IL-10的含量明顯高于治愈后1周及12例健康志愿者。同時，AOSC患者foxo3a的蛋白和基因的表達(dá)量明顯低于健康志愿者，但是在治愈1周后，foxo3a的蛋白和基因的含量恢復(fù)到正常水平，p-foxo3a與foxo3a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；另外，NF-κB p65在發(fā)病初期增高，治愈1周后基本恢復(fù)正常，而IκB及p-IκB表達(dá)與foxo3a與p-foxo3a變化相似。這些結(jié)果說明在AOSC 中foxo3a的磷酸化過程參與調(diào)控NF-κB的激活及機(jī)體炎癥因子的失衡。結(jié)論foxo3a在膿毒血癥發(fā)生過程中可通過磷酸化降解IκB或直接激活NF-κB，可作為緩解膿毒血癥發(fā)生初期的治療靶點之一。

膿毒血癥；叉頭蛋白O3a；核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制因子

膿毒血癥(sepsis)是由重癥膽管炎、蜂窩織炎、膿腫等感染病灶引發(fā)的全身炎性反應(yīng)綜合征和繼發(fā)多器官功能衰竭，病情兇險，病死率極高[1-2]。腸道細(xì)菌及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)移位和炎癥介質(zhì)紊亂等參與了膿毒血癥發(fā)生和發(fā)展過程[3-4]。通常，細(xì)菌和LPS移位至外周血中，通過toll受體家族(toll like receptors， TLRs)激活下游核因子κB(nuclear fator κB，NF-κB)，產(chǎn)生大量的促炎因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)，白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)等，打破體內(nèi)炎癥介質(zhì)平衡，加劇膿毒血癥及多器官功能衰竭等[5-6]。

NF-κB的激活需要首先磷酸化錨釘在NF-κB多聚體上的核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制因子(inhibitor of NF-κB， IκB)。IκB磷酸化后，NF-κB多聚體激活并入核，進(jìn)而促進(jìn)TNFα等促炎因子轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[7-8]。因此，調(diào)控IκB磷酸化的過程對阻斷細(xì)菌或LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，以及平衡體內(nèi)炎癥介質(zhì)有重大的意義。而新近報道，叉頭蛋白O3a(forkhead box O3a，foxo3a)在體外克羅恩病細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)其不僅可直接參與IκB的磷酸化過程，并具有協(xié)同激活NF-κB的作用[9-10]。但是，在膿毒血癥休克患者中，foxo3a是否參與到細(xì)菌和LPS移位至外周血，并調(diào)控NF-κB通路激活過程中，目前尚無報道。因此，本實驗將檢測foxo3a在急性梗阻性化膿性膽管炎(acute obstructive suppurative cholangitis，AOSC)患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的表達(dá)變化，并探討其在AOSC中對NF-κB通路激活的作用。

1　材料和方法

1.1病例對象本組病例選自2014年1月～2015年12月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治被診斷為急性梗阻性化膿性膽管炎患者27例。診斷以入院磁共振胰膽管成像(magnetic resonance cholangiopancreatography，MRCP)或計算機(jī)斷層掃描(computed tomography， CT)檢查以及結(jié)合臨床表現(xiàn)和血清學(xué)檢測結(jié)果為準(zhǔn)，診斷均由3位具有20年以上臨床經(jīng)驗的肝膽外科主任醫(yī)師共同決定。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2013版《東京指南》[11]。另選健康自愿者12例作對照。

1.1.1入選標(biāo)準(zhǔn)①重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院順序收治診斷為急性梗阻性化膿性膽管炎患者，年齡<70歲。②有膽管炎及膽總管梗阻病理基礎(chǔ)，符合膽總管引流術(shù)指正。③符合以下1項或1項以上：發(fā)熱或低體溫(體溫>38.3℃，或<36℃)；脈搏>90次/min或>正常范圍2倍以上；呼吸急促(R>20次/min)；意識改變；水腫或正凈流液平衡(24 h內(nèi)>20 ml/kg)； 高糖血癥(>7.7 mmol/L)。④符合以下1項或1項以上：外周血白細(xì)胞計數(shù)>12×109/L或<4×109/L或幼稚白細(xì)胞>10%；血漿C反應(yīng)蛋白>正常值兩倍以上；血漿降鈣素原>正常值兩倍以上。⑤收縮血壓<90 mmHg或平均動脈壓<70mmHg或收縮壓下降超過40 mmHg或低于正常值二分之一。⑥符合以下1項或1項以上：動脈血氧低下(PaO2/FiO2<300)；急性少尿或無尿；肌酐增加值>0.5 mg/dL；凝血功能異常(INR>1.5或aPTT>60 s)；麻痹性腸梗阻；血小板計數(shù)<10×109/L；總膽紅素>7 mg/dL。 ⑦符合以下1項或1項以上：血鈣>1 mmol/L； 毛細(xì)血管充盈或紫癜。⑧此次發(fā)病前未接受任何抗感染治療及解除膽道梗阻治療。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn)①符合入選標(biāo)準(zhǔn)但拒絕實驗安排患者。②年齡>70歲。③引起膽管炎或膽道梗阻為腫瘤或先天性硬化性膽管炎。④入院前已經(jīng)接受抗感染及解除膽道梗阻治療。⑤有心臟等重大器官器質(zhì)性疾病等手術(shù)禁忌癥，接受膽道穿刺或膽道手術(shù)存在巨大風(fēng)險。

1.1.3AOSC治愈標(biāo)準(zhǔn)此次膽道梗阻得以解除；無膽道梗阻和膿毒血癥的臨床癥狀，即體溫、脈搏、血壓、意識、尿量和血氧飽和度等正常，無腹痛、黃疸等；血液學(xué)檢查指標(biāo)如白細(xì)胞、血小板計數(shù)正常，膽紅素、PTT、C反應(yīng)蛋白等恢復(fù)正常水平。

1.2方法

1.2.1PBMC的分離入組患者簽署知情同意書后分別于治療前(early stage，ES)及治愈后1周(cure group，CG)分別用無內(nèi)毒素乙二胺四乙酸真空抗凝管抽取外周血10 ml。外周血經(jīng)梯度密度離心(3000 g×10 min)后收集上層血清用于酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測，剩余血細(xì)胞加入等體積PBS(0.01M，PH=7.4)充分混勻；取與上述混合液等體積的外周血單個核細(xì)胞分離液(LDS1075，天津灝洋)加入新的離心管中，將混合液小心加入分離液的上層，水平梯度密度離心(400 g×20 min)后加入10 ml PBS水平離心(400 g×10 min×2次)；最后，獲得的細(xì)胞沉淀即為PBMC，繼續(xù)用于蛋白印記法(western blotting，WB)和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測。健康志愿者(healthy volunteers，HV)根據(jù)上述方法抽取外周血并分離PBMC進(jìn)行相同檢測。

1.2.2qRT-PCR檢測首先提取PBMC總RNA：提取總RNA步驟按照試劑盒說明書操作(CW0597，北京康為世紀(jì))，即每107個細(xì)胞加入1 ml裂解液裂解細(xì)胞，再轉(zhuǎn)移到無酶EP管進(jìn)行震蕩、離心，經(jīng)氯仿萃取、乙醇溶解、去除細(xì)胞蛋白和基因組DNA后，用RNase H2O溶解并檢測RNA濃度。然后用SYBR?Green法進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄(RR047a，takara)和Premix Ex TaqⅡ法(RR820L，takara)進(jìn)行SYBR PCR反應(yīng)：①去除基因組DNA：20 μl體系(4 μl 5×gDNA Eraser Buffer，2 μl gDNA Eraser，2 μg 總RNA和補(bǔ)充體積的RNase H2O)42℃水浴 2 min。②逆轉(zhuǎn)錄：2 μl 的PrimeScript RT Enzyme Mix I、2 μl 的RT Primer Mix、8 μl的 5×PrimeScript Buffer、8 μl的無RNase dH2O和20 μl去除基因組gDNA后的總RNA產(chǎn)物。37℃，15 min；85℃，5 s；4℃保存。③PCR反應(yīng)：25 μl反應(yīng)體系(12.5 μl 2×SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ、1 μl PCR Forward Primer(10 μmol/L)、1 μl PCR Reverse Primer(10 μmol/L)、2 μl反轉(zhuǎn)錄溶液和8.5 μl RNase dH2O)進(jìn)行預(yù)變性：95℃，30 s，1循環(huán)；然后擴(kuò)增：95℃，5 s；60℃，60 s；總共40循環(huán)。最后用-△△Ct=-[(Ct目的-Ct內(nèi)參)實驗組-(Ct目的-Ct內(nèi)參)對照組]進(jìn)行半定量分析。目的基因的引物序列及大小，引物由上海生工生物公司合成，見表1。

表1　目的分子引物設(shè)計

1.2.3WB檢測首先提取PBMC總蛋白，即每107個細(xì)胞加入100 μl RIPA裂解液裂解細(xì)胞，經(jīng)震蕩、高速離心后獲取細(xì)胞總蛋白上清；BCA法測得蛋白含量，按每個樣本50 μg的蛋白質(zhì)上樣，按每孔等質(zhì)量等體積加入，進(jìn)行10% SDS-PAGE，100 V恒壓電泳120 min；250 mA，60 min濕轉(zhuǎn)至PVDF膜中，5% BSA室溫封閉90 min；加一抗體(兔抗foxo3a抗體(1∶500，sc-11351，Santa Cruz)，兔抗p-foxo3a(1∶500，sc-101683， Santa Cruz)，小鼠抗IκB抗體(1:500，sc-135945， Santa Cruz)，兔抗p-IκB抗體(1∶500，sc-101705， Santa Cruz)，兔抗NF-κB p65抗體(1∶500， sc-109， Santa Cruz)，小鼠抗β-actin抗體(1∶250， BM0627，武漢博士德))后4℃孵育過夜；洗滌后，加HRP標(biāo)記的二抗(山羊抗兔IgG(1∶2000，BA1054，武漢博士德)，山羊抗鼠IgG,1∶2000，BA1075，武漢博士德))，室溫孵育90 min；TBST洗滌后，ECL試劑盒在凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光檢測；利用Image Lab軟件掃描目的條帶和相應(yīng)的β-actin條帶，并測量灰度值。然后將目的條帶的灰度值與β-actin的灰度值進(jìn)行比較，所得的比值為目的蛋白的相對蛋白表達(dá)量。

1.2.4ELISA檢測收集各組的血清，分別用人脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)試劑盒(xy-0784E，上海信裕生物)、人TNF-α試劑盒(EK0525，武漢博士德)和人IL-10試劑盒檢測(EK0416，武漢博士德)檢測上述細(xì)胞因子及LPS含量，即：加樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃ 90 min，不洗；加生物素標(biāo)記抗體，37℃ 60 min；洗滌緩沖液洗滌3次；加 ABC反應(yīng)液，37℃ 30 min。洗滌緩沖液洗滌5次；加TMB反應(yīng)液，37℃ 30 分鐘；加入TMB終止液，讀數(shù)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值計數(shù)出血清中相應(yīng)分子的含量。

2　結(jié)果

2.1患者一般情況及術(shù)后并發(fā)癥AOSC患者27例中，發(fā)病時間2小時～13天，合并心功能不全2例，肺功能不全1例，乙肝肝硬化3例，腎功能不全1例。既往具有膽道病史24例，膽道手術(shù)史10例；發(fā)熱或寒戰(zhàn)23例，黃疸25例，上腹痛27例；21例有典型Charcot’s三聯(lián)征表現(xiàn)，16例有Reynold’s五聯(lián)征表現(xiàn)?；颊呔醒装Y反應(yīng)證據(jù)(白細(xì)胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白或降鈣素原異常)和肝功能異常等。因膽囊結(jié)石繼發(fā)膽總管結(jié)石18例，其中Mirziz’s 綜合征3例；肝膽管結(jié)石5例，其中肝內(nèi)外膽管結(jié)石3例，肝內(nèi)膽管結(jié)石2例；單純膽管良性狹窄3例，膽總管下端擴(kuò)張1例?；颊咧委熐?、治愈后一周及健康志愿者12例一般情況，見表2。

AOSC患者接受治療后均無死亡病例，住院時間9～15天；其中15例行膽總管切開取石術(shù)+T管引流術(shù)，5例行膽管穿刺術(shù)，4例行膽腸吻合術(shù)，2例行肝葉切除術(shù)。術(shù)后均給予抗炎、保肝、營養(yǎng)支持及補(bǔ)液治療。術(shù)后有4例患者出現(xiàn)手術(shù)相關(guān)嚴(yán)重并發(fā)癥，其中肺炎2例，調(diào)整抗生素后痊愈；肝斷面積液伴感染1例， 行穿刺引流術(shù)后痊愈；膽漏1例，保守治療后停止。所有痊愈1周后均給予MRCP、CT或T管照影以確定此次梗阻完全解除，并復(fù)查相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)。

2.2血清中LPS、TNF-α和IL-10的表達(dá)變化AOSC患者入院前血清中LPS明顯比健康志愿者高，經(jīng)過手術(shù)及抗感染治療后，LPS含量降至正常水平。同樣，促炎因子TNF-α在AOSC感染高峰期含量明顯高于健康志愿者，治愈后TNF-α水平下降至正常水平。而抗炎因子IL-10在患者入院前水平高于健康志愿者組，而治愈后水平下降，但仍略高于健康志愿者。以上結(jié)果說明，AOSC患者感染高峰期腸道LPS移位至外周血中，激活炎癥信號通路，破壞機(jī)體內(nèi)促炎因子和抗炎因子平衡，見圖1。

表2　AOSC患者與健康志愿者的一般情況比較

圖1ELISA檢測血清中LPS、TNF-α和IL-10的表達(dá)變化

Figure 1The change serum levels of LPS, TNF-α and IL-10

注：ES與HV、CG比較，①P<0.05

2.3PBMC中foxo3a和NF-κB通路的基因和蛋白表達(dá)變化AOSC患者入院時PBMC中foxo3a的mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯低于健康志愿者高，經(jīng)過治療后，foxo3a的mRNA和蛋白表達(dá)降至正常水平。而PBMC的p-foxo3a在AOSC患者入院時表達(dá)劇增，而在健康志愿者和治愈后患者中表達(dá)處于低水平。同時，PBMC中IκB在AOSC患者入院時、治愈后及健康志愿者基因和蛋白的表達(dá)趨勢與foxo3a相似，而p-IκB在AOSC患者入院時、治愈后及健康志愿者基因和蛋白的表達(dá)趨勢則與p-foxo3a相似。另外，PBMC中NF-κB P65在AOSC患者入院時表達(dá)升高，而在治愈后下降至正常水平。以上結(jié)果說明，膿毒血癥發(fā)生時，PBMC中foxo3a參與調(diào)控NF-κB信號通路激活過程，見圖2。

3　討論

在本實驗中，我們檢測了AOSC患者治療前后外周血血清中LPS和炎癥因子的變化，并檢測了PBMC中foxo3a基因和蛋白變化以及NF-κB信號通路激活情況，上述指標(biāo)亦與健康志愿者進(jìn)行對比。結(jié)果提示膿毒血癥的發(fā)生與腸道LPS移位密切相關(guān)，并引起機(jī)體促炎因子和抗炎因子的失衡；同時，foxo3a磷酸化參與了NF-κB信號通路激活并促進(jìn)機(jī)體炎癥因子失活的過程。

foxo3a是轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白家族成員之一，亦是PI3K /Akt信號通路的下游分子[12-14]。炎癥信號磷酸化激活PI3K/Akt后，誘導(dǎo)Akt與核內(nèi)foxo3a結(jié)合并磷酸化。磷酸化foxo3a脫離DNA上結(jié)合位點，并從核內(nèi)排出進(jìn)入胞質(zhì)從而降低其轉(zhuǎn)錄活性，阻斷TLR4信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[15-16]。在病原體激活的抗原遞呈細(xì)胞中，foxo3a能夠抑制TNF-α和IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生[17-18]；在大劑量LPS刺激下，炎癥細(xì)胞內(nèi)foxo3a的表達(dá)急劇下降[15]。我們實驗中觀察到血清中LPS含量增加時，PBMC內(nèi)foxo3a水平下降，而磷酸化水平升高。當(dāng)患者治愈后，LPS恢復(fù)正常水平，PBMC內(nèi)foxo3a含量亦恢復(fù)正常。因此， foxo3a參與了膿毒血癥發(fā)生過程中由腸道LPS移位引發(fā)的炎癥因子紊亂的過程。

腸道LPS及細(xì)菌移位激活PBMC的TLR4信號通路，進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB炎癥信號放大。NF-κB信號通路是LPS刺激炎癥細(xì)胞分泌大量促炎因子如TNF-α的主要機(jī)制之一。研究表明，NF-κB激活需要IκB磷酸化降解，而foxo3a可直接參與到IκB磷酸化過程[19]。我們實驗中也觀察到AOSC患者PBMC的foxo3a磷酸化水平升高后，IκB磷酸化水平提高，同時，細(xì)胞內(nèi)IκB降解，進(jìn)一步提高NF-κB P65的表達(dá)，促進(jìn)TNF-α的分泌并打破機(jī)體炎癥因子平衡。但是，Thompson等人報道大劑量LPS刺激炎癥細(xì)胞后foxo3a可直接激活NF-κB，促進(jìn)NF-κB入核[20]。可見，foxo3a可通過兩種方式激活NF-κB通路，參與膿毒血癥的發(fā)生過程。

圖2qRT-PCR和WB檢測PBMC中foxo3a等相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化

Figure 2Protein and mRNA levels of foxo3a associated molecular between the AOSC patients and healthy volunteers

注：a. foxo3a、IκB和NF-κB P65的mRNA表達(dá)變化；b. foxo3a、p- foxo3a、IκB、p-IκB和NF-κB P65的蛋白表達(dá)變化；ES與HV、CG比較，P<0.05

4　結(jié)論

本實驗顯示，AOSC患者PBMC中IκB與其磷酸化水平與foxo3a及磷酸化水平呈正相關(guān)，也進(jìn)一步闡明了foxo3a在膿毒血癥發(fā)生過程中激活NF-κB的機(jī)制，提示foxo3a可作為早期緩解膿毒血癥的治療靶點之一。

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Changes of forkhead box O3a in the peripheral blood mononuclear of patients with sepsis

ZHOU Chao1, LIU Yan2, ZHANG Wenfeng3,et al

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheSixthPeople’sHospitalofChengdu,Chengdu610051,China; 2.ChongqingKeyLaboratoryofHepatobiliarySurgery,DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China; 3.DepartmentofGastroenterology,TheFifthPeople’sHospitalofChengdu,Chengdu611130,China)

ObjectiveTo detect the level of forkhead box O3a (foxo3a) in the peripheral blood mononuclear (PBMC) of patients with sepsis before and after treatment and further discuss the function of foxo3a in the process of sepsis.MethodsThe PBMC was separated from acute obstructive suppurative cholangitis (AOSC) patients (n=27) on admission (ES), after cured for 1 week (CG) and healthy volunteers (n=12) (HV). The serum levels of lipopolysaccharide (LPS), tumor necrosis factor α (TNF-α) and interleukin 10 (IL-10) were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) methods. The mRNA levels of foxo3a, nuclear fator κB P65 (NF-κB) and inhibitor of NF-κB (IκB) were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR). The protein levels of foxo3a, p-foxo3a, IκB, p-IκB and NF-κB were tested by western blotting (WB). ResultsThe levels of LPS, TNF-α and IL-10 in ES were significantly higher than that in HV and CG. The mRNA levels of foxo3a and IκB in ES were lower than that in HV and CG, while NF-κB P65 in ES was higher than that in HV and CG. The protein levels of foxo3a and IκB in ES were lower than HV and CG, while p-foxo3a, p-IκB and NF-κB P65 were higher than HV and CG. ConclusionThe foxo3a for phosphorylation activation of IκB or directly activation of NF-κB participate the originating process of sepsis and hinting the therapeutic potentialities in the early stage of sepsis.

Sepsis; foxo3a; IκB; Inhibitor of NF-κB

國家自然科學(xué)基金(81401622)

張文鋒，博士，E-mail：zhangwenfeng07@163.com

R631+.4

Adoi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.002

2016-04-01； 編輯： 陳舟貴)