雷　靜，許立興，崔新儀，關(guān)文強(qiáng)，*，李　寧，王艷斌

（1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；2.天津農(nóng)學(xué)院園藝系，天津300384）

高效液相色譜法測(cè)定馬鈴薯中GA3含量

雷靜1，許立興1，崔新儀2，關(guān)文強(qiáng)1，*，李寧2，王艷斌1

（1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；2.天津農(nóng)學(xué)院園藝系，天津300384）

建立了高效液相色譜法測(cè)定馬鈴薯中赤霉素（GA3）含量的方法。采用反相C18色譜柱，以甲醇∶水=3∶7（V∶V）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm。GA3的平均回收率為99.13%，方法檢出限為0.09mg/kg，定量限為0.12mg/kg。該方法操作簡(jiǎn)單，可快速、準(zhǔn)確地分離和測(cè)定馬鈴薯中的GA3含量。

高效液相色譜法；赤霉素；馬鈴薯；檢測(cè)

馬鈴薯塊莖在萌芽前需經(jīng)歷一段時(shí)間的休眠期。在馬鈴薯的休眠期內(nèi)，即使塊莖處于一個(gè)適宜發(fā)芽的條件下也不會(huì)發(fā)芽［1］。馬鈴薯塊莖休眠期的長(zhǎng)短受諸多因素的影響，其中內(nèi)源激素含量對(duì)塊莖的休眠與萌發(fā)起著主導(dǎo)性的作用［2-6］。赤霉素為一大類植物激素，其中使用最廣和研究最多的是GA3，其對(duì)于打破馬鈴薯休眠，促進(jìn)馬鈴薯塊莖萌發(fā)具有重要作用［7］。植物內(nèi)源赤霉素在馬鈴薯中含量甚微，激素類似物干擾組分多，且其對(duì)溫度等條件極為敏感，因而準(zhǔn)確測(cè)定其含量比較困難。

植物內(nèi)源赤霉素的主要測(cè)定方法有免疫分析法、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。其中免疫分析法主要是酶聯(lián)免疫法（ELISA）和放射免疫法（RIA）。ELISA法選擇性高、靈敏度強(qiáng)，并且操作簡(jiǎn)便，但對(duì)于植物激素進(jìn)行定量分析時(shí)，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性差，因此并未得到廣泛使用。RIA法靈敏度高，能夠達(dá)到nmol或pmol的檢測(cè)水平，但測(cè)定時(shí)需125I和3H等放射性同位素。由于放射性同位素的穩(wěn)定性差，并且對(duì)操作者會(huì)造成身體損害，因此RIA法已較少使用。GC法需要被測(cè)物具有較低的極性和氣化溫度，但赤霉素的揮發(fā)性較差，需對(duì)其進(jìn)行一系列復(fù)雜的衍生化處理后才能進(jìn)行GC分析，繁瑣的樣品前處理增加了工作量，不利于大批量檢測(cè)［8］。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確且重復(fù)率高，但樣品凈化過(guò)程較為復(fù)雜，測(cè)定成本相對(duì)較高［9］。HPLC法是比較理想的植物內(nèi)源赤霉素的分析方法，具有較強(qiáng)的專一性，且重復(fù)性好，現(xiàn)已在多種植物激素的分析中得到應(yīng)用［10-12］。

目前馬鈴薯中GA3的提取大多采用80%甲醇提取后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法濃縮，其提取過(guò)程復(fù)雜，且用時(shí)較長(zhǎng)，不利于快速測(cè)定馬鈴薯中GA3的含量［13-14］。HPLC法在測(cè)定內(nèi)源赤霉素時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)分離效果差、峰形不良及拖尾嚴(yán)重等問(wèn)題，因此選擇合適的GA3提取方法和色譜條件尤為重要。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)馬鈴薯塊莖中的GA3含量進(jìn)行測(cè)定，建立靈敏、簡(jiǎn)單、快速的馬鈴薯中GA3含量的測(cè)定方法，以期為進(jìn)一步研究馬鈴薯萌芽過(guò)程中的GA3代謝與調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

1.1.1材料與試劑

馬鈴薯，品種為大西洋，由天津市西青區(qū)辛口鎮(zhèn)第六埠村脫毒馬鈴薯微型種薯繁育基地提供；GA3標(biāo)樣，純度≥98%，由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；甲醇（色譜純），由天津康科德化學(xué)試劑公司生產(chǎn)；1，2-二氯乙烷（色譜純），由天津市津科精細(xì)化工研究所生產(chǎn)；冰乙酸（色譜純），由天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；濃鹽酸（分析純），由天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司生產(chǎn)；試驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

1.1.2儀器與設(shè)備

LC-20A日本島津高效液相色譜儀（LC-20T二元梯度泵，SPD-M20A檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器），SPE C18固相萃取柱（規(guī)格：500 mg，6 mL），TUBE-MILL control試管研磨機(jī)，F(xiàn)D8-4西盟國(guó)際真空冷凍干燥機(jī)，Extrapid柱-盤式手動(dòng)固相萃取儀，BDSThermo C18反相色譜柱。

1.2方法

1.2.1處理方法

馬鈴薯采收后立即運(yùn)送至天津商業(yè)大學(xué)冷庫(kù)，16℃愈傷一周后貯藏于10℃冷庫(kù)中，每45 d取樣進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定時(shí)將馬鈴薯從冷庫(kù)中取出，每6個(gè)馬鈴薯為一組，用削皮器去皮（2mm左右）后切成1 cm3的方塊混勻，取部分樣品真空冷凍干燥72 h，取出后用試管研磨機(jī)粉碎，裝入175mm×130mm×0.12mm規(guī)格的聚乙烯自封袋中密封保存，于-28℃冰箱中備用。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品的制備

精密稱取GA3標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg于5mL棕色容量瓶中，用50%的甲醇溶解后稀釋至刻度，制得濃度為1mg/mL的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃冰箱中避光保存。

1.2.3樣品前處理

馬鈴薯赤霉素的提取參照Pan等［11］的方法并稍作改動(dòng)。稱取真空冷凍干燥后的馬鈴薯粉末2.00 g（相當(dāng)于鮮樣7.50 g），加入10mL丙醇∶水∶濃鹽酸= 2∶1∶0.002（V∶V∶V）的混合溶液，于4℃下振蕩30min，加入10mL二氯乙烷，4℃下振蕩30min后于4℃、12 000 r/min條件下離心15min，取下清液，并向殘?jiān)屑尤?mL二氯乙烷，二次離心，合并下清液為粗提液。將粗提液真空冷凍干燥（-80℃，12 h），所得殘留物加入5mL磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH=3.5）中溶解，經(jīng)預(yù)活化的C18柱（6mL甲醇活化后用6mL 80%甲醇平衡）過(guò)濾，以1mL的80%甲醇進(jìn)行洗脫，并收集全部洗脫液，真空冷凍干燥后用流動(dòng)相溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?mL，溶液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，濾液用于HPLC測(cè)定。

1.2.4色譜條件

BDSThermo C18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水=3∶7（V∶V）；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL；波長(zhǎng)：235 nm；柱溫：30℃。

1.2.5試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1.2.5.1流動(dòng)相的篩選

分別以甲醇∶水（用乙酸調(diào)節(jié)pH=3）=5∶5（V∶V）、4∶6（V∶V）、3∶7（V∶V）以及甲醇∶水=5∶5（V∶V）、4∶6（V∶V）、3∶7（V∶V）為流動(dòng)相，在流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm，柱溫為30℃的色譜條件下對(duì)GA3標(biāo)準(zhǔn)品（10μg/mL）進(jìn)行分離，篩選最佳流動(dòng)相。

1.2.5.2流速的篩選

分別以0.8、1.0、1.5mL/min為流速，在流動(dòng)相為甲醇∶水=3∶7（V∶V），進(jìn)樣量為20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm，柱溫為30℃的色譜條件下對(duì)馬鈴薯樣品中的GA3進(jìn)行分離檢測(cè)，篩選最佳流速。

1.2.5.3波長(zhǎng)的選擇

分別以205、215、225、235 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，在流動(dòng)相為甲醇∶水=3∶7（V∶V），流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20μL，柱溫為30℃的色譜條件下對(duì)馬鈴薯樣品中的GA3進(jìn)行分離檢測(cè)，篩選最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.5.4內(nèi)源激素的定性分析

將1.0mg/mLGA3儲(chǔ)備液稀釋至10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用“1.2.4”中的色譜條件對(duì)GA3標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離檢測(cè)。

1.2.5.5標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

向基質(zhì)中分別加入濃度為3、10、20、30、40μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，以基質(zhì)加標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。將GA3的標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣，根據(jù)3倍信噪比的峰響應(yīng)值，計(jì)算出此方法檢出限；根據(jù)10倍信噪比的峰響應(yīng)值，得出定量限。

1.2.5.6回收率的測(cè)定和實(shí)際樣品分析

按“1.2.3”所述方法進(jìn)行馬鈴薯塊莖中的GA3提取，并按照“1.2.4”中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，在已測(cè)樣品中加入2μg/g及4μg/g的標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定GA3含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。利用“1.2.3”中的提取方法以及“1.2.4”中的色譜條件，分別對(duì)0、45、90 d的馬鈴薯樣品進(jìn)行GA3的提取測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以甲醇∶水（用乙酸調(diào)節(jié)pH=3）=5∶5（V∶V）、4∶6（V∶V）、3∶7（V∶V）為流動(dòng)相，對(duì)GA3標(biāo)準(zhǔn)品（10μg/mL）進(jìn)行測(cè)定，分離效果不理想。由圖1可以看出，選用不同比例的甲醇-水作為流動(dòng)相，對(duì)GA3標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇∶水= 5∶5（V∶V）或者4∶6（V∶V）為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰不能實(shí)現(xiàn)徹底分離（圖1A，圖1B）；而以甲醇∶水=3∶7（V∶V）為流動(dòng)相時(shí)，液相色譜峰尖銳，且分離度高，重復(fù)性好（圖1C）。因此本試驗(yàn)以甲醇∶水=3∶7（V∶V）為流動(dòng)相。

2.2流速的選擇

試驗(yàn)共考察了0.8、1.0、1.5mL/min三個(gè)流速，比較其對(duì)GA3樣品分離效果的影響。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流速為0.8mL/min時(shí)，GA3的保留時(shí)間為7.196min；當(dāng)流速為1.5 mL/min時(shí)，GA3的保留時(shí)間縮短至3.615min，但受到樣品中雜質(zhì)的干擾，出現(xiàn)雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰重疊現(xiàn)象嚴(yán)重的問(wèn)題；當(dāng)流速為1.0mL/min時(shí)，GA3的保留時(shí)間為5.424min，此時(shí)，雜質(zhì)峰和目標(biāo)峰可實(shí)現(xiàn)有效分離。經(jīng)過(guò)篩選最終確定測(cè)定的最佳流速為1mL/min。

2.3波長(zhǎng)的選擇

由圖2可見(jiàn)，在205 nm（圖2A）、215 nm（圖2B）、225 nm（圖2C）檢測(cè)波長(zhǎng)下樣品中雜質(zhì)干擾性較強(qiáng)，不能實(shí)現(xiàn)GA3的有效分離；235 nm（圖2D）下分離度最好，目標(biāo)峰與樣品中的雜峰均分離良好，色譜峰形對(duì)稱。

2.4內(nèi)源激素的定性分析

采用“1.2.4”中的色譜條件對(duì)GA3標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離。結(jié)果表明，GA3的保留時(shí)間為（5.424±0.072）min。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

為了減少基體效應(yīng)的影響，本試驗(yàn)采用試樣基體加標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)減小基質(zhì)的干擾，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)計(jì)算得出GA3的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=3 386.5x+2 619.7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，線性關(guān)系良好，符合分析要求。該方法檢出限為0.09mg/kg，定量限為0.12mg/kg。

2.6回收率的測(cè)定和實(shí)際樣品分析

由表1可見(jiàn)，加標(biāo)后回收率分別為100.50%和97.75%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.54%和3.57%。GA3的平均回收率為99.13%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.56%，符合定量分析的要求，并且數(shù)據(jù)誤差小，說(shuō)明上述樣品提取方法及色譜測(cè)定條件是可行的。

表1　GA3加標(biāo)回收率Table 1　Standard addition recovery rate of GA3

馬鈴薯貯藏期間GA3的變化見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，馬鈴薯中GA3含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，周長(zhǎng)艷［15］對(duì)4種窖藏方式下馬鈴薯中GA3變化情況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，4種窖藏方式下馬鈴薯中GA3含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。馬鈴薯在休眠期時(shí)，GA3含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，當(dāng)含量升高至一定的閾值時(shí)會(huì)引起馬鈴薯塊莖休眠解除［7］。本試驗(yàn)測(cè)定馬鈴薯中GA3含量最高為3.52μg/g，最低為2.04μg/g。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)馬鈴薯中的GA3含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在以甲醇∶水=3∶7（V∶V）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，柱溫為30℃條件下能實(shí)現(xiàn)馬鈴薯中GA3的有效分離，方法檢出限為0.09mg/kg，定量限為0.12mg/kg。該方法能滿足馬鈴薯貯藏過(guò)程中GA3變化的檢測(cè)要求，為進(jìn)一步研究馬鈴薯中的激素代謝奠定了基礎(chǔ)。

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Determ ination of Gibberellin Acid in Potato by High Performance Liquid Chromatography

LEIJing1，XU Li-xing1，CUIXin-yi2，GUANWen-qiang1，*，LINing2，WANG Yan-bin1
（1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，CollegeofBiotechnology and Food Sciences，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；2.Tianjin AgriculturalCollege，DepartmentofHorticulture，Tianjin 300384，China）

A high performance liquid chromatographic（HPLC）method was developed for the determination of gibberellin acid（GA3）in potato.The chromatographic separation was carried out on a reverse phase C18 column using methanol∶water=3∶7（V∶V）.The flow ratewas1.0mL/min，the sample injection volumewas 20μL，and the detection wavelength was235 nm.The average recovery ofGA3was99.13%.The limitofdetectionwas0.09mg/kg，and the limit ofquantitywas0.12mg/kg.It showed a simple and convenientmethod for rapid，accurate separation and determination gibberellin acid in potato.

high performance liquid chromatography；gibberellin acid；potato；determination

S532

A

10.3969/j.issn.1009－6221.2016.04.022

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271949）

雷靜（1991—），女，漢族，碩士在讀，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

關(guān)文強(qiáng)，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

2016-05-26