楊申明，王　波，陳　靖，王振吉，江　岸，張明蘭

（楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000）

乙醇回流法提取甜菜樹總黃酮及其抗氧化性評價

楊申明，王波，陳靖，王振吉*，江岸，張明蘭

（楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000）

以甜菜樹為原料，總黃酮提取率為考察指標，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優(yōu)化乙醇回流法提取總黃酮的最佳工藝條件，并就總黃酮對1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用進行了初步研究。結(jié)果表明，甜菜樹總黃酮最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)85%，料液比1∶40（g/mL），提取溫度80℃，提取時間180 min，在該提取工藝條件下，得到甜菜樹總黃酮平均提取率為1.67%。總黃酮質(zhì)量濃度在0.009 3～0.046 5mg/mL時，對DPPH·、·OH、O2-·的清除率可分別達到88.39%、91.47%、46.29%，說明甜菜樹總黃酮具有較強的體外抗氧化活性。

甜菜樹；總黃酮；提取工藝；抗氧化性

甜菜樹［Yunnanopilia longistaminea（W.Z.Li）C.Y. Wu etD.Z.Li］屬山柚子科（Opiliaceae）甜菜樹屬（Yunnanopilia）植物［1］，主要分布于云南紅河、云南東南部、廣西西南部等地海拔1100～1400m的河谷、溝谷密林中［2-3］。云南民間常采其花序及嫩莖、嫩葉炒食、做湯或腌制食用，其味道鮮甜爽口，風味獨特，是當?shù)胤浅Ｊ軞g迎的一種特色野生蔬菜。有研究表明，甜菜樹中含有17種以上氨基酸，各種氨基酸含量及嫩莖葉中粗纖維、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、總糖、總酸及碳水化合物和VC的含量均比一般蔬菜高［4-5］?？梢?，甜菜樹是一種營養(yǎng)價值較高，開發(fā)前景較大的野生植物資源。

黃酮類化合物具有廣泛的生物活性和重要的藥用價值，而且可作為食品、化妝品的天然添加劑，如甜味劑、抗氧化劑、食用色素等［6-7］，因此對黃酮類化合物的提取及活性研究受到國內(nèi)外的廣泛關注。

目前，對甜菜樹的研究主要集中在營養(yǎng)成分［4］、甜味特殊功能［8］、抗氧化活性研究［9］、核型研究［2］和組織培養(yǎng)技術［5，10］等方面，尚未見有關甜菜樹總黃酮的含量測定、提取工藝及抗氧化性等方面的相關報道。本試驗以甜菜樹為原料，總黃酮提取率為考察指標，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優(yōu)化乙醇回流法提取總黃酮的最佳工藝條件。同時，以VC為對照，研究總黃酮對1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力，旨在為更好地開發(fā)利用甜菜樹資源提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與設備

1.1.1材料與試劑

甜菜樹嫩莖葉，采于云南省雙柏縣；蘆丁標準品（純度≥98%），由中國藥品生物制品檢定所提供；無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、30%過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、焦性沒食子酸、抗壞血酸、1，1-苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）等均為國產(chǎn)分析純，水為實驗室自制超純水。

1.1.2儀器與設備

UV-2100型紫外-可見分光光度計，CP214C型電子天平，HH-2型恒溫水浴鍋，SHZ-ⅢA型循環(huán)水式真空泵，202-00型電熱鼓風干燥箱。

1.2方法

1.2.1處理方法

將新鮮的甜菜樹嫩莖葉依次用自來水、蒸餾水洗凈風干后，置于55℃烘箱中烘干，粉碎后過40目篩，得甜菜樹干粉，備用。

1.2.2甜菜樹總黃酮含量的測定

用蘆丁作為標準品，采用Al（NO3）3-NaNO2分光光度法測定甜菜樹中總黃酮的含量［11］。所得線性回歸方程A=11.231C-0.005 9（R2=0.999 88）。結(jié)果表明，吸光度與蘆丁質(zhì)量濃度具有良好的線性關系，因此，可用于甜菜樹總黃酮含量的測定?？傸S酮提取率計算公式為：

式中：C為根據(jù)回歸方程計算出的總黃酮濃度（mg/mL）；V為定容體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；M為甜菜樹樣品質(zhì)量（g）。

1.2.3甜菜樹總黃酮提取工藝流程

甜菜樹嫩莖葉→粉碎→過40目篩→稱量→乙醇回流提取→抽濾→定容→測量

1.2.4甜菜樹總黃酮提取工藝的單因素試驗

在預試驗的基礎上，分別考察以下各因素對甜菜樹總黃酮提取率的影響：①在提取溫度80℃，提取時間120min，料液比1∶40（g/mL）條件下，選擇乙醇體積分數(shù)分別為45%、55%、65%、75%、85%進行比較；②在乙醇體積分數(shù)75%，提取時間120min，提取溫度80℃條件下，選擇料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、

1∶50、1∶60（g/mL）進行比較；③在乙醇體積分數(shù)75%，料液比1∶40（g/mL），提取時間120min條件下，選擇提取溫度分別為50、60、70、80、90℃進行比較；④在乙醇體積分數(shù)75%，料液比1∶40（g/mL），提取溫度80℃條件下，選擇提取時間分別為60、90、120、150、

180min進行比較。確定各因素對甜菜樹總黃酮提取率的影響作用，每組試驗重復3次。

1.2.5甜菜樹總黃酮提取工藝參數(shù)優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度和提取時間為主要影響因素，以甜菜樹總黃酮提取率為考察指標，通過L9（34）正交試驗優(yōu)化乙醇回流法提取甜菜樹總黃酮的最佳工藝條件。正交試驗因素和水平見表1。

1.2.6甜菜樹總黃酮抗氧化活性測定

1.2.6.1對DPPH·的清除作用

［12-13］的方法，稍作改動。向2.5mL2×10-4mol/L的DPPH溶液中加入質(zhì)量濃度分別為0.0093、0.0186、0.0279、0.0372、0.0465mg/mL的甜菜樹黃酮溶液1.0mL，反應30min后于波長517nm處測定吸光度，記為Ai；相同方法測定2.5mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液與1.0mL無水乙醇混合溶液的吸光度，記為Ac；并測定2.5mL無水乙醇與質(zhì)量濃度分別為0.009 3、0.018 6、0.027 9、0.037 2、0.046 5mg/mL的甜菜樹黃酮溶液1.0mL混合后的吸光度，記為Ab。同時，以VC作陽性對照，甜菜樹總黃酮對DPPH·清除率計算公式為：

表1　L9（34）正交試驗因素水平表Table 1　Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.2.6.2對·OH的清除作用

［14-15］的方法，稍作改動。在5支25mL比色管中加入9mmol/L的硫酸亞鐵和9mmol/L的水楊酸-乙醇溶液各2.0mL，分別加入質(zhì)量濃度為0.009 3、0.018 6、0.027 9、0.037 2、0.046 5mg/mL的甜菜樹黃酮溶液1.0 mL，再加8.8 mmol/L的過氧化氫溶液2.0mL，用蒸餾水定容至10mL，置于37℃水浴中反應30min后，于波長510 nm處測吸光度，記為AX；以不加過氧化氫的甜菜樹黃酮提取液的吸光度記為AX0；以不加黃酮的對照吸光度記為A0；同時，以VC作陽性對照。甜菜樹總黃酮對·OH的清除率計算公式為：

1.2.6.3對O2-·的清除作用

參考劉長建等［16］的方法，稍作改動。在5支25mL比色管中均加入 50 mmol/L的 Tris-HCI緩沖液（pH=8.2）4.5mL，超純水4.2mL，再分別加入質(zhì)量濃度為0.009 3、0.018 6、0.027 9、0.037 2、，0.046 5 mg/mL的甜菜樹黃酮溶液1.0mL，混勻，于25℃水浴中恒溫反應20min后，加入0.3mL已預熱（25℃）的3mol/L的鄰苯三酚（以0.3mL濃度為10mmol/L的鹽酸代替作參比），迅速混勻，于波長325 nm處每隔30 s測一次吸光度，到5min為止，計算吸光度隨時間的變化率FX；取一支25mL比色管不加甜菜樹黃酮溶液，按上述步驟加入試劑后，測定吸光度，計算吸光度隨時間的變化率F0。同時，以VC作陽性對照，甜菜樹總黃酮對O2-·的清除率計算公式為：

1.2.7數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel2003軟件作圖和分析處理。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1乙醇體積分數(shù)對甜菜樹總黃酮提取效果的影響

由圖1可以看出，乙醇體積分數(shù)為45%～75%時，甜菜樹總黃酮提取率隨乙醇體積分數(shù)的增大而逐漸升高；當乙醇體積分數(shù)為75%時，提取率達到最高，為1.62%；之后隨乙醇體積分數(shù)的增大，甜菜樹總黃酮提取率下降。這可能是由于乙醇體積分數(shù)太大，甜菜樹中的色素、脂溶性物質(zhì)等大量溶出，從而影響甜菜樹總黃酮的溶出。因此，確定適宜的乙醇體積分數(shù)為75%，選擇乙醇體積分數(shù)為65%、75%和85%進行正交試驗。

2.1.2料液比對甜菜樹總黃酮提取效果的影響

由圖2可以看出，料液比1∶20～1∶40（g/mL）時，甜菜樹總黃酮提取率隨提取溶劑添加量的增大而增大；當料液比為1∶40（g/mL）時，提取率達到最高，為1.61%；之后隨提取溶劑添加量的增大，甜菜樹總黃酮提取率逐步下降。這種趨勢的形成可能是由于隨著溶劑量的增加，有利于甜菜樹中總黃酮的溶出；而溶劑用量過大時，升溫速度變慢，不利于甜菜樹中總黃酮的溶出。因此，確定適宜的料液比為1∶40（g/mL），選擇料液比為1∶30、1∶40和1∶50（g/mL）進行正交試驗。

2.1.3提取溫度對甜菜樹總黃酮提取效果的影響

由圖3可以看出，提取溫度為50～80℃時，甜菜樹總黃酮提取率隨溫度的升高而逐漸增大；當提取溫度為80℃時，提取率達到最高，為1.64%；之后隨提取溫度的升高，甜菜樹總黃酮提取率下降。其原因可能是提取溫度過高，使乙醇濃度降低，減少甜菜樹中黃酮類物質(zhì)的溶出，同時提取溫度過高，也會破壞甜菜樹的黃酮結(jié)構(gòu)，導致提取率下降。因此，確定適宜的提取溫度為80℃，選擇提取溫度為70、80和90℃進行正交試驗。

2.1.4提取時間對甜菜樹總黃酮提取效果的影響

由圖4可以看出，提取時間為60～150min時，甜菜樹總黃酮提取率隨時間的延長而升高；當提取時間為150min時，提取率最大，為1.67%；之后繼續(xù)延長提取時間，甜菜樹總黃酮提取率下降。這可能是回流提取時間過短，甜菜樹中總黃酮不能充分溶出，提取率不高；但回流提取時間過長，甜菜樹總黃酮在長時間的高溫下受熱分解，導致提取率下降。因此，確定適宜的提取時間為150min，選擇提取時間為120、150和180min進行正交試驗。

2.2正交試驗結(jié)果

由表2可知，影響甜菜樹總黃酮提取率的主次順序為：C＞B＞A＞D，即提取溫度＞料液比＞乙醇體積分數(shù)＞提取時間。甜菜樹總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為：A3B2C2D3，即乙醇體積分數(shù)85%，料液比1∶40（g/mL），提取溫度80℃，提取時間180min。由于試驗中沒有出現(xiàn)最優(yōu)組合，故在該條件下進行驗證性試驗，重復5次，測得甜菜樹總黃酮平均提取率為1.67%，相對標準偏差（RSD）為1.03%，表明該方法重復性良好，試驗數(shù)據(jù)可靠，適合于甜菜樹中總黃酮的提取。

表2　正交試驗結(jié)果Table 2　Results of the orthogonal experiment

2.3甜菜樹總黃酮抗氧化性分析

2.3.1甜菜樹總黃酮清除DPPH·的能力評價

DPPH·是一種穩(wěn)定自由基，當待測溶液中含有抗氧化物時，抗氧化物能提供一個電子與DPPH·配對，使DPPH·特征紫色逐漸消失，可根據(jù)DPPH·的褪色程度來間接評價抗氧化物的抗氧化能力［17］。由圖5可以看出，隨著甜菜樹總黃酮質(zhì)量濃度的增加，其清除DPPH·的能力逐漸增強，即清除率與總黃酮質(zhì)量濃度間存在一定的量效關系。在甜菜樹總黃酮質(zhì)量濃度0.009 3～0.018 6mg/mL范圍內(nèi)，對DPPH·的清除率大于VC；在總黃酮質(zhì)量濃度0.018 6～0.046 5mg/mL范圍內(nèi)，甜菜樹總黃酮清除DPPH·的能力稍弱于VC，但其依然表現(xiàn)出較強的清除DPPH·的能力。

2.3.2甜菜樹總黃酮清除·OH的能力評價

·OH是一種重要的活性氧，能與細胞中的分子發(fā)生反應對機體造成損傷，清除·OH的能力是評價抗氧化物的重要指標［18］。由圖6可以看出，隨著甜菜樹總黃酮質(zhì)量濃度的增加，清除·OH的能力逐漸增強，即清除率與黃酮質(zhì)量濃度間也存在一定的量效關系。甜菜樹總黃酮質(zhì)量濃度為0.009 3mg/mL時，對·OH的清除率大于VC；總黃酮質(zhì)量濃度為0.0186～0.046 5mg/mL時，對·OH的清除率與VC很接近，說明甜菜樹總黃酮具有較強的清除·OH的能力。

2.3.3甜菜樹總黃酮清除O2-·的能力評價

O2-·可通過鄰苯三酚在弱堿介質(zhì)中自氧化產(chǎn)生，并生成有色中間產(chǎn)物，黃酮類化合物能夠抑制O2-·的形成，可通過檢測有色中間產(chǎn)物的生成量，測定黃酮對O2-·的清除能力。黃酮類化合物能夠與O2-·結(jié)合形成穩(wěn)態(tài)自由基，終止自由基鏈反應，而發(fā)揮抗氧化作用［19-20］。由圖7可以看出，甜菜樹總黃酮質(zhì)量濃度為0.009 3～0.027 9mg/mL時，隨著甜菜樹總黃酮質(zhì)量濃度的增加，其清除O2-·的能力增強；當總黃酮質(zhì)量濃度為0.027 9～0.046 5mg/mL時，隨著甜菜樹總黃酮質(zhì)量濃度的增加，其清除O2-·的能力減弱。當總黃酮質(zhì)量濃度為0.009 3～0.037 2mg/mL時，對O2-·的清除率明顯大于VC，表明甜菜樹總黃酮具有一定的清除O2-·的能力。

3　結(jié)論與討論

（1）采用乙醇回流法提取甜菜樹總黃酮，經(jīng)過正交試驗優(yōu)化后得到的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)85%，料液比1∶40（g/mL），提取溫度80℃，提取時間180min。在此最佳工藝條件下進行驗證性試驗，得到甜菜樹總黃酮的平均提取率為1.67%，相對標準偏差為1.03%。說明該提取工藝準確度高、重復性好，可用于甜菜樹總黃酮的提取。

（2）本研究利用比色法，分別從清除DPPH·、·OH和O2-·三個方面測定了甜菜樹總黃酮的抗氧化活性。結(jié)果表明，甜菜樹總黃酮對DPPH·、·OH和O2-·有較強的清除能力，在總黃酮質(zhì)量濃度0.009 3～0.046 5mg/mL范圍內(nèi)，對DPPH·、·OH的清除能力隨甜菜樹總黃酮質(zhì)量濃度的增加而增強，并有量效關系；在總黃酮質(zhì)量濃度0.009 3～0.027 9mg/mL范圍內(nèi)，隨甜菜樹總黃酮質(zhì)量濃度的增加，清除O2-·能力增強；總黃酮質(zhì)量濃度在0.009 3～0.046 5mg/mL時，對DPPH·、·OH、O2-·的清除率可分別達到88.39%、91.47%、46.29%，說明甜菜樹總黃酮具有較強的體外抗氧化活性。

（3）甜菜樹總黃酮是一種良好的天然抗氧化劑，具有廣泛的開發(fā)前景和利用價值。相關研究結(jié)果對甜菜樹總黃酮的提取及抗氧化活性成分的開發(fā)和利用具有重要意義。由于本研究僅對甜菜樹總黃酮進行體外抗氧化活性評價，因此，今后有必要在此基礎上對甜菜樹總黃酮的體內(nèi)抗氧化活性進行研究，為開發(fā)安全性高的天然抗氧化劑和保健產(chǎn)品提供科學依據(jù)和參考。

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Extraction of Total Flavonoids from Yunnanopilia longistam inea by EthanolReflux M ethod and Evaluation of Its Antioxidant Activity

YANG Shen-ming，WANG Bo，CHEN Jing，WANG Zhen-ji*，JIANG An，ZHANGMing-lan
（DepartmentofChemistry and Life Science，Chuxiong NormalUniversity，Chuxiong675000，China）

In order to increase the extraction rate of total flavonoids，the ethanol reflux extraction conditions of total flavonoids from Yunnanopilia longistaminea was optimized by L9（34）orthogonal test based on the single-factor tests. Meanwhile，the antioxidant effects of obtained total flavonoids on 1，1-phenyl-2-base of the radical（DPPH·），hydroxyl radical（·OH）and superoxide anion radical（O2-·）were studied.The results showed that，the optimum extraction parameters were:the volume fraction of ethanol as extractantwas 85%，ratio of solid to liquid was 1∶40（g/mL），extraction temperature was 80℃，and extraction time was 180 min.Under the extraction conditions，the average extraction rate of total flavonoids from Yunnanopilia longistaminea was 1.67%.When the total flavonoids concentration was in the range of 0.009 3 to 0.046 5mg/mL，the clearance rate of total flavonoids on DPPH·，·OH and O2-·were 88.39%，91.47%and 46.29%，respectively，implying suchmaterial had a strong antioxidantactivity in vitro.

Yunnanopilia longistaminea；total flavonoids；extraction process；antioxidant properties

TQ914.1

A

10.3969/j.issn.1009-6221.2016.04.011

國家自然科學基金青年項目（31300370）；云南省高校科技創(chuàng)新團隊建設項目（IRTSTYN）；云南省省級重點學科建設項目（05YJJSXK03）；楚雄師范學院教改項目（1510）

楊申明（1976—），男，漢族，本科，實驗師，主要從事天然有機產(chǎn)物化學研究及教學工作。

王振吉，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物化學。

2016-03-02