趙孟孟，張二芹，馮松林，郭依嘉，阮海宇，王文佳，邢星，張桂紅*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州　510642；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州　450002；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院，鄭州　450046；4.廣西欽州保稅港區(qū)出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西欽州　535008）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP9蛋白單克隆抗體制備與鑒定

趙孟孟1,2，張二芹2，馮松林1，郭依嘉2，阮海宇2，王文佳3，邢星4，張桂紅1*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院，鄭州450046；4.廣西欽州保稅港區(qū)出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西欽州535008）

根據(jù)NSP9非結(jié)構(gòu)蛋白參數(shù)選取相應(yīng)30 bp DNA片段，片段串聯(lián)后人工合成并連接pET-28a（+）載體，大腸桿菌BL21中表達(dá)得到可溶蛋白，鎳柱親和層析純化后免疫Balb/c小鼠，取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合。細(xì)胞融合后利用間接ELISA法雜交瘤細(xì)胞陽性克隆篩選，2次亞克隆后共獲得3株抗PRRSV NSP9單克隆抗體，命名為3B17、3J13、3F19。這3株單抗可與大腸桿菌表達(dá)的蛋白產(chǎn)物和PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)。在PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞中，NSP9蛋白表達(dá)水平接毒后不斷升高，48 h達(dá)最高，為深入研究NSP9功能奠定基礎(chǔ)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；NSP9；單克隆抗體；雜交瘤

網(wǎng)絡(luò)出版時間2016-7-20 16:39:49［URL］http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160720.1639.012.html

趙孟孟,張二芹,馮松林,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP9蛋白單克隆抗體制備與鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(7): 63-69.

Zhao Mengmeng,Zhang Erqin,Feng Songlin,et al.Preparation and identification of the monoclonal antibodies against NSP9 protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016, 47(7):63-69.(in Chinese with English abstract)

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要臨床癥狀是妊娠母豬繁殖障礙，表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱胎，各齡豬尤其是小豬出現(xiàn)呼吸道疾病，哺乳仔豬高死亡率、免疫抑制和持續(xù)性感染等，是目前嚴(yán)重危害我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)重要傳染病之一［1-3］。PRRS首先在北美洲和歐洲發(fā)現(xiàn)，2006年我國首次出現(xiàn)高致病性PRRSV，致病能力顯著增強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，引起高度關(guān)注［4］。PRRSV是動脈炎病毒屬，為單股、正鏈、不分節(jié)段RNA病毒，具有10個開放閱讀框，ORF1a和ORF1b主要編碼病毒復(fù)制酶，約占病毒基因組80%。ORF2～5編碼病毒囊膜糖蛋白，ORF6編碼基質(zhì)蛋白（M），我國和美國主要流行美洲型。

PRRSV的NSP9基因主要編碼RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）主要以基因組正鏈RNA為模板合成互補(bǔ)負(fù)鏈RNA，再以合成負(fù)鏈RNA為模板合成基因組正鏈RNA。美洲型PRRSV的NSP9全長1 929 bp，編碼643個氨基酸，針對NSP9抗體僅病毒復(fù)制過程出現(xiàn)。因此，針對NSP9抗體檢測可鑒別滅活苗與弱毒苗免疫。NSP9和病毒毒力相關(guān)［5］，干擾NSP9會降低病毒滴度［6］，且NSP9高度保守［7］，因此制備NSP9單克隆抗體對檢測PRRSV具有重要意義。

在單克隆抗體制備過程中，一般選擇包括目的蛋白全序列和最主要抗原位點(diǎn)域，因?yàn)檫@部分抗原性最強(qiáng)，能產(chǎn)生最強(qiáng)體液免疫反應(yīng)。親水性和抗原可溶性密切相關(guān)，不可溶蛋白使后期純化操作繁瑣，本試驗(yàn)通過序列分析選取親水性和抗原性理想的區(qū)域表達(dá)蛋白，不喪失抗原性，提高可溶性，是一種應(yīng)對可溶性低蛋白策略。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動物、細(xì)胞及培養(yǎng)基

SPF級BALB/c小鼠及飼料，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心；SP2/0、Marc-145細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供；胎牛血清、DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液和Opti-MEM培養(yǎng)液、HAT和HT選擇培養(yǎng)基均購自Gibco公司。

1.2主要試劑和設(shè)備

聚乙二醇（PEG）（WM1550）、二甲基亞砜（DMSO）、lipofectamine 2000與鄰苯二胺（OPD）均購自Invitrogen公司；Protein Marker購自Fermentas公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗、FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗、小鼠抗體亞類鑒定試劑盒購自Sigma公司；GAPDH抗體購自北京博奧森生物科技有限公司，protein G柱購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow購自GE Healthcare公司；離心機(jī)購自Sigma公司；96孔板酶標(biāo)儀購自TECAN公司；豬陽性血清和陰性血清由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.3抗原設(shè)計

根據(jù)NSP9序列（GenBank登錄號EU624117）設(shè)計抗原肽段，主要通過DNAstar軟件預(yù)測抗原性與親水性，挑選抗原性強(qiáng)、親水性強(qiáng)的區(qū)域作為目標(biāo)抗原肽段。

1.4抗原制備

將選取12個10aaDNA片段串聯(lián)，按照初始在NSP9基因中位置組合并人工合成，連接到pET-28a（+）載體。將鑒定后陽性重組質(zhì)粒pET-28a-NSP9重新轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），均勻涂布于含Amp的LB平板，培養(yǎng)過夜。同時設(shè)置pET-28a空載體空白對照。挑選生長良好陽性菌落，接種至LB/Amp液體培養(yǎng)基中，37℃快速200 r·min-1震蕩培養(yǎng)4～6 h至OD600約為0.8～1.0時，留取部分菌液保種。加入終濃度分別為1 mmol·L-1的IPTG，置于37℃6 h。將菌體超聲破碎產(chǎn)物4℃12 000 r· min-1離心20 min，收集上清，0.45 μm微孔濾膜過濾后置4℃保存；蛋白純化參照GE Healthcare公司Ni Sepharose 6 Fast Flow使用說明書。

1.5抗PRRSV NSP9單抗雜交瘤細(xì)胞株篩選

將純化PRRSV NSP9蛋白，常規(guī)法免疫、細(xì)胞融合制備單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，步驟參照文獻(xiàn)［8-9］。

1.6NSP9單抗特性鑒定

1.6.1單克隆抗體亞類測定

采用Sigma公司抗體亞類試劑盒測定單抗抗體亞型。按照操作說明包被、封閉，腹水1:500倍稀釋后作為一抗100 μL·孔-1加入ELISA板，每種腹水加8個孔，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，將HRP標(biāo)記的羊抗鼠各抗體亞類的二抗稀釋1：500倍，按照抗鼠IgA鏈、IgM鏈、IgG1鏈、IgG2a鏈、IgG2b鏈、IgG3鏈的順序加入每種腹水對應(yīng)8個孔中，100 μL·孔-1，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，加入新鮮配制的顯色液，50 μL·孔-1，37℃作用15～30 min，加入終止液，50 μL·孔-1，酶標(biāo)儀上讀取OD490吸光值，判斷抗體亞類。

1.6.2雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水中單克隆抗體效價測定

以確定表達(dá)重組蛋白最佳包被濃度包被ELISA板，4℃放置過夜，5%脫脂乳37℃包被2 h，PBST洗滌3次，將雜交瘤細(xì)胞腹水從1：100和1：1 000開始倍比稀釋后，以100 μL·孔-1加入ELISA板作為一抗37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，加入1：3 000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μL·孔-1，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，加入新鮮配制顯色液，50 μL·孔-1，37℃作用15～30 min，加入終止液，50 μL·孔-1，酶標(biāo)儀上讀取OD490吸光值。以P/N＞2時細(xì)胞培養(yǎng)腹水的最大稀釋倍數(shù)作為其抗體效價。

1.6.3IFA檢測單抗特異性

將PRRSV病毒FS株病毒感染Marc-145細(xì)胞，48 h后出現(xiàn)細(xì)胞病變時，將腹水1：200倍稀釋后作為一抗，通過IFA試驗(yàn)驗(yàn)證各株單抗的特異性，同時設(shè)置豬血清陽性對照和各陰性血清對照，參照文獻(xiàn)［10］。

1.6.4Western Blot驗(yàn)證單抗特異性

檢測單抗反應(yīng)性以原核表達(dá)經(jīng)過超聲裂解產(chǎn)物為模板，以1：400稀釋過腹水為一抗，進(jìn)行Western Blot鑒定。將收集樣品用PBS清洗3次，RIPA裂解液裂解，之后加入25 μL上樣緩沖液，沸水中加熱10 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清SDS-PAGE蛋白膠電泳，Western Blot驗(yàn)證。步驟如下：電泳結(jié)束后，取出凝膠。取與SDS-PAGE凝膠大小一致硝酸纖維素膜及6張3 mm濾紙。濾紙、硝酸纖維素膜在預(yù)冷轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15 min。按下列結(jié)構(gòu)層次制備聚丙烯酰胺凝膠膜：三層濾紙-硝酸纖維素膜-凝膠-三層濾紙順序依次由下向上疊放，疊放整齊，避免上下濾紙接觸。以15 V電壓轉(zhuǎn)移30 min，轉(zhuǎn)移后取下硝酸纖維素膜，作好標(biāo)記進(jìn)行如下操作，封閉：將硝酸纖維素膜條放入大小適當(dāng)玻璃平皿中，5%脫脂奶粉/TBST緩沖液37℃50 r·min-1作用2 h；洗膜：棄去封閉液，TBST緩沖液在37℃條件下56 r·min-1洗膜3次，每次5 min；孵一抗：棄去TBST緩沖液，加入一抗（1：1 000稀釋于TBST緩沖液），37℃50 r·min-1作用2 h；洗膜：棄去一抗，TBST緩沖液37℃56 r·min-1洗膜3次，每次5 min；孵二抗：棄去TBST緩沖液，加入TBST緩沖液按1：8 000稀釋IRDye 800CW Goat anti-mouse IgG（H+L），37℃50 r·min-1作用1 h；洗膜：棄去酶標(biāo)二抗，TBST緩沖液37℃56 r·min-1洗膜3次，每次5 min；掃膜：將硝酸纖維素膜放入雙色激光分析系統(tǒng)Odyssey（LI-COR公司生產(chǎn)），待顯色設(shè)置適當(dāng)參數(shù)后，拍照記錄。

1.6.5在蛋白水平上測定細(xì)胞沉淀中NSP9表達(dá)量

6孔板上待Marc-145細(xì)胞長滿90%，以MOI=1劑量接種PRRSV XH-GD毒株，選取不同時間點(diǎn)，以加入維持液時刻為0點(diǎn)，時間點(diǎn)選為0、4、8、12、24、36、48、60和72 h，分別在該時間點(diǎn)收集細(xì)胞單層。收集樣品PBS清洗3次，RIPA裂解液裂解，加入25 μL上樣緩沖液，沸水中加熱10 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清SDS-PAGE蛋白膠電泳，Western Blot驗(yàn)證。操作步驟參照1.6.4。

2　結(jié)果與分析

2.1抗原設(shè)計結(jié)果

根據(jù)序列分析結(jié)果可知NSP9片段內(nèi)多個抗原位點(diǎn)較強(qiáng)，親水性較好區(qū)域（見圖1），結(jié)合抗原性和親水性等綜合指標(biāo)篩選出12個目的靶序列，如表1所示。

2.2抗原表達(dá)純化

將以上DNA片段串聯(lián)后人工合成，連接表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)方法得到目的蛋白，大小約26 ku，NI-NTA純化后得到26 ku目的條帶，如圖2所示，目的蛋白較好表達(dá)和純化。

圖1NSP9基因抗原位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果Fig.1Results of the predicted antigen site of NSP9 gene

表1　NSP9基因靶序列結(jié)果Table 1Target sequence of NSP9 gene

2.3效價測定與亞型鑒定

通過單抗標(biāo)準(zhǔn)制備方法得到3株單克隆抗體，3株單抗分別命名為3B17-1、3J13-1、3F19-1。B17-1效價為1：400 000，3J13-1效價為1：200 000，3F19-1效價為1：125 000。經(jīng)單抗亞型試劑盒驗(yàn)證，3B17株單抗的亞型為IgG1、3J13、3F19亞型為IgG2b。細(xì)胞接毒后開始間接免疫熒光試驗(yàn)，制備單抗為一抗，結(jié)果表明這3株單抗均有特異性綠色熒光，豬陽性血清和陰性血清、鼠陰性血清對照成立，結(jié)果見圖3。

圖2PRRSV NSP9蛋白純化結(jié)果Fig.2Purification of NSP9 protein of PRRSV

2.4IFA 驗(yàn)證

細(xì)胞接毒后開始間接免疫熒光試驗(yàn)，制備單抗為一抗，結(jié)果表明這3株單抗均有特異性綠色熒光，豬陽性血清和陰性血清、鼠陰性血清對照成立，結(jié)果見圖3。

2.5Western Blot分析

結(jié)果見圖4。

由圖4可知，在與原核表達(dá)PRRSV的NSP9蛋白反應(yīng)過程中，3株單抗的Western Blot結(jié)果表明這3株單抗均可見特異條帶。

2.6NSP9基因蛋白水平變化

圖3　3B17、3J13、3F19間接免疫熒光結(jié)果Fig.3IFA result of 3B1，3J13，3F19

圖4　3株單抗Western Blot結(jié)果Fig.4Western Blots of 3 Mcab

細(xì)胞培養(yǎng)沉淀裂解，裂解后加入緩沖液，加熱處理后SDS-PAGE蛋白膠電泳，Western Blot驗(yàn)證，一抗為NSP9單抗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從12 h開始，NSP9表達(dá)量逐步增高，48 h逐步穩(wěn)定，與熒光定量結(jié)果一致。

圖5　不同時間點(diǎn)NSP9基因蛋白水平表達(dá)量Fig.5Different time points and their expression level of NSP9 in cell sedimentum

3　討論與結(jié)論

PRRSV對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重，目前尚無有效藥物和疫苗。Fang等研究表明，NSP9基因編碼RNA依賴的RNA聚合酶，對病毒復(fù)制起關(guān)鍵作用，參與病毒復(fù)制、高度保守，僅病毒復(fù)制時出現(xiàn)，具有診斷意義，NSP9單抗制備為有效診斷PRRSV奠定基礎(chǔ)［11］。目前已有針對NSP9抑制劑或藥物可抑制PRRSV［12-15］，NSP9可誘導(dǎo)IFN-γ反應(yīng)［16］，也可誘導(dǎo)IL-10［17］，NSP9兩個氨基酸與病毒利巴韋林敏感性密切相關(guān)［18］。

近年，單克隆抗體在研究病毒蛋白結(jié)構(gòu)與功能方面日益發(fā)揮重要作用，單克隆抗體背景低，特異性強(qiáng)。目前已有報道PRRSV單抗主要有針對N蛋白［19］、M蛋白［20］、GP5蛋白［21］，ORF3蛋白［22］，ORF2蛋白［23］，Nsp2蛋白［24］，針對非結(jié)構(gòu)蛋白的單抗相對較少，NSP9單抗制備補(bǔ)充PRRSV各蛋白單抗構(gòu)成，成為研究NSP9功能工具之一。本試驗(yàn)制備單抗采用表達(dá)全蛋白，鎳柱純化得到可溶蛋白。但NSP9相比其他蛋白疏水氨基酸較多，分子質(zhì)量大妨礙制備可溶蛋白，本試驗(yàn)初步選用Nsp9全基因，但表達(dá)過程中，表達(dá)蛋白主要以包涵體形式存在，后期復(fù)性和純化難度極大。選取串聯(lián)主要抗原表位，縮小目的蛋白大小，增加蛋白可溶性，成功表達(dá)，在不喪失主要抗原表位情況下制備可溶蛋白，為表達(dá)可溶蛋白提供新思路。

NSP9基因在PRRSV基因組上高度保守，所選抗原表位在經(jīng)典株與變異株之間高度保守，保證制備單抗可識別不同亞型毒株，為進(jìn)一步建立ELISA檢測方法和檢測試紙奠定基礎(chǔ)。本研究成功表達(dá)NSP9蛋白，Western Blot方法表明該蛋白具有良好特異性與免疫原性。

單抗制備是復(fù)雜過程，從蛋白純化到融合比例，篩選方法要做好各種對照，去除假陽性影響，但未能鑒定這3株單抗的具體線性表位，需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

利用單抗驗(yàn)證病毒感染細(xì)胞過程中NSP9表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)NSP9在蛋白水平上逐步升高，48 h達(dá)最高，與該基因mRNA水平保持一致。本試驗(yàn)制備單抗效價較高，得到3株單抗可與原核表達(dá)NSP9蛋白相互作用，識別病毒感染細(xì)胞。三株單抗效價高、特異性好，不與偽狂犬病毒、豬流感病毒、豬瘟病毒發(fā)生反應(yīng)，親和力好，可為后期試驗(yàn)進(jìn)一步研制診斷試劑以及基因聚合酶活性及病毒毒力研究奠定基礎(chǔ)。

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Preparation and identification of the monoclonal antibodies against NSP9 protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus

ZHAO Mengmeng1,2,ZHANG Erqin2,FENG Songlin1,GUO Yijia2,RUAN Haiyu2,WANG Wenjia3, XING Xing4,ZHANG Guihong1
(1.Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong Province,National Engineering Research Center for Breeing Swine Industry,School of Veterinary,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.School of Animal Science and Veterinary Medicin,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 3.School of Pharmaceutical Engineering,Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046,China;4.Guangxi Qinzhou Free Trade Port Area Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Qinzhou Guangxi 535008,China)

In order to generate monoclonal antibody against the NSP9 protein of PRRSV,the NSP9 protein was expressed inEscherichia coliand subsequently used as an antigen to immunizemice and for the initial screening of hybridomas prepared from the mice for their ability to produce anti NSP9 protein Mabs via an indirect ELISA.Three positive hybridomas were identified in this manner and verified based on the ability of their released Mab to react specifically with both naturally and artificially expressed NSP9 protein in Western Blot.The three hybridomas named 3B17,3J13,3F19 were subcloned three times before being introduced intraperitoneally into mice.The three hybridomas could occur with PRRSV-infected Marc-145 cells by indirect immunofluorescence verification.During the process of viral infection,the protein levels ofNSP9 gene keep rising,it get the highest at 48 h.These antibodies would be of great assistance to elucidate the function ofNsp9 gene.

PRRSV;NSP9;monoclonal antibodies;hybridoma

S852.6

A

1005-9369（2016）07-0063-07

2016-04-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272564）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203039）；國家生豬現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-36）

趙孟孟（1986-），男，博士，研究方向?yàn)樨i繁殖與呼吸綜合征病毒的致病機(jī)理。E-mail:zhaomengmeng502@163.com

張桂紅，教授，博士，研究方向?yàn)閯游飩魅静?。E-mail:guihongzh@scau.edu.cn