張　劍　王玉清　宿星杰　劉宏偉

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江　佳木斯　154002)

?

白細胞介素-17在卵清蛋白誘導的大鼠過敏性結膜炎發(fā)病中的作用

張劍王玉清宿星杰劉宏偉

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江佳木斯154002)

目的探討白細胞介素(IL)-17在雞卵清蛋白(OVA)誘導的大鼠過敏性結膜炎(AC)發(fā)病中的可能作用。方法30只Brown Norway大鼠隨機分對照組(NC組)和AC組。應用OVA誘導大鼠AC模型。觀察兩組眼瞼和結膜充血、水腫、分泌物情況并做評分。對兩組眼球和上下眼瞼進行病理學分析,計數(shù)穹隆部眼結膜嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)。應用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定大鼠血清和脾細胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、干擾素(IFN)-γ水平。結果AC組體征評分明顯高于NC組(P<0.01)。AC組眼結膜穹隆部嗜酸性粒細胞計數(shù)較NC組明顯升高(P<0.01)。AC組血清和脾細胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10水平較NC組明顯升高(均P<0.01)，IFN-γ水平明顯降低(P<0.01)。結論IL-17 增高、Th1/Th2失衡是大鼠AC發(fā)病的重要原因，降低IL-17、恢復Th1/Th2失衡可能成為AC治療的一條新途徑。

過敏性結膜炎；T細胞；白細胞介素-17

有報道全世界患過敏性結膜炎(AC)者達20%，我國患病率約10%～16%〔1,2〕。研究表明AC是眼部結膜對外源特異性抗原發(fā)生的免疫應答，包括IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應和T 細胞介導的免疫反應〔3〕。近年研究發(fā)現(xiàn)機體T 細胞前體Th0能分化產(chǎn)生一種新型的17型輔助性T細胞，它不同于1型和2型T細胞，有獨特的分化和發(fā)育調節(jié)機制，能產(chǎn)生特異性的效應因子白細胞介素(IL)-17，IL-17能強大招募中性粒細胞，促進多種細胞分泌釋放炎性因子，放大炎癥反應，參與多種免疫性炎癥疾病的病理過程〔4〕。本實驗探討IL-17在卵清蛋白(OVA)致敏的大鼠AC發(fā)病中的可能作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組由佳木斯大學實驗動物中心提供的SPF級，鼠齡6～8 w，Brown Norway大鼠30只，體重150～200 g，按隨機數(shù)字法分為對照組(NC組)10只，AC組20只。

1.2主要試劑及儀器OVA、Al(OH)3(美國Sigma公司)，Giemsa染色試劑(北京索萊寶科技有限公司)，臺吩藍(上海生工生物工程股份有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，大鼠變應原特異性IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、干擾素(IFN)-γ試劑盒(美國RD公司)，全自動酶標儀(Rayto RT-6000)。

1.3AC大鼠模型的制作AC組于實驗第1天給OVA 100 μg和佐劑Al(OH)35 mg磷酸鹽緩沖液(PBS)0.2 ml左后足底部注射，第7天給同樣OVA PBS液100 μg/0.2 ml腹腔注射。第14、16天給OVA PBS液(每眼750 μg/5 μl)點眼激發(fā)。NC組給予等量的PBS液，給藥時間和途徑同實驗組。

1.4眼部臨床評估在結膜囊OVA末次致敏后20 min，雙盲法裂隙燈顯微鏡觀察眼部體佂(均觀察右眼)。根據(jù)Magone等〔5〕的標準評分。評分四項指標為：結膜水腫、結膜充血、眼瞼充血水腫、流淚，分別計0～3分。結膜水腫評分標準：輕度局限結膜水腫1分；彌散水腫、穹隆部受累2分；結膜水腫致結膜嚢淺窄3分。結膜充血評分標準：輕度的彌散血管充血1分；彌散充血近穹隆部明顯2分；充血伴結膜下出血3分。眼瞼充血水腫評分標準：輕度眼瞼充血水腫1分；眼瞼彌散充血水腫瞼裂變小2分；眼瞼嚴重充血水腫、眼開困難3分。流淚評分標準：淚阜部淚液積存1分；淚液溢出瞼緣2分；流淚不止3分。最后將4項指標各自積分相加得出總分。

1.5眼部病理學檢測末次激發(fā)24 h斷髓法處死大鼠，摘取眼球及上、下眼瞼10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，矢狀位4 μm連續(xù)切片，Giemsa染色，觀察大鼠眼結膜病理變化。計數(shù)穹隆部結膜每高倍鏡下嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)。

1.6脾細胞培養(yǎng)摘取眼球及瞼結膜后，無菌條件下取出大鼠脾臟，經(jīng)100目鋼網(wǎng)研磨過濾成單個細胞，用RPMI1640培養(yǎng)基(含100 mg/L小牛血清、100 mg/L青霉素及100 mg/L鏈霉素)重懸脾細胞。用8.3 g/L NH4Cl紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心，收集細胞沉淀。用RPMI1640培養(yǎng)基重懸脾細胞，制成均質脾細胞懸液。取少量細胞懸液作臺盼藍染色，鑒定活細胞數(shù)(高于98%可用)。將脾細胞懸液調整到細胞數(shù)2×106ml-1。取脾細胞懸液100 μl加到無菌平底96孔板中，加入OVA至終濃度為100 μg/ml，并設立陰性對照，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。收集培養(yǎng)上清液。

1.7細胞因子的測定分離大鼠脾臟同時，腹主動脈取血，分離血清。應用ELISA測定大鼠血清和脾細胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ含量。

1.8統(tǒng)計學方法采用SSPS19.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗、Pearson相關分析。

2　結　果

2.1大鼠眼部結膜炎癥的臨床評估在末次激發(fā)后20 min，裂隙燈顯微鏡觀察，NC組眼部無明顯異常改變，Magone炎癥評分(0.79±0.14)分；AC組明顯有眼部過敏癥狀，包括不同程度

的眼結膜水腫、充血，眼瞼充血水腫、流淚，炎癥評分(7.64±1.26)分，兩組有明顯差異(P<0.01)。提示AC組出現(xiàn)明顯的急性期變態(tài)反應性炎癥改變。

2.2眼部病理變化NC組眼結膜無明顯充血水腫，固有層沒有或偶見粒細胞浸潤，穹隆部眼結膜每高倍鏡下嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)(17.36±6.02)個；AC組結膜組織疏松，充血水腫明顯，固有層內嗜酸性粒細胞及中性粒細胞浸潤，肥大細胞增加，并有脫顆?，F(xiàn)象，結膜嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)(78.27±15.96)個，兩組差異顯著(P<0.05)。見圖1。

2.3大鼠血清、脾細胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ水平與NC組比較，AC組血清、脾細胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10水平明顯升高(均P<0.01)，IFN-γ水平明顯降低(P<0.01)。見表1。

圖1　兩組病理切片(Gimesa染色，×400)

組別n血清IL-17IL-4IL-6LL-10IFN-γ培養(yǎng)上清液IL-17IL-4IL-6LL-10IFN-γNC組1020.98±2.1888.76±6.3271.81±6.9482.28±9.4835.02±5.652.59±0.066.12±1.134.91±0.485.66±1.0223.45±3.87AC組2054.64±3.071)128.16±10.641)105.69±9.711)121.44±11.521)11.36±1.981)17.68±2.561)54.62±4.371)54.62±4.371)62.92±5.891)7.96±1.011)

與NC組比較：1)P<0.01，下表同

2.4大鼠血清IL-4/IFN-γ、IL-6/IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值AC組血清IL-4/IFN-γ、IL-6/IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值較NC組明顯升高(均P<0.01)。見表2。

表2　兩組血清IL-4/IFN-γ、IL-6/IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值比較

2.5AC組血清IL-17與其他指標的相關性AC組血清IL-17水平與眼部炎癥評分呈明顯正相關(r=0.914,P<0.01)。AC組血清IL-17水平與眼結膜嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)呈明顯正相關(r=0.956,P<0.01)。

3　討　論

AC是眼結膜對外界致敏原發(fā)生速發(fā)型變態(tài)反應性疾病，T細胞是介導免疫應答的主要細胞。近年研究發(fā)現(xiàn)除輔助性T細胞1(Th1)和輔助性T細胞2(Th2)，在輔助性T細胞中還存在一類新的CD4+T細胞亞群，因其分泌的細胞因子以IL-17為主，因此被命名為Th17〔6〕。IL-17于1993年首次由Rouvier從激活的T細胞雜交瘤中克隆出，其結構獨特，與目前已知的其他IL蛋白結構無相似性。近年來越來越多的研究證實Th17產(chǎn)生的IL-17參與許多變應性疾病，如過敏性哮喘、過敏性鼻炎的免疫炎癥反應病理過程。在小鼠哮喘模型中Th17能上調Th2介導的嗜酸性粒細胞性氣道炎癥反應〔7〕。IL-17通過活化細胞外信號調節(jié)激酶P38促分裂原活化蛋白激酶和核轉錄因子-κb等信號激酶調節(jié)嗜酸性粒細胞功能，放大炎癥反應〔8〕。IL-17介導哮喘氣道中中性粒細胞的浸潤，許多研究證明中性粒細胞浸潤在哮喘發(fā)病中發(fā)揮十分重要作用〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)變應性鼻炎患者鼻腔分泌物中IL-17水平較健康人明顯升高〔10〕。變應性鼻炎患者外周血Th17細胞數(shù)量增加，血清 IL-17水平與患者臨床癥狀的嚴重程度呈正相關，IL-17參與了過敏性鼻炎的炎癥反應〔11〕。

本研究提示IL-17水平升高參與了大鼠AC發(fā)病的病理生理過程。IL-17作為前炎癥因子能誘導上皮細胞、成纖維細胞釋放IL-6、IL-8、粒-巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞炎癥蛋白-2和生長相關蛋白-α等炎癥因子和趨化因子，刺激炎癥反應，對T細胞活化起協(xié)同作用〔12〕。IL-17通過誘導IL-8和活化肥大細胞介導中性粒細胞浸潤，促進嗜酸性粒細胞和中性粒細胞參與AC病理過程〔13〕。

Th1和Th2也通過產(chǎn)生不同的細胞因子介導免疫應答。Th1 產(chǎn)生IL-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α參與細胞免疫，Th2產(chǎn)生IL-4、IL-6、IL-10參與體液免疫。IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ分別為Th2和Th1細胞產(chǎn)生的特征性細胞因子。這兩組細胞因子的水平分別代表Th2和Th1細胞的功能狀態(tài)〔14〕。本研究結果表明AC大鼠Th2型細胞因子增多，Th1型細胞因子減少。AC大鼠表現(xiàn)為Th2型優(yōu)勢表達，Th2/Th1比例升高，免疫狀態(tài)由Th1向Th2“克隆漂移”。Th2型細胞因子IL-4、IL-6、IL-10參與了AC發(fā)病的病理生理過程〔15〕。IL-4通過調節(jié)Ig重鏈基因類型的轉換使B細胞由產(chǎn)生IgM轉換成產(chǎn)生IgE，IL-4不僅促進B細胞表達分泌IgE還促進嗜酸性粒細胞的趨化〔16〕。IL-6能激活嗜酸性粒細胞，誘導嗜酸性粒細胞的分化和募集。IgE和嗜酸性粒細胞共同介導了大鼠AC的免疫病理過程。小鼠實驗證明，在轉化生長因子-β的協(xié)同作用下，IL-6可以誘導Th17分化，產(chǎn)生轉移因子孤獨受體γδ，促進Th17產(chǎn)生IL-17〔17〕。另有實驗證明，應用IL-6中和抗體可阻斷Th17細胞分化，抑制Th17介導的實驗性自身免疫性腦炎的發(fā)生〔18〕。IL-6可促進Th17分泌IL-17。有研究證明，IL-4與IL-17可以共同促進IgE的合成分泌〔19〕。IL-17、Th17與Th2/Th1細胞比值變化相互作用、相互影響共同參與了大鼠AC的免疫學發(fā)病機制。恢復Th2/Th1失衡、抑制Th17免疫應答，減少IL-17產(chǎn)生或拮抗其生物活性可能成為AC治療的一條新途徑。

1Fukushima A,Ozaki A,Jian Z,etal.Dissection of antigen-specific humoral and cellular immune-mediated blepharoconjnctivitis in C57BL/6 mice〔J〕.Curr Eye Res,2005;30(2):241-8.

2李瑩，張瀟，袁進，等.過敏性結膜炎的流行病學及奧洛他定滴眼液開放性多中心治療的初步效果〔J〕.眼科，2008;13(3):166-70.

3Croneberg DA,Bielorg L,Fischer A,etal.Animal models of allergic and inflammatory conjunctivitis〔J〕.Allergy,2003;58(11):1101-13.

4Albonesi C,Cavani A,Giromoni G.IL-17 is produced by nickel-specific T lymphocytes and regulates ICAM-1 expression and chemokine production in human ker at inocytes:synergistic or antagonist effects with IFN-gamma and TNF-alpha〔J〕.J Immunol,1999;162(1):494-502.

5Magone MT,Chan CC,Rizzo LV,etal.A novel murine model of allergic conjunctivitis〔J〕.Clin Immunol Immunopathol,1998;87(1):75-84.

6Bi Y,Lin G,Yan R.Reciprocal modulation between Th17 and other helper T cell lineages〔J〕.J Cell Physiol,2011;226(1):8-13.

7Wakashin H,Himse K,Maezawa Y,etal.IL-23 and Th17 cells enhance Th2-cell-midiated eosinophilic airway inflammation in mice〔J〕.Am J Respir Crit Care Med,2008;178(5):1023-32.

8Cheung PF,Wong CK,Lam CW.Molecular mechanisms of cytokine and chemokine release from eosinophils activated by IL-17A,IL-17F,and IL-23:implication for Th17 lymophocytes-mediated allergic inflammation〔J〕.J Immunol,2008;180(6):5625-35.

9Bullens DM,Truyen E,Coteur L,etal.IL-17 mRNA in sputum of asthmatic patients:linking T cell driven inflammation and granulocytic influx〔J〕.Respir Res,2006;7(1):135-41.

10Klemens C,Rasp G,Jund F,etal.Mediators and cytokines in allergic and viral triggered rhinitis〔J〕.Allerg Asthma Proc,2007;28(2):434-41.

11Cipandi G,Filaci G,Batlaglia F,etal.Peripheral Th17 cells in allergic rhinitis:new evidence〔J〕.Int Immunopharmacol,2010;10(1):226-9.

12Romagnani S.Regulation of the T cell response〔J〕.Clin Exp Allergy,2006;36(6):1357-66.

13Galatowicz G,Ajayi Y,Sern ME,etal.Ocular antiallergic compounds selecting inhibit human mast cell cytokines into vitro and conjunctival cell infltration in vivo〔J〕.Clin Exp Allergy,2009;161(6):1301-6.

14Fang SP,Tanaka T,Tago F,etal.Immunomodulatory effects of gyokuheifusan on IFN-gamma/IL-4(Th1/Th2)ballance in ovalbumin(OVA)-induced asthma model mice〔J〕.Biol Pharm Bull,2005;28(40):829-33.

15leonardi A,Motterle L,Brotolotti M.Allergy and eye〔J〕.Clin Exp Immunnol,2008;153(1):17-21.

16Kips JC,Tournoy KG,Pauwels RA,etal.New anti-asthma therapies:suppression of the effect of interleukin(IL)-4 and IL-5〔J〕.Eur Respir J,2001;17(3):499-506.

17楊靜，賈磊，李麗，等.抗原特異性Th-17細胞的分化與調節(jié)〔J〕.細胞與免疫學雜志，2008;24(3)：213-6.

18Annunziato F,Romagnaaani S.The transient nature of the Th17 phenotype〔J〕.Eur J Immunol,2010;40(12):3312-6.

19吳革平，章如新，溫武，等.地塞米松對實驗性鼻炎動物血清IgE、IL-4和IL-17含量影響的實驗研究〔J〕.中國中西醫(yī)結合耳鼻喉科雜志，2006;14(2)：69-72.

〔2015-01-11修回〕

(編輯苑云杰)

黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目(No.2013248);佳木斯大學青年基金項目(No.Sq2014-006)

劉宏偉(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事眼表疾病、白內障疾病研究。

張劍(1977-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事眼表疾病、白內障疾病研究。

R777.31

A

1005-9202(2016)15-3623-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.006