尤笑迎　楊紅梅

(鄭州人民醫(yī)院骨科,河南　鄭州　450003)

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降鈣素對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用及機(jī)制

尤笑迎楊紅梅1

(鄭州人民醫(yī)院骨科,河南鄭州450003)

目的探討降鈣素(CT)對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用及機(jī)制。方法36只健康大耳白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、CT治療組(CT組)和生理鹽水處理組(NS組),CT組和NS組采用改良Hulth法制備KOA模型，sham組以同樣術(shù)式進(jìn)入關(guān)節(jié)腔但不做其他處理。術(shù)后第6周開(kāi)始CT組每天皮下注射CT 5 U/kg，sham組和NS組給與等量生理鹽水皮下注射，連續(xù)4 w。觀察KOA發(fā)病過(guò)程軟骨形態(tài)變化、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)血清和關(guān)節(jié)液白細(xì)胞介素(IL)-1β、免疫組化法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1的變化、TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果NS組關(guān)節(jié)軟骨損傷嚴(yán)重，Mankin評(píng)分明顯高于sham組，血清及關(guān)節(jié)液IL-1β含量明顯升高(P<0.05)，關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原含量明顯降低，MMP-1活性和軟骨細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)明顯升高(P<0.05)；而CT治療組關(guān)節(jié)軟骨損傷較NS組減輕、IL-1含量、MMP-1活性和軟骨細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.05)，Ⅱ型膠原含量明顯升高。結(jié)論CT可能通過(guò)抑制IL-1β分泌，恢復(fù)軟骨基質(zhì)的合成與降解平衡，減少軟骨細(xì)胞凋亡，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有一定的保護(hù)作用，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨退變過(guò)程。

膝骨性關(guān)節(jié)炎；白細(xì)胞介素-1；降鈣素；細(xì)胞凋亡

骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是臨床常見(jiàn)的退行性關(guān)節(jié)疾病,多發(fā)生于負(fù)重大、活動(dòng)多的關(guān)節(jié),以膝關(guān)節(jié)最常受累。 據(jù)世界衛(wèi)生組織的調(diào)查〔1〕，OA發(fā)病人口已達(dá)10%左右，其發(fā)病率和年齡呈現(xiàn)正相關(guān)，年齡≥60歲時(shí)發(fā)病率50%左右，而≥75歲發(fā)病率可達(dá)80%，是導(dǎo)致中老年患者關(guān)節(jié)疼痛和致殘的首要原因〔2〕,目前認(rèn)為OA 的發(fā)生發(fā)展是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，包括遺傳傾向、年齡、炎性細(xì)胞因子、自由基、性激素、創(chuàng)傷、軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡等，其中炎性細(xì)胞因子特別是白細(xì)胞介素(IL)-1β〔3〕和軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡〔4〕與老年 OA的關(guān)系密切。OA缺乏早期有效的治療手段，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，因此，目前迫切需求明確OA 的發(fā)病機(jī)制，從而有效預(yù)防和降低OA 的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，降鈣素(CT)可通過(guò)與破骨細(xì)胞表面的CT受體結(jié)合抑制骨吸收，同時(shí)還可直接作用于軟骨細(xì)胞促進(jìn)骨小梁組織及骨基質(zhì)成分合成，而延緩OA的病理進(jìn)程〔5,6〕。本研究旨在觀察CT對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)模型關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用，同時(shí)檢測(cè)OA發(fā)生過(guò)程中IL-1β的表達(dá)及軟骨細(xì)胞的凋亡情況，探討其可能的作用機(jī)制。

1　材料和方法

1.1材料36只大耳白兔(普通級(jí)，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，4～6月齡，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，雌雄不限。鮭魚(yú)CT注射液為北京諾華制藥有限公司產(chǎn)品。Ⅱ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1免疫組化試劑盒，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)及TUNEL檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自武漢博士德生物制劑有限公司和上海銳聰科技發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組36只大耳白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、CT治療組(CT組)和生理鹽水處理組(NS組)，每組12只。CT組和NS組采用改良Hulth法〔7〕制備KOA模型，sham組以同樣術(shù)式切開(kāi)關(guān)節(jié)腔但不做其他處理。

1.2.2術(shù)后處理術(shù)后分籠飼養(yǎng)，每日肌肉注射青霉素20 萬(wàn)U，連續(xù)1 w以預(yù)防感染。1 w后每天強(qiáng)迫活動(dòng)1 h，連續(xù)4 w。術(shù)后第6周CT組行降鈣素5 U/kg每天皮下注射，連續(xù)4 w，sham組和NS組給予等量生理鹽水皮下注射。

1.2.3標(biāo)本采集及處理9 w后經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死動(dòng)物，1 ml生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)液；同時(shí)心臟取血5 ml，37.0℃水浴45 min。關(guān)節(jié)液及血樣本3 000 r/min離心30 min，取上清液，-20℃保存，待檢。

1.2.4IL-1β含量檢測(cè)采用ELISA雙抗夾心法檢測(cè)血清、關(guān)節(jié)滑液中的IL-1β含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，酶標(biāo)儀L450 nm處測(cè)OD值。

1.2.5關(guān)節(jié)軟骨病理變化觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，觀察術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊、滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)液情況，同時(shí)取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨，固定、脫鈣、包埋、切片，用于HE和免疫組織化學(xué)染色。軟骨組織形態(tài)變化參照Mankin改良的關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔8〕進(jìn)行積分統(tǒng)計(jì)。

1.2.6軟骨組織Ⅱ型膠原、MMP-1蛋白表達(dá)情況檢測(cè)Ⅱ型膠原、MMP-1蛋白檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)(同濟(jì)千屏)測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值，取每張切片均值作為測(cè)量值。

1.2.7軟骨細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)采用TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞的凋亡情況，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

2　結(jié)　果

2.1大體觀察術(shù)后3～5 d膝關(guān)節(jié)腫脹較明顯，后肢力量減低，活動(dòng)減少，1 w后逐漸好轉(zhuǎn)，sham組可自由活動(dòng)，CT和NS組動(dòng)物膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，有異?；顒?dòng)，9 w內(nèi)膝關(guān)節(jié)感染2只，被淘汰，列入觀察的共34只，sham組11只，NS組11只，CT組12只。sham組滑膜無(wú)明顯增生，關(guān)節(jié)液清亮透明，關(guān)節(jié)面平整光滑，呈藍(lán)白色；NS組滑膜出現(xiàn)不同程度的增生粘連，關(guān)節(jié)液混濁呈泡沫狀，關(guān)節(jié)面粗糙，呈灰黃色；CT組可見(jiàn)滑膜輕度增生，關(guān)節(jié)液略增多，關(guān)節(jié)面色澤變淡，光澤度降低。見(jiàn)圖1。

2.2軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察正常關(guān)節(jié)軟骨分為表淺層、移行層、放射層和鈣化層。sham組關(guān)節(jié)軟骨面平滑規(guī)整，軟骨細(xì)胞多，排列整齊，基質(zhì)均勻、粉紅色，軟骨細(xì)胞核呈深藍(lán)色，軟骨層次及潮線清晰可辨；NS組軟骨表層變薄，出現(xiàn)裂隙，有軟骨細(xì)胞簇集現(xiàn)象，潮線多不完整或消失；CT組軟骨表面較規(guī)則、裂隙少，軟骨結(jié)構(gòu)可辨，潮線尚完整，見(jiàn)圖2，Mankin評(píng)分見(jiàn)表1。

圖1　各組動(dòng)物左下肢的大體形態(tài)觀察

圖2　各組關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(HE，×200)

2.3血清及關(guān)節(jié)液IL-1β含量sham組血清及關(guān)節(jié)液IL-1β吸光度值明顯低于NS和CT組，而NS組又明顯高于CT組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.4軟骨組織Ⅱ型膠原、MMP-1蛋白表達(dá)情況sham組軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原主要分布于表層和中層，均勻深染，吸光度值高于NS和CT組；NS組Ⅱ型膠原染色淡，表層有脫色現(xiàn)象；CT組軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原染色良好，主要分布于表層及中層，細(xì)胞簇周圍出現(xiàn)深染，吸光度值高于NS組(P<0.05)，見(jiàn)表1 。NS組軟骨全層可見(jiàn)呈棕黃色表達(dá)的MMP-1，sham組僅表層軟骨細(xì)胞內(nèi)偶見(jiàn)MMP-1弱陽(yáng)性表達(dá)，CT組陽(yáng)性表達(dá)介于前二者之間。

表1　各組關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分及Ⅱ型膠原、MMP-1及IL-1吸光值變化

與sham組比較:1)P<0.05；與NS組比較:2)P<0.05

2.5軟骨細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)圖3。NS組軟骨全層可見(jiàn)大量凋亡的軟骨細(xì)胞，細(xì)胞凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為(29.65±2.03)%，sham組偶見(jiàn)凋亡的軟骨細(xì)胞，細(xì)胞凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為(4.12±0.37)%，CT組軟骨細(xì)胞凋亡情況(8.32±1.62)%介于前兩者之間，組間比較差異顯著(P<0.05)。

圖3　各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況(TUNEL法，×200)

3　討　論

OA以軟骨進(jìn)行性退變、軟骨下骨變性、骨贅形成及滑膜炎性改變?yōu)橹饕±硖卣鳌?〕,其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，目前研究認(rèn)為炎性細(xì)胞因子特別是IL-1β和細(xì)胞凋亡在OA的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔3,4,10〕。IL-1是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因素和重要調(diào)節(jié)因子,由巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生,有IL-1α和IL-1β兩種亞型，膝關(guān)節(jié)液中以IL-1β為主,正常情況下滑膜細(xì)胞產(chǎn)生微量的IL-1β，KOA時(shí)滑膜組織和軟骨細(xì)胞可通過(guò)自分泌作用合成大量的IL-lβ，IL-1β反過(guò)來(lái)又可刺激滑膜增生和破壞軟骨組織，形成惡性循環(huán)，IL-1β量與OA嚴(yán)重程度呈正相關(guān)〔11〕。軟骨細(xì)胞膜上分布有IL-1β 的受體，高水平的IL-1β與其受體結(jié)合干擾軟骨細(xì)胞的正常代謝和功能，一方面促進(jìn)MMP-1和MMP-3表達(dá)，加快軟骨基質(zhì)的降解〔12,13〕； 另一方面IL-1β還可通過(guò)兩種方式參與軟骨細(xì)胞凋亡:一是刺激軟骨細(xì)胞和滑膜分泌iN0S和N0，加速關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖和膠原降解、促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，二是通過(guò)激活Fas途徑介導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡〔14,15〕，由于軟骨基質(zhì)的降解及軟骨細(xì)胞的凋亡，引發(fā)軟骨細(xì)胞生活的微環(huán)境惡化,從而影響軟骨細(xì)胞的合成功能，使Ⅱ型膠原合成減少，加重軟骨基質(zhì)合成與降解的紊亂，加上軟骨細(xì)胞凋亡的增加，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞，促發(fā)OA的發(fā)生發(fā)展。

Hulth法通過(guò)切斷前交叉韌帶和副韌帶，減弱了關(guān)節(jié)周圍肌肉和韌帶的保護(hù)作用，造成關(guān)節(jié)不穩(wěn)定、關(guān)節(jié)面摩擦增加，部分半月板的切除使脛股關(guān)節(jié)應(yīng)力改變，最終關(guān)節(jié)軟骨退變而導(dǎo)致的發(fā)生。本研究說(shuō)明，KOA動(dòng)物模型復(fù)制成功，且在KOA發(fā)病過(guò)程中IL-1的失衡、MMP-1的釋放、Ⅱ型膠原的降解以及軟骨細(xì)胞的凋亡發(fā)揮了重要作用。

CT是一種抗骨吸收劑,通過(guò)與破骨細(xì)胞上的降鈣素受體結(jié)合,抑制破骨細(xì)胞功能而用于治療骨質(zhì)疏松〔6,16〕,目前有研究表明關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上也有功能性CT受體，CT可使cAMP 表達(dá)增加,促進(jìn)膠原蛋白和蛋白多糖表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)軟骨的作用〔17〕。本研究表明CT可能通過(guò)抑制IL-1β分泌，恢復(fù)軟骨基質(zhì)的合成與降解平衡，減少軟骨細(xì)胞凋亡，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有一定的保護(hù)作用，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變過(guò)程。

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〔2014-12-31修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

鄭州市科技發(fā)展計(jì)劃(2007-15-44)

楊紅梅(1969-)，女，教授，碩士，主要從事骨關(guān)節(jié)疾病的病理生理學(xué)研究。

尤笑迎(1969-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，主任醫(yī)師，主要從事骨關(guān)節(jié)疾病的診治研究。

R684.3

A

1005-9202(2016)15-3648-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.017

1河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校